Abstract

Fundo e visa

GLI1 é o fator de transcrição chave na via de sinalização Hedgehog em câncer pancreático. RegIV está associada com a regeneração, e o crescimento celular, sobrevivência, adesão e resistência à apoptose. Nosso objetivo foi estudar a expressão RegIV no câncer de pâncreas e sua relação com GLI1.

Métodos

GLI1 e expressão RegIV foram avaliadas em tecido tumoral e tecidos normais adjacentes de pacientes com câncer pancreático e 5 de células de câncer de pâncreas linhas por qRT-PCR, Western blot e imunohistoquímica (IHC), ea correlação entre eles. O vector lentiviral GLI1-shRNA foi construído e transfectado para PANC-1, e um vector lentiviral contendo a sequência de expressão GLI1 foi construído e transfectado para BxPC-3. GLI1 e expressão RegIV foram avaliados por qRT-PCR e transferência de Western. Finalmente demonstramos RegIV a ser alvo de GLI1 por cromatina imunoprecipitação (CHIP) e ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA).

Resultados

Os resultados de IHQ e qRT-PCR mostrou que RegIV e GLI1 expressão foi maior em tecidos de cancro do pâncreas em comparação com tecidos normais adjacentes (p 0,001). expressão RegIV correlacionada com a expressão GLI1 nestes tecidos (r = 0,795, P 0,0001). Estes resultados foram verificados para a proteína (R = 0,939, p = 0,018) e a expressão de ARNm (R = 0,959, p = 0,011) em 5 linhagens de células do cancro do pâncreas. mRNA RegIV e expressão da proteína foi reduzida (94,7 ± 0,3%, 84,1 ± 0,5%; respectivamente) quando GLI1 foi derrubado (82,1 ± 3,2%, 76,7 ± 2,2%; respectivamente) pela técnica de RNAi. superexpressão GLI1 em mRNA e nível de proteína (924,5 ± 5,3%, 362,1 ± 3,5%; respectivamente) induzida superexpressão RegIV (729,1 ± 4,3%, 339,0 ± 3,7%; respectivamente). Além disso, ensaios chip e EMSA mostrou proteína GLI1 obrigado a regiões promotoras RegIV (GATCATCCA) em células de câncer de pâncreas.

Conclusão

GLI1 promove RegIV transcrição pela ligação ao promotor do gene RegIV em câncer pancreático.

Citation: Wang F, Xu L, Guo C, Ke A, ​​Hu G, Xu X, et al. (2011) Identificação de RegIV como um alvo novo gene GLI1 em Câncer pancreático humano. PLoS ONE 6 (4): e18434. doi: 10.1371 /journal.pone.0018434

editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de outubro de 2010; Aceito: 04 de março de 2011; Publicação: 11 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Science Foundation Natural da China (No. 81.072.065), Fundação para a Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai (No. 09JC1412200, No. 09410705400), e do Fundo de Doutorado do Ministério da Educação da China (No. 20090072110022). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas (PC) é a quarta causa relacionada com o cancro mais comum de mortalidade no mundo ocidental [1] – [3] e tem um prognóstico sombrio apesar dos progressos consideráveis ​​na gestão. A sobrevivência média de PC é inferior a 6 meses; a taxa de sobrevivência de 5 anos é inferior a 5% [1], [2]. Mais de 80% apresentam doença irressecável; um terço têm a doença local, enquanto o restante tem metástases à distância. Pesquisas realizadas durante as duas últimas décadas tem mostrado que PC é uma doença genética, fundamentalmente, causada por herdados da linha germinativa e adquiridas mutações somáticas em genes associados ao câncer. modelo de progressão do tumor para PC em que o epitélio ductal pancreático progride do normal para o aumento graus de neoplasia intra-epitelial pancreáticas (PanINs) para câncer invasivo. Várias alterações nos genes que são importantes na progressão de PC, foram identificados, por exemplo, K-ras, INK4A, p53, e SMAD4 /DPC4 [4], [5]. PC é caracterizada por mutações quase universal em K-ras e desregulamentação frequente de vias de sinalização embrionárias cruciais, incluindo the Hedgehog (HH) via de sinalização [6], [7]. Uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de PC pode ajudar a melhorar o diagnóstico precoce e potencialmente identificar alvos terapêuticos moleculares.

O ouriço (HH) via de sinalização foi identificado pela primeira vez no desenvolvimento embrionário de Drosophila [8] e tem sido mostrado para ser crucial para o crescimento e padronização no pâncreas durante o desenvolvimento embrionário. sinalização de Hh regula a diferenciação celular e a formação de órgãos durante o desenvolvimento embrionário, e é expressa em células epiteliais pancreáticas [9], [10]. a activação constitutiva do sinal HH é detectado numa variedade de cancros humanos, incluindo cancro do pâncreas [9] – [13]. Dada a sua misexpression em ambas as linhas de células de cancro pancreático metastático e em lesões percursoras (PanIN) [14], a ativação do sinal HH pode estar envolvido na tumorigénese tanto pancreático precoce e tardia.

Dos três ligandos de mamífero da família HH , sonic (SHH), Desert (DHH) e da Índia (IHH) Hedgehog [15], o primeiro tem sido associada com a organogênese de pâncreas e câncer pancreático. sinais de HH são transmitidos e modificado por duas proteínas transmembranares, remendado (PTCH) e smoothened (SMO), e por fatores de transcrição a jusante que são membros da família oncogene associado a glioma (GLI) (GLI1, 2 e 3). Gli2 e Gli3 têm domínios de transactivação e repressores, enquanto que as funções prováveis ​​GLI1 apenas como um transactivador de transcrição e de destino da via de HH-se [16] – [19]. A família de regeneração do gene (REG), um grupo de pequenas proteínas de secreção, está envolvida na proliferação celular ou diferenciação de órgãos digestivos [20], é regulada positivamente em vários cancros gastrointestinais, e funciona como trófico ou factores anti-apoptóticos [21] – [23] . RegIV, um membro da família de genes de regeneração, está envolvido em doenças malignas digestivas do tracto, incluindo o estômago [24], colorectum [25], [26], e pâncreas [27], [28], bem como nas doenças benignas tais como colite ulcerativa [29]. RegIV sobreexpressão em células tumorais tem sido associada com o crescimento celular, sobrevivência, adesão, e resistência à apoptose. Recentemente, foi relatada sobre-expressão RegIV para ser associado com a iniciação e progressão de cancro do pâncreas, e foi sugerida como um marcador tumoral promissora para ecrã do PC fase precoce e alvo para terapia adjuvante em PC [28], [30].

as funções de GLI1 e RegIV pareceu ser semelhante em nossa revisão da literatura; assim, foi investigada a expressão e correlação de GLI1 e RegIV em tecidos e linhas celulares de PC. Também explorou o possível mecanismo entre GLI1 e RegIV, usando ensaios de chip e EMSA.

Materiais e Métodos

linhas de células e tecidos

linhas celulares de cancro pancreático humano, PANC -1, AsPC-1, BxPC-3, Capan-2 e SW1990, foram adquiridos da Academia chinesa de Ciências banco de células Comité Type Culture Collection. PANC-1 foi cultivada em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (Gibco BRL, EUA), os outros tipos de células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco BRL, EUA), e todos os meios foram suplementados com 10% de FBS (Gibco BRL, EUA), penicilina G (100 U /ml), estreptomicina (100 ug /ml). As células foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO2. Doze pares de PC e tecidos do pâncreas não cancerosos correspondentes foram obtidos a partir de Xangai Décimo Hospital Popular com o consentimento ético completa por escrito. Nenhum destes doentes tinham recebido quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia do câncer. Outros 9 fatias tecidos emparelhados foi obtido a partir do departamento de patologia do Hospital Shanghai Décima Popular. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Tongji University School of Medicine and Life Sciences.

Curto Hairpin RNA (shRNA) Projeto e Produção Vector

sequências interferentes correspondentes a regiões distintas de GLI1mRNA, como bem como controlo negativo sem homologia para genes humanos ou de rato foram concebidos por Shanghai GeneChem Biotech (Tabela 1). Três ARNic em cadeia dupla foram rastreados para GLI1 knock-down por análise de Western blot, em experiências de co-transfecção com o plasmídeo de expressão em células HEK GLI1 293T. A sequência mais bem sucedida e uma sequência não-silenciamento de luciferase foram concebidos para um oligonucleótido molde shRNA consistindo de sentido, em gancho, anti-sentido, sequências de terminação, os quais foram flanqueadas por locais de enzimas de restrição para facilitar a clonagem direccional de sub-. Os vectores resultantes codificados GFP sob o controlo transcricional do promotor EF1 e um promotor H1 a montante de locais de clonagem de restrição (

Mlu I e

Cla

i) para permitir a introdução de oligonucleótidos que codificam shRNAs. De qualquer shRNA contra GLI1 ou um shRNA nonsilencing-luciferase foi localizado sob o promotor H1 (Figura 1). A inserção correcta do shRNA específica foi ainda confirmada por sequenciação directa de ADN.

para o vector GLI1-shRNA, dois ADN de cadeia simples que codificam dois ligadores, as sequências alvo e um elemento de circuito, foram sintetizados. Estes foram emparelhadas com ADN de cadeia dupla, e ligado ao pLVTHM seguinte

Mlu

I e

Cal

I digestão. A forma de gancho de cabelo curto de shGLI1 é expresso sob o controlo do promotor H1 humano. O vector também contém um promotor de EF1-α humano dirigindo o gene marcador GFP para rastrear as células transduzidas. Os vectores foram geradas por transfecção transitória de PRSV-REV, pMDlg-pRRE, pMD2G, e o shRNA codifica pLVTHM em células 293T. Abreviaturas: RRE, Rev elemento de resposta; cPPT, tracto polipurino central; EF1-α, o factor de alongamento humano 1 promotor-α; H1, o promotor H1 humano; GFP, proteína fluorescente verde; PRE, o vírus da hepatite humana elemento regulador pós-transcricional.

Para a produção do vector lentiviral, as células 293T HEK foram cultivadas até 30-40% de confluência no dia seguinte. No dia seguinte, o meio foi substituído com DMEM /FBS a 10% sem antibióticos. Posteriormente, 20 ug de shRNA plasmídeo de DNA (um absurdo shRNA ou GLI1 segmentação shRNA; GeneChem Biotech, Xangai, China), 7,5 ug pMD2G, 10 pg PRSV-Rev, e 15 ug pMDLg-pRRE foram misturados com estéril DDH

2O para um volume final de 1800 uL, em seguida, misturados com 200 ul de 2,5 M CaCl

2. A mistura de ADN foi oxigenado e 2000 ul de 2 x PBS (pH 7,05) adicionada em gotas, e incubou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistura de transfecção foi adicionado às suas respectivas placas e incubadas durante a noite. O meio foi substituído após 12 horas com DMEM suplementado com FBS a 10%. Após 48 horas, o meio condicionado contendo shRNA lentivírus foi recolhido e filtrado através de filtros de acetato de celulose de tamanho de poro de 0,45 mm, e armazenado em gelo. O vírus foi concentrado por centrifugação a 70.000 G durante 2 horas e ressuspensas com 500 ul de PBS. A título de unidade de transdução (TU) foi avaliada em células HEK 293T, na presença de polibreno 8 ug /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Títulos de 2-5 × 10

8 TU /ml eram rotineiramente alcançado.

A superexpressão-GLI1 Lentivirus Vector Construção

cDNA GLI1 humano foi comprado de Open-Biosystem (EUA). A sequência de cDNA completa de GLI1 foi gerado por PCR usando o iniciador de sentido directo, 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTTCAACTCGATGACCCCAC-3 ‘; e iniciador inverso, 5’-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGGCACTAGAGTTGAGGA-3 ‘; em seguida, inserido num PGC-FU-EGFP-3FLAG Vector (GeneChem Company, Xangai, China). Os transformantes foram analisados ​​através de sequenciação. O fragmento de 3320 pb resultante foi confirmada por sequenciação (Figura S1) e em comparação com a sequência da região a expressão do gene no GenBank GLI1 (NM_005269.2). Para produzir estoque lentiviral, 293FT células foram cultivadas até 70-85% de confluência no dia seguinte. O meio de cultura completo foi removido. As células foram então expostas a 5 ml de meio (Opti-MEM; Invitrogen) com complexos contendo construção de empacotamento auxiliar (GeneChem Companhia, Xangai, China), de DNA plasmídeo de expressão de 20 ug (PGC-FU-EGFP-3FLAG-GLI1), ou plasmídeo de controlo ADN (PGC-FU-EGFP-3FLAG) com 100 uL de lipofectamina 2000 (Invitrogen, EUA) na presença de polibreno (8 mg /mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Após incubação durante 24 horas, o meio de infecção foi substituído com meio de cultura completo. Os sobrenadantes contendo lentivírus foram colhidas 72 horas após a transfecção. Os sobrenadantes foram centrifugados para remover detritos sedimento e armazenado a -80 ° C. Títulos de 2-5 × 10

7 TU /ml eram rotineiramente alcançado.

Lentivirus transfecção

Células (1 × 10

5) em uma placa de seis poços foram transfectadas com o vector lentiviral a uma multiplicidade de infecção (MOI) = 5 (PANC-1) ou 20 (BxPC-3) na presença de 8 ug /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Após 72 horas da transfecção, o meio foi substituído com 2 ml de meio de cultura completo. 48 horas após a transfecção, a expressão GLI1 foi estabelecida por análise de mancha de Real-Time PCR e Western.

citometria de fluxo

As células foram ajustadas a 1 x 10

6 células /100 uL e utilizados por citometria de fluxo. Um total de 10.000 eventos foram analisados ​​para determinar a eficiência de transfecção utilizando FACS Calibur (Becton Dickinson, EUA) o software Cell-Quest.

qRT-PCR

em tempo real quantitativa de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase análise (qRT-PCR) foi realizada com o Sistema de prisma 7900HT sequência de detecção ABI (Applied Biosystems, CA, EUA). GLI1 e expressão de mRNA foi analisada por RegIV qRT-PCR utilizando SYBR Green Dye. β-actina foi utilizado como o gene de manutenção. expressão do gene alvo foi normalizada para p-actina e analisados ​​pelo 2

-ΔΔCT

fórmula. As sequências dos iniciadores são os seguintes: GLI1, frente: TTCCTACCAGAGTCCCAAGT, inverta: CCCTATGTGAAGCCCTATTT, RegIV, frente: CGCTGAGATGAACCCCAAG, inverta: TGAGAGGGAAGTGGGAAGAG. β-actina, frente: AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA, inverta: CTGGAACGGTGAAGGTGACA. Todas as reacções foram realizadas pelo menos três vezes.

análise Western blot

As células foram lavadas duas vezes em PBS, em seguida lisadas durante 2 horas em tampão de lise RIPA em gelo e centrifugado a 12000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. A concentração de proteína foi determinada pelo método BCA padrão (BCA ™ Protein Assay Kit, Pierce, EUA). 50 ug de proteína total foi separada por SDS-PAGE utilizando 6% ou 12% de gel de poliacrilamida com Mini-PROTEAN Tetra celular (Bio-Rad, EUA). GLI1 e proteína RegIV em gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 um, com mini celular Transferência e Trans-blot SD semi-seca a transferência de células (Bio-Rad, EUA), respectivamente.

Os imunorreagentes utilizados para a transferência de Western foram anticorpo monoclonal de coelho contra GLI1 (1:200; Santa Cruz, EUA) e anticorpo policlonal de cabra anti-anticorpo RegIV (1:100; Santa Cruz, EUA). Rato anticorpo anti-actina β-policlonal (1:5000; Santa Cruz, EUA) foi utilizado como controlo de carga. Os blots foram desenvolvidos através de um método padrão de quimioluminescência aumentada (ECL) (Pierce, EUA). Todas as experiências foram repetidas várias vezes e deu resultados semelhantes.

A imuno-histoquímica

secções de tumores foram desparafinadas, re-hidratados, e tratou-se com 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) a 95 ° C para recuperar antigénios. Depois de desactivar a actividade peroxidase endógena com H

2O

2 e o bloqueio com soro de cavalo normal a 10%, as secções foram incubadas sequencialmente com os anticorpos primários de cabra anti-RegIV (1:100; Santa Cruz, Califórnia, EUA), de coelho anti-GLI1 (1:200; Santa Cruz, Califórnia, EUA), os anticorpos secundários biotinilados, e o reagente ABC (Gene tech, Xangai, China). A marcação foi visualizado com 3,3-diaminobenzidina (Gene Tech, Xangai, China). As secções foram então contrastadas com hematoxilina. Os controlos negativos foram realizados em cada caso, substituindo o anticorpo primário, com PBS.

cromatina imunoprecipitação (CHIP)

Nós modificamos o protocolo relatado anteriormente [31] para imunoprecipitação da cromatina (CHIP). Em resumo, as células PANC-1 (3 × 10

7) foram reticuladas com formaldeído a 1%. A reacção de fixação foi terminada por adição de 10 ml Glicina (0,125 M), depois da cromatina foi recolhido com um ml de tampão IP contendo cocktail inibidor da protease. Cromatina foi cortado usando um sonicador com uma sonda de ponta 4 milímetros 3 vezes para 10 pulsos segunda (60 W, 80 W e 100 W, respectivamente, de 90 s intervalos) em uma caixa de gelo. A reticulação foi revertido pela adição de 20 ul de NaCl 5 M durante a noite a 65 ° C. O ADN foi extraído utilizando o ensaio de fenol /clorofórmio. 20 uL de ADN foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1,5% e o resto foi preservada a -20 ° C, tal como ADN ENTRADA. cromatina solúvel foi imunoprecipitado com 2 ^ g de anti-GLI1 anticorpo monoclonal de coelho (Santa Cruz, Califórnia, EUA). O IgG de rato 2 jig (Santa Cruz, Califórnia, EUA) foi adicionado como um controlo aleatório, RNA polimerase II, tal como um controlo positivo, e o anticorpo β-actina como um controlo negativo. imunocomplexos DNA-proteína foram eluídas e reverter ligações cruzadas, e o DNA foi extraído com fenol /clorofórmio e precipitado. A presença do domínio do promotor RegIV contendo motivos GLI1 em ADN imunoprecipitado foi identificado por PCR usando os seguintes iniciadores: RegIV-A para o local 1 (118 pb), para a frente: 5′-5-TGGTCCCTTCCAGACTTA-3-3 ‘, reverso: 5 ‘- TCCAGTATAGATGGCAAA -3’. RegIV-B para o local 2 (131 pb), para a frente: 5′-CTAACCCTTTGCCATCTA -3 ‘, reverso: 5′-GACCTGGACACTGAACCTTG-3’. RegIV-C do sítio de 3 (70 pb), para a frente: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ‘, reverso: 5′-GTGTTACATAACGGGTTT-3’. RegIV-D para site4 (70 pb), para a frente: 5′-TGTAACACACTCTGTTGATGTAAGC-3 ‘, reverso: 5’CTATTTGAGCTTCTCCCGCAG-3’. RegIV-E para sites 3 e 4 (226 pb), para a frente: 5′-CTCGGAAGGTTTCTAATC-3 ‘, reverso: 5’TTCAACATGCGTGAGTTT-3’. RegIV-F para sites 3 e 4 (481 pb), para a frente: 5′-CTATGCTGCTCACAAGGA-3 ‘, reverso: 5′-AGACGGCTTCAGAATGTA-3’. RegIV-G para o local 5 (315 pb), para a frente: 5′-TTCCTGAGGCAAGAAGAT-3 ‘, reverso: 5′-CCAAGATTTAACCCAACA-3’. As condições de PCR para a região do promotor RegIV foram: desnaturação de 30 segundos a 94 ° C, emparelhamento 30 s de alongamento, uma hora a 72 ° C. As temperaturas de recozimento para RegIV-A-G foram de 55 ° C, 56 ° C, 56 ° C, 47 ° C, 56 ° C, 56 ° C, e 52 ° C, respectivamente. A amplificação da região do promotor de RegIV foi analisada após 35 ciclos. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA)

Os extractos nucleares foram preparados com NE-PER Citoplasmáticas de extracção Reagentes e Nucleares (Pierce, Rockford, EUA). EMSA e supershift EMSA com sondas marcadas com digoxina foram realizadas utilizando o kit de deslocamento DIG-gel de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Basel, Suiça). As sequências dos oligonucleótidos utilizados foram 5′-AGAACATGGATGATCATGTCA-3 ‘(motivo de ligação sublinhado). Mutant oligonucleótidos utilizados foram 5’-AGAACAAAAAATTTTATGTCA-3 ‘. No estudo supershift, anticorpo monoclonal de coelho contra 5 ug GLI1 foi incubada com 5 ug de extracto nuclear em gelo durante 30 minutos antes da adição da sonda marcada, e ainda incubadas em gelo durante 30 minutos. A reacção de ligação inteiro de 20 ul foi resolvido num gel de poliacrilamida a 7% e transferido para uma membrana de nylon carregada positivamente (Bio-Rad, EUA) em 0,5 × tampão Tris borato-EDTA.

A análise estatística

os dados quantitativos foram expressos como a média ± desvio padrão (SD). Dados em tempo real PCR foi analisado de acordo com as diferenças de expressão do gene alvo por parte do teste t pareado e foram 2

-ΔΔCT

transformado antes da análise. A relação entre a expressão e GLI1 RegIV foi analisada utilizando Spearman. dados IHC foram analisados ​​utilizando o teste do qui-quadrado. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

GLI1 e expressão RegIV em tecidos de câncer de pâncreas

Para estudar GLI1 e expressão RegIV no PC, qRT -PCR e IHQ foram utilizados em 12 tecidos de biópsia emparelhados. GLI1 expressão foi maior em 9 casos (9/12), em comparação com os tecidos normais adjacentes pancreáticas (p = 0,011; Figura 2); RegIV expressão foi maior em 9 casos (9/12) (p = 0,011; Figura 2). Houve uma correlação positiva entre GLI1 e RegIV em tecidos PC (R = 0,795, p 0,0001; Figura 2). Em IHC, encontramos RegIV a ser expresso apenas em células beta pancreáticas tecidos endócrinos normais, o que confirmou o relatório do Oue [37]. Em IHC, GLI1 e expressão RegIV foram maiores em comparação com a maioria dos PC tecidos normais (em comparação com 15/21 21/04, p = 0,001; 5/21 14/21 contra, p = 0,005; respectivamente; Figura 3). 15 de 21 casos de PC tinha uma expressão elevada da proteína GLI1, entre os quais 11 casos expressos elevados níveis de proteína RegIV (p = 0,001; Figura 3).

A expressão de ARNm em GLI1 RegIV 12 pares de tecidos e PC tecidos normais adjacentes (A-B). O ADN das amostras foram recolhidas a partir de biópsias cirúrgicas e GLI1 relativa e a expressão de ARNm RegIV foram detectados por qRT-PCR. correlação estatística entre a expressão de mRNA GLI1 e RegIV em 12 pares de tecidos de PC e tecidos normais adjacentes foram analisados ​​pelo teste de Spearman (C). Todos os resultados foram normalizados para a p-actina expressão de ARNm. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão e foram calculados pelo teste t emparelhado. Significativamente diferente entre os dois grupos: * p 0,05. ** P 0,01. NS:. Não significativa

Todas as amostras foram coletadas, fixadas em formalina, parafina-embedded, e detectados por IHC. imagens representativas são mostrados. A coloração positiva de GLI1 foi observada no núcleo da célula PDAC (A); no entanto, os tecidos normais adjacentes não exibiram ou coloração fraca para GLI1 (B). Em tecidos normais adjacentes pancreáticas, apenas células das ilhotas apresentaram coloração positiva de RegIV (D), enquanto que a coloração positiva de RegIV foi observada, bem como grânulos citoplasma caliciformes em tecidos de PC (C). Todas as fotomicrografias foram obtidas no × 200 de ampliação. Barras de escala, 100? M.

A correlação entre GLI1 e RegIV

Testamos GLI1 e RegIV expressão em 5 linhas celulares PC por qPCR e Western blot. Houve uma correlação positiva entre o nível de mARN e GLI1 RegIV e proteína (P = 0,958, P = 0,011 e P = 0,939, P = 0,018, respectivamente; Figura 4). GLI1 RegIV e foram sobre-expressos em PC contra células pancreáticas normais.

A expressão de proteínas e GLI1 RegIV em 5 linhagens de células do cancro do pâncreas, como detectado por análise de Western blot de extractos de células, utilizando anticorpos anti-Gli1 e anti-RegIV ( UMA). β-actina foi utilizado como controlo de carga em todos os experimentos. Os resultados foram quantificados por determinação das intensidades das bandas comparada com a de β-actina (B). correlação estatística entre a expressão de GLI1 e proteína RegIV em 5 linhas celulares PC foi analisada pelo teste de Pearson (C). GLI1 Relativa e a expressão de ARNm RegIV foram examinados por qRT-PCR (D). A expressão de ARNm e GLI1 RegIV foi normalizada para p-actina expressão de ARNm. correlação estatística entre a expressão de mRNA GLI1 e RegIV em 5 linhas celulares PC foi analisada pelo teste de Pearson (E). Todos os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes.

RegIV expressão mudou com expressão GLI1 em PANC-1 e BxPC-3

Para verificar ainda mais a relação entre GLI1 e RegIV em células PC, nós concebido e construído shRNA-GLI1 lentiviral vector, e transfectadas lo em PANC-1, uma linha de células PC com a mais alta expressão da GLI1 (Figura 4). 48 horas após a transfecção, a eficiência de transfecção foi mostrado por citometria de fluxo (FCM) para ser mais do que 95% (Figura S2); fluorescência estável ainda podia ser detectado mesmo após 20 passagens (Figura S3).

Em seguida, qRT-PCR e Western blot foram usadas para detectar a expressão em células RegIV GLI1-shRNA-PANC-1. As células sem transfecção foram utilizadas como controlos, enquanto que as células transfectadas com precipitação shRNA foram usadas como controlos negativos. RegIV ARNm diminuiu de 94,7 ± 0,3%, quando GLI1 ARNm diminuiu de 82,1 ± 3,2%. proteína RegIV diminuiu de 84,1 ± 0,5%, quando a proteína GLI1 diminuiu em 76,7 ± 2,2% (Figura 5). Isto sugeriu que a expressão RegIV diminuiu quando foi GLI1 silenciados por RNAi.

células PANC-1 foram transfectadas com GLI1-shRNA ou GFP-shRNA, BxPC-3 foram transfectadas com VE-GLI1-eGFP ou LV-eGFP , em seguida, a expressão de ARNm GLI1 em relação à do ARNm β-actina foi avaliada por qRT-PCR (a, D). Após a transfecção, a expressão de proteínas GLI1 foi analisada por Western blot (C, F). A inserção mostra uma redução substancial na expressão por RegIV em tempo real de RT-PCT (B, E) e análise Western blot (C, F). Os resultados foram normalizados para que a expressão de β-actina. Todos os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes.

Nós ainda concebido e construído um vetor lentivírus que expressa GLI1, e transfectadas lo em BxPC-3, com a expressão GLI1 menor na 5 linhas celulares (Figura 4), para determinar se a expressão RegIV alterada juntamente com GLI1. 48 horas após a transfecção, qRT-PCR e Western blot foram usadas para detectar RegIV nas células BT-GLI1-BxPC-3. As células sem transfecção foram utilizadas como controlos, enquanto que as células transfectadas com vector vazio lentivírus foram usadas como controlos negativos. RegIV mRNA aumentou 729,1 ± 4,3% quando GLI1 mRNA aumentou 924,5 ± 5,3%. RegIV proteína aumentou 339,0 ± 3,7%, quando a proteína GLI1 aumentou 362,1 ± 3,5% (Figura 5). Isto implica que a expressão RegIV aumentou quando GLI1 foi sobre-expresso. Com base nestes resultados, concluímos que GLI1, um fator de transcrição, pode regular a expressão gênica RegIV.

Identificação do candidato Gli1 sítios de ligação no promotor RegIV

A correlação positiva entre GLI1 e RegIV em ambos os tecidos PC e linhas celulares nos levou a procurar o promotor RegIV para sítios de ligação potencial GLI1 ao DNA sequência de consenso 5′-GACCACCCA-3 ‘[42]. análise dos dados revelou quatro potenciais locais situados a montante do local de início da transcrição (Figura 6). A homologia de cada local de ligação GLI1 à sequência de consenso canónica variou de 67% (os locais 1, 2, 3, e 5) a 78% (local 4), o que sugeriu que o promotor do gene pode ligar-se a RegIV GLI1.

(a) Localização dos potenciais locais de ligação GLI1 (números 1-5) em relação à estrutura do gene. P representa o local de início da transcrição. O quadro cinza representa o local de splicing variável. Frames em branco representam exons. (B) Posição dos sítios de ligação do promotor em relação ao local de iniciação de transcrição P e a homologia de sequência com a sequência de ligação GLI1 consenso, GACCACCCA.

A confirmação da proteína GLI1 obrigado a região promotora de gene RegIV pelo chip

o ensaio solução cromatina sonicadas mostraram que o fragmento de DNA total apareceu manchada na gama de 100 pb a 1 kb no grupo de 80 W (Figura S4). O resultado da electroforese de ADN revelou a banda de ADN prevista em ENTRADA, GLI1-Ab, e os grupos de controlo postive usando humano RegIV iniciador-D-F, e não na IgG e grupos de controlo negativo (Figura 7). Apenas de entrada e o controlo positivo mostrou a banda prevista utilizando humano RegIV iniciador-A-C, G, mas não em GLI-Ab, IgG, e grupos negativos (dados não mostrados). Os resultados da análise da sequência mostrou que as sequências eram as mesmas que a do promotor do gene de RegIV local 4 (Figura S5, S6, S7). Todos os dados sugerem que GLI1 foi ligado ao promotor do gene da RegIV local 4 (GATCATCCA), e regulado RegIV no PC através da via de sinalização de Hh.

Os locais de RegIV iniciador-AG na região promotora do gene RegIV . Os números no diagrama esquemático do gene RegIV números (1-5) correspondem aos locais de ligação potenciais GLI1. P representa o local de início da transcrição. Os lisados ​​de células PANC-1 foram sujeitos a imunoprecipitação da cromatina pelo anticorpo anti-GLI1. RegIV humano iniciador-A-G foram usadas para amplificar a região do promotor RegIV contendo o sítio de ligação putativo GLI1. cromatina sonicado foram usados ​​como controle DNA INPUT. IgG, RNA polimerase II, e β-actina Ab foram utilizados como controlos aleatórios, controlos positivos e controlos negativos. (B) apenas a entrada, o controlo positivo, e GLI1-Ab mostrou a banda prevista de etídio géis de agarose corados com brometo utilizando os produtos de chip de PCR que foram amplificados por RegIV iniciador-D (I), RegIV (ii) o iniciador-E, e RegIV iniciador-F (iii). Não transcrição detectável foi observada no modelo amplificado a partir de IgG ou um controlo negativo e uma pista de controlo positivo confirmado o fragmento esperado. padrões de peso molecular (marcador) foram utilizados para estimar o tamanho das bandas amplificadas.

A confirmação da GLI1 ligada ao promotor RegIV pela EMSA

site

Como descrito acima, a ligação do GLI1 na região promotora do gene foi confirmada RegIV chip de PCR. Em seguida, usamos ensaios de EMSA para abordar diretamente se GLI1 liga RegIV

in vivo

. Nós sintetizados oligonucleotídeos específicos que contêm o elemento GLI1 presente no promotor RegIV em experimentos EMSA com extractos nucleares de linhas PANC-1 celulares. Como mostrado na Figura 8, a incubação de células PANC-1 com a sequência extrai-GLI1 RegIV marcado com biotina produziu um desvio de bandas de ADN-proteína. Estes complexos DNA-proteína foram específicos para o site GLI1 por ensaios de competição de sucesso utilizando diferentes dobras de excesso não marcados GLI1-RegIV e mutantes marcadas oligonucleotídeos GLI1-RegIV. Para confirmar a ligação do GLI1 à sequência GLI1-RegIV, estas reacções de EMSA foram ainda incubadas com anticorpo anti-GLI1. Como mostrado na Figura 8, a adição deste anticorpo resultou num complexo supershifted para além da banda de ADN-proteína. Estes dados demonstraram a presença de GLI1 no complexo proteína nuclear que se liga ao local de ligação do promotor GLI1 RegIV (-528~-520).

EMSA foi realizado com extractos nucleares de células PANC-1 (pistas 2 a 7) ou sem extractos nucleares (pista 1). A sonda RegIV foi gerado por emparelhamento dos oligonucleótidos de cadeia simples e marcados nas extremidades, contendo a região do promotor RegIV (nucleótidos -528-520). As experiências de competição foram realizadas utilizando 1-dobragem (pistas 3), 10 vezes (pistas 4), e de 100 vezes (pistas 5) excesso de oligonucleótidos não marcados, respectivamente (pistas 3 a 5) ou 100 vezes oligonucleótidos mutante marcadas (pista 6). Para super-shift, o anticorpo anti-GLI1 (pista 7) foi incubado com extractos nucleares antes de serem adicionados à reacção.

Discussão

Neste estudo, confirmamos que GLI1 e RegIV foram sobre-expressos em tecido PC e linhas celulares, confirmada por outros relatos [12], [20], [32]. Nós também demonstrou uma correlação significativamente positiva entre a expressão de GLI1 e RegIV. interferência de ARN e as experiências mostraram que a expressão superexpressão RegIV mudado com expressão GLI1 em linhas celulares PC; isso foi confirmado por CHIP e EMSA.