Abstract

chemoresistance continua a ser um grande obstáculo para o tratamento eficaz em pacientes com câncer de ovário e, recentemente, o aumento evidências sugerem que miARNs estão envolvidos na resistência à droga. Neste estudo, foram investigados o papel de miARNs na regulação da resistência à cisplatina em linhas celulares do cancro do ovário e analisadas as suas possíveis mecanismos. Nós perfilado miARNs expressos diferencialmente na linha celular de cancro do ovário humano A2780 resistente a cisplatina /DDP em comparação com as células A2780 progenitoras, utilizando microarrays. Quatro miARNs anormalmente expressas foram seleccionado (miR-146a, -130, -374a e miR-182) para estudos posteriores. A sua expressão foi verificada por meio de qRT-PCR. imita miARN ou inibidor foram transfectados em células A2780 e A2780 /DDP e depois a sensibilidade ao fármaco foi analisada por matriz MTS. RT-PCR e Western blot foram realizados para examinar a alteração da expressão do gene MDR1, PTEN. Um total de 32 miARNs foram encontrados para ser expresso diferencialmente em células A2780 /DDP. Entre eles, miR-146a foi regulada para baixo e miR-130a, -374a, -182 foram upregulated em células A2780 /DDP, que foi verificado por RT-PCR. MiR-130a e miR-374a imita diminuiu a sensibilidade das células à cisplatina A2780, inversamente, os inibidores poderiam resensitize células A2780 /DDP. Além disso, a sobre-expressão de miR-130a pode aumentar os níveis de mRNA MDR1 e P-gp em A2780 e células A2780 /DDP, enquanto knockdown de miR-130a pode inibir a expressão do gene MDR1 e upregulate a expressão da proteína PTEN .Em uma conclusão, a desregulamentação dos miR-374a e miR-130a podem estar envolvidos no desenvolvimento e regulação de resistência à cisplatina em células de cancro do ovário. Este papel de miR-130a pode ser alcançado através da regulação da expressão do gene MDR1 e PTEN

citação:. Li N, Yang L, Wang H, Yi t, Jia X, Chen C, et ai. (2015) miR-130a e função miR-374a como reguladores novela de Resistência cisplatina em células de câncer de ovário humano A2780. PLoS ONE 10 (6): e0128886. doi: 10.1371 /journal.pone.0128886

Editor do Academic: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 15 de fevereiro de 2015; Aceito: 02 de maio de 2015; Publicação: 04 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por dois fundos. Uma delas é a Fundação local (No.2012SZ0022) a partir de Ciência e Tecnologia Departamento da província de Sichuan (https://www.scst.gov.cn/info/), cujo financiador é WHJ participando do desenho do estudo e decisão de publicar neste estude. A outra é o Programa de Changjiang Scholars ea Equipe Pesquisa Inovativa em University (NO.IRT0935, https://www.moe.gov.cn/), cujos financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO dE iNTERESSES:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a principal causa de morte em malignidades ginecológicas [1]. Mais de 70% dos pacientes com cancro do ovário têm avançado fase (fase FIGO III ou IV), doença no momento do diagnóstico [2]. A cisplatina é a principal abordagem terapêutica para o cancro do ovário avançado, no entanto, a resistência aos medicamentos minimiza a eficácia da quimioterapia com cisplatina base num grande número de pacientes [3]. Múltiplos fatores e mecanismos que contribuem para a cisplatina resistência foram relatadas, incluindo efluxo aumentado de drogas, abnormity do alvo da droga, o aumento da reparação do DNA e alteração das vias de apoptose [4-7] .Nonetheless os mecanismos subjacentes da chemoresistance ainda são pouco conhecidos eo agentes eficazes para melhorar a resistência é até na ausência.

recentemente, estudos relataram que microRNAs (miRNAs) foram envolvidos em chemoresistance. MiRNAs representam uma classe de pequenas moléculas de RNA não-codificantes, e pode ligar-se à região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) dos mRNAs alvo, resultando na degradação do ARN e /ou de repressão de translação [8]. Assim, miARNs amplamente participar na regulação de diversos processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, a proliferação celular, diferenciação, migração e apoptose [8,9]. Um número cada vez maior de estudos sugerem que as expressões de miARN aberrantes têm sido associados com todos os aspectos da biologia do tumor, incluindo a resistência a vários agentes quimioterapêuticos [10-12] .Para exemplo, o miR-21 foi sobre-expresso em tecidos de cancro colo-rectal que foram menos sensíveis a 5 -FU [13], e a inibição da expressão de miR-21 foi capaz de sensibilizar as células a 5-FU [14]. Além disso, nosso estudo anterior [15] descobriram que miR-130a foi regulada em SKOV3 /DDP comparação com SKOV3, e inibição de miR-130a poderia superar a resistência a cisplatina através da regulação da via /P-gp MDR1. No entanto, o papel dos miRNAs prensents especificidade das células, de modo a expressão de miR-130a ou outros miRNAs e seus papéis em outras linhas de células de cancro do ovário são necessários para um estudo mais aprofundado.

No presente estudo, nós analisamos a expressão miRNA perfil de A2780 e A2780 /DDP células, e selecionou alguns dos miRNAs diferencialmente expressos em A2780 /DDP para um estudo mais aprofundado. Em seguida, verifica-se a expressão de miARN seleccionados por qRT-PCR, e investigaram o seu papel na modulação da resistência a cisplatina, que podem oferecer novos alvos candidatos para a terapia de genes em cancro do ovário resistente a cisplatina.

Materiais e Métodos

cultura celular

O ovário A2780 linha celular de cancro humano e a sua sublinha resistente a cisplatina A2780 /DDP foram cultivadas em meio DMEM (Gibco, EUA) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS, Gibco , EUA), numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C. A2780 /DPP foi alternadamente alimentadas com meio contendo 9 ug /mL de cisplatina para manter a resistência aos medicamentos e ainda cultivadas em meio isento de fármaco, durante uma semana antes de experiências complementares. Ambas as linhas celulares foram obtidos e conservados em ginecologia Oncologia do Bioterapia Laboratory, West China Hospital Segundo University, Universidade de Sichuan, Chengdu, China.

miRNA análise microarray

O RNA total foi extraído de A2780 e A2780 /DDP células utilizando Trizol (Invitrogen, EUA) e miRNeasy Mini kit (Qiagen, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e a quantidade foram medidos por um espectrofotómetro (Beckman Coulter, DU730, EUA) e a integridade de ARN foi verificada por electroforese em gel. RNA (1 ug) foi marcado com Hy3 fluorescente utilizando o kit de rotulagem miRCURY de energia (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) e depois hibridizada na matriz miRCURYLNA (v.18.0, Exiqon) contendo 1887 sondas de captura de miRNA humanos anotados em miRBase 18,0. Após a hibridação, as imagens do sinal de fluorescência foram adquiridos utilizando um digitalizador GenePix 4000B (Axon Instruments, Union City, CA, EUA) e foram analisados ​​com GenePix Pro 6.0 soft-Ware (Axon Instruments), em que foi obtida a normalização mediana. Duas vezes ou mudança maior foi definido como um limiar de diferença significativa.

Bioinformatics

alvos potenciais de miRNAs diferencialmente expressos foram previstos com a ajuda de PicTar ou software TargetScan 5.2.

em tempo real qRT-PCR

verificou-se a expressão de miRNAs seleted em A2780 e A2780 /DDP células por qRT-PCR. O ARN total de cada linha celular foi extraído e avaliados como o acima indicado. MiARN e U6 ADNc foi gerado utilizando iniciadores específicos de miARN haste-laçada RT de acordo com o Kit de AMV First Strand cDNA Synthesis de protocolo (Invitrogen, EUA). Todos os iniciadores foram desenhados e sintetizados por Guangzhou RiboBio (RiboBio, China). Em tempo real de qRT-PCR foi realizado num volume de reacção de 20 uL na StepOne ABI mais instrumento (EUA). expressão miRNA relativa foi avaliada utilizando o

-ΔΔCt método 2 e normalizados para a expressão de RNA pequeno U6. Todos os qRT-PCR foram realizadas em triplicata.

celular transfecção

O miRNA imitar, inibidor e controle negativo foram concebidos e sintetizados quimicamente por Guangzhou RiboBio (RiboBio, China). 24 horas antes da transfecção, as células foram semeadas em placas de 96 poços com 5000 células /poço e cultivadas em meio sem antibióticos. Após a ligação de células, transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, EUA) e reduzido OPTI-MEM meio de soro (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O meio foi substituído 4-6h após a transfecção com o novo meio fresco. As células foram preparadas para análise mais 48h após transfecção. A eficiência deste sistema de transfecção mediada por lipossomas foi dectected com a ajuda de Cy3-siRNA. Cy3 siARN é uma espécie de molécula de RNA pequeno 21-25nt, semelhante ao inibidor de miARN ou mimetiza, e pode excitar a fluorescência no comprimento de onda de 555 nm. Os passos principais são os seguintes: As células foram semeadas em placas de 24 poços com 10000 células /poço e transfectadas com o siARN Cy3 usando Lipofectamine 2000 e de meio Opti-Mem. 24 h após a transfecção, as células foram observadas ao microscópio de fluorescência. A eficiência de transfecção foi apresentada como a razão de células observadas sob a fluorescência de células observadas sob a ligtht nomal. Todas as experiências foram repetidas três vezes.

matriz viabilidade celular

Após a transfecção, as células em placas de 96 poços foram expostas a várias concentrações de cisplatina. A proliferação celular foi determinada por um ensaio colorimétrico utilizando o One Solution kit celular Ensaio de Proliferação de CellTiter 96 Aqueous (Promega, Madison, WI, EUA). Depois de 48 h de tratamento, 20 ul de uma solução de reagente foi adicionada a cada poço e incubou-se durante 3 h a 37 ° C. A absorvância a 490 nm de comprimento de onda foi medida utilizando leitor de microplacas (modelo 680, Bio-Rad, EUA). Cada experimento foi realizado com repetições de seis poços e repetiu três vezes.

Semi-RT-PCR quantitativo

O RNA total a partir de células não tratadas ou células transfectadas foi isolado utilizando Trizol Reagente. RT-PCR foi realizado usando o kit de reagentes PrimeScript RT e PCR Multiplex Assay Kit de acordo com as instruções do fabricante (Takara Biotecnologia, Dalian, China). Os produtos de PCR foram identificadas por electroforese com gel de agarose 1,5% e registados utilizando o sistema de imagem em gel (Bio-Rad, CA, EUA). GAPDH ARN foi serviu como um controle de entrada.

ensaio Western Blot

As células foram lavadas com 1 x PBS e lisadas com tampão RIPA. A concentração de proteína foi medida utilizando o método BCA. Em seguida, 20 ug da proteína foi utilizada para a detecção de P-gp e proteínas PTEN, e GAPDH foi usada como controlo de carregamento. Monoclonal de rato anti-Pgp (diluído 1: 1000; Calbiochem, San Diego, CA, EUA), anti-PTEN (diluído 1: 1.000; Santa Cruz, CA, EUA) e anti-GAPDH (diluído a 1: 50.000; Kangchen, Xangai , China) foram utilizados como anticorpos primários. O anticorpo secundário foi conjugado com peroxidase de rábano. Os anticorpos ligados foram detectados utilizando o estojo ECL. A Quantidade Um software foi utilizado para quantificar intensidades das bandas de proteína.

A análise estatística

Os dados são apresentados como a média ± SD. A diferença entre os meios foram analisados ​​utilizando o teste t de Student. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 13.0 (Chicago, IL, EUA). Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Diferencial expressa miRNAs em A2780 /DDP comparado com o seu celular parental A2780

O perfil de expressão miRNA de ovário linha celular de cancro A2780s e A2780 /DDP foi detectada utilizando matriz miARN no presente estudo. Como mostrado na Tabela 1, 32 miARNs (24-regulada, 8 regulada negativamente) foram encontrados para ser expresso diferencialmente em células A2780 /DDP em comparação com as suas células paternas. O potencial gene alvo destes miRNAs foi previsto e listados na Tabela 1.

em tempo real qRT-PCR para 4 miRNAs diferencialmente expressos

Entre 32 miRNAs diferencialmente expressos, foram selecionados 4 miRNAs para o estudo futher. Os resultados de qRT-PCR mostrou que, em células A2780 /DDP, a expressão de miR-374a, 130a, respectivamente -182 foi aumentado em 2,06, 4,87, 1,28 dobras e miR-146a diminuiu 133,56 vezes, em comparação com células A2780s (

P

0,05), que eram consistentes com o microarray. (Fig 1)

O nível de miR-146a em A2780 /DDP foi extremamente baixa, representa apenas 0,75 porcentagem de que, em A2780s (**

p Art 0,05). A expressão de miR-130a, -374a e miR-182 foi de 4,8, 2,08 e 1,28 dobras mais elevado do que em células A2780 (**

P

0,05, *

P

0,05) .Estes resultados mostraram as mudanças de expressão consistentes detectados pelo microarray.

miR-130a e miR-374a imita ou inibidores regular sensibilidade cisplatina em A2780 e A2780 /DDP

neste estudo, utilizou-se o lipossoma para mediar a transf ecção de análogos de miARN. Por isso, em primeiro lugar, detectou a eficiência da transfecção. células A2780 e A2780 /DDP foram observadas ao microscópio de fluorescência após 24 horas de Cy3-siRNA transfecção. calculamos que os A2780s e células A2780 /DDP com fluorescência vermelha, respectivamente, representaram 85% e 93%, o que indictated que o sistema de transfecção de Lipossomas mediada poderia alcançar uma alta eficiência

Três miRNA (miR-374a,. – 130a, -182) imita e inibidor de miR-146a foram transfectados em células A2780, para ver se as células transfectadas iria adquirir resistência a cisplatina. Os resultados mostraram que as células A2780 transfectadas com miR-374a e miR-130a imita tiveram uma sobrevivência significativamente maior do que o grupo de controlo sob o tratamento de 0,8, 3,2 ug /ml cispaltin, mas mesmo fenómeno não foi observado para o miR-182 imita e inibidor de miR-146a. (P 0,05, Figura 2A).

(A) As células A2780 após a transfecção com o miR-130a-mímica e miR-374a-mímica mostraram um aumento da proporção de células que sobreviveram ao abrigo do tratamento de 0,8, 3,2 ug /ml cispaltin (*

p Art 0,05). (B) o miR-130a-inibidor e miR-374a-inibidor diminuiu a proporção de células sobreviventes no âmbito do tratamento de 8, 32 ug /ml cispaltin (*

P

0,05).

Nós ainda transfectadas com inibidores de miR-374a e miR-130a em células A2780 /DDP para explorar se eles podem reverter parcialmente a resistência a cisplatina. Como mostrado na Fig 2B, o miR-374a e inibidor de miR-130a aumentaram significativamente a citotoxicidade do tratamento com cisplatina em comparação com a do controlo (p 0,05).

miR-130a regular a expressão de MDR1 e PTEN em A2780s e células A2780 /DDP

Foi examinada a expressão da MDR1, mRNA PTEN e proteína na A2780 e A2780 /DDP células por RT-PCT e western blot. Tal como mostrado na Fig 3, o nível de ARNm de MDR1 e a P-gp na A2780 /células DDP foi de 2,33 e 1,88 vezes maior do que o de em células A2780 (P 0,05), enquanto a expressão de proteínas PTEN eram extremamente baixos em ambos célula linhas e a expressão de mRNA e proteína PTEN, não houve diferença significativa entre eles (P 0,05).

(a) os níveis de MDR1 e mRNA PTEN em A2780 e células A2780 /DDP. A expressão de ARNm de MDR1 foi sobre-expresso em células A2780 /DDP em comparação com A2780 (P 0,05), e o nível de ARNm de PTEN não mostrou nenhuma diferença significativa (P 0,05). (B) P-gp e PTEN níveis de expressão de proteína em células A2780s e A2780 /DDP. A expressão de P-gp em células A2780 /DDP foi maior do que a de A2780 (P 0,05), e proteína PTEN estava numa níveis muito baixos em células A2780 e A2780 /DDP. (1,2: A2780, A2780 /DDP)

A fim de investigar se miR-130a poderia regular a expressão de PTEN e MDR1, imita correspondentes e inibidores dos dois miRNAs foram transfectados em A2780 e A2780 /células DDP. PTEN, MDR1 mRNA e sua expressão de proteínas foram determinadas a 48 h após a transfecção. Como mostrado na Fig 4, a inibição de miR-130a aumentaram os níveis de proteína PTEN e atenuou a expressio de ARNm MDR1 e a P-gp (P 0,05), ao passo que o miR-130a sobre-expressão resultou na sobre-regulação de ARNm de MDR1 e a P-gp em A2780 e A2780 /células DDP (P 0,05) .A expressão de ARNm de PTEN não se alterou com o tratamento de inibidor de miR-130a e imita em ambas as linhas celulares (P 0,05).

(A1 , A2): PTEN e ARNm de MDR1 em células A2780 após a transfecção. O nível de ARNm foi regulada positivamente por MDR1 imita o miR-130a e regulados negativamente por o inibidor de miR-130a (P 0,01). (B1, B2): P-gp e proteína PTEN em células A2780 após a transfecção. A expressão das proteínas PTEN foi significativamente elevados quando as células foram tratadas com miR-130a-I, a expressão de P-gp foram regulados positivamente por miR-130-M e regulados negativamente por miR-130a-I. (C1, C2): PTEN e ARNm de MDR1 em A2780 /DDP células após a transfecção. O efeito regulador do miR-130a em células A2780 /DDP foi semelhante ao de células A2780. (D1, D2): P-gp e proteína PTEN em células A2780 /DDP após a transfecção. O efeito de miR-130a foi semelhante ao das células A2780s. (1,2,3: miR-130a-M, miR-130a-I e miR-NC; * p 0,05, ** p 0,01)

Em resumo, encontramos 32 miRNAs são diferencialmente expressos em células A2780 /DDP em comparação com as suas células parentais por matriz de miRNA. Entre eles, um sub-regulada miRNA (miR-146a) e três up-regulamentados miRNAs (miR-130a, -374a, -182) foram selecionados para um estudo mais aprofundado, e sua expressão foram validados de forma consistente com a matriz miRNA utilizando qRT-PCR. Na experiência de transfecção, a sobre-expressão de miR-130a e miR-374a foram encontrados para diminuir a sensibilidade de células A2780 e /DDP A2780 à cisplatina, e regulação negativa do miR-130a e expressão de miR-374a exerceu o efeito oposto. Os resultados de RT-PCR e Western blot mostrou que o miR-130a pode regular positivamente a expressão de ARNm e proteína de MDR1 e regular negativamente a proteína PTEN, que pode ser um dos mecanismos de papel de miR-130a na quimiorresistência.

Discussão

Embora a quimioterapia à base de platina tem melhorado muito o prognóstico de câncer de ovário, de resistência a drogas ainda permanece como o principal obstáculo de sucesso do tratamento [3]. Recentemente, foram relatados miRNAs diferencialmente expressos em cancros resistentes aos medicamentos e poderia regular a resistência aos medicamentos [16,17].

No presente estudo, verificou-se que 32 miRNAs foram diferencialmente expressos em A2780 /DDP comparação com A2780. Curiosamente, algumas destas miARNs foram confirmados para ser envolvido na quimiorresistência. Por exemplo, miR-27a foi regulada em A2780 /células taxol e knockdown de miR-27a aumentou a sensibilidade paclitaxel [18]. Takiuchi [19] relatou que miR-181 diminuiu a sensibilidade das células do cancro do pâncreas gemcitabina através da activação de NF-kB por inibição CYLD. Nosso estudo anterior também encontrou miR-130a foi relacionada com a cisplatina resistência em células SKOV3. Os dados de microarray revelou que em A2780 /DDP a expressão de miR-146a era extremamente baixa, e miR-130a, -374a, -182 foi regulado para cima. Além disso, o papel de miR-130a na resistência cisplatina de células A2780 e se miR-146a, -374a, -182 poderia regular a resistência aos medicamentos ainda não informou, por isso, escolher estes quatro miRNAs para um estudo mais aprofundado. Estes quatro miARNs expressão foram verificados por qRT-PCR, sugerindo que um pouco de microarray tinha uma precisão elevada.

Em experiências de transfecção, encontramos alteração de miR-130a e expressão de miR-374a poderia alterar o grau de resistência à cisplatina em A2780 e A2780 /DDP. Várias pesquisas têm mostrado que miR-130a agiu como regulador resistente à quimioterapia. A regulação de miR-130a pode afectar a resistência à doxorubicina no cancro da mama [20], e miR-130a induzida a resistência de células de cancro do fígado a cisplatina por regulação negativa de tumor de RUNX3 gene supressor [21]. Em nosso estudo anterior [15], miR-130a foi sobre-expresso em SKOV

3 /DDP células, e inibição de miR-130a pode restaurar parcialmente a sensibilidade a cisplatina, que era consistente com o estudo acima.

Atualmente, alguns estudos voltados para o papel de miR-374a no tumor, que assinalou que miR-374a foi overexpressed no osteosarcoma [22] e câncer de cólon [23]. Além disso, o miR-374a foi envolvido na gênese do tumor ea metástase do câncer de mama através da regulação da via Wnt /catenin [24]. Até o momento, não há relatos sobre o papel do miR-374a na resistência aos medicamentos. Aqui, nós descobrimos que o miR-374a foi regulada positivamente em células resistentes à cisplatina, e diminuindo a sua expressão pode tornar as células mais sensíveis a cisplatina, enquanto upregulating sua expressão em A2780s teve o efeito oposto.

Por isso, consideramos que a sobre-expressão de miR-130a e miR-374a pode contribuir para o desenvolvimento e regulação de resistência à cisplatina em células de cancro do ovário. A inibição da expressão de miR-130a e miR-374a pode ser uma nova abordagem para superar a resistência a drogas em cancro do ovário. Como resultado, nós também realizada RT-PCR e western blot para encontrar o mecanismo do efeito regulador miR-130a na resistência aos medicamentos.

Nosso estudo descobriu que a expressão de mRNA MDR1 e seu produto de proteína P-glicoproteína (P -GP) níveis no A2780 /DDP foi significativamente mais elevada do que nas A2780s, sugerindo que a sobre-expressão do gene MDR1 pode ser um mecanismo de formação de resistência a drogas em células A2780 /DDP. P-gp é uma bomba de membrana dependentes de ATP que transporta o fármaco para fora das células, o que resulta em resistência a múltiplas drogas [25]. A abundância de evidências indicam que os miRNAs foram associados a P-gp mediada resistência aos medicamentos em muitos tipos de câncer. Por exemplo, o miR-451 superou a resistência à doxorubicina por regular negativamente a expressão P-gp nas linhas de células resistentes à doxorrubicina cancro da mama MCF-7 /ADR [26]. A inibição de miR-27a aumentada a sensibilidade paclitaxel em A2780 /Taxol por modulação da expressão de MDR1 /P-glicoproteína [18]. Concluiu-se que a inibição da expressão de miR-130a resultou em baixo-regulação de ARNm de MDR1 e a P-gp. Este resultado está de acordo com as nossas experiências anteriores.

Nós também descobrimos que miR-130a regular negativamente a expressão da proteína PTEN. PTEN proteína é uma fosfatase de especificidade dual que podem bloquear as vias de transdução de sinal mediadas por citocinas, em seguida, inibir a proliferação celular, invasão e metástase e promovem a apoptose [27]. Em uma variedade de tumores malignos, incluindo o cancro colo-rectal, cancro da mama, leucemia, cancro do ovário, etc, do gene e proteína PTEN têm diferentes graus de deleção ou a sub-regulação [27,28]. Tem sido relatado que a proteína PTEN poderia contribuir para a sensibilidade ao fármaco através da supressão da via PI3K /Akt, e servir como gene alvo de muitas miARNs, tais como o miR-21, 22-miR-222 e miR [29,30]. Nesta experiência, a expressão das proteínas PTEN em A2780s e células A2780 /DDP foram extremamente baixo e não tinha nenhuma diferença significativa entre estas duas linhas celulares. Também inferir que a restauração da expressão de PTEN pode ser um dos mecanismos de quimiossensibilidade aumento nas células de cancro do ovário. No entanto, as células A2780 e A2780 /DDP transfectadas com miR-130a-inibidor não exerceu maior inibição da atividade das células em comparação com os grupos de controlo sob o tratamento de baixa dose de cisplatina (0.2ug /ml e 2 ug /ml, respectivamente), foram calculados a razão deste fenómeno é que a apoptose mediada por células-PTEN dependem, em parte, o dano celular por cisplatina e têm um efeito sinérgico. Apenas uma pequena quantidade de células processadas à apoptose ou morte neste baixa dose de cisplatina, e inibição do crescimento celular mediado por PTEN não têm capacidade suficiente para fazer uma diferença significativa entre os grupos experimental e controle. Curiosamente, descobrimos que o miR-130a não regular a expressão de ARNm de PTEN mesmo modo PTEN proteína, sugerindo que o miR-130a pode regular a transcrição do gene PTEN ao nível pós-translacional pela ligação incompleta para a região 3 ‘não traduzida (3’-UTR ) do ARNm de PTEN.

software PicTar andTargetScan prevê que os potenciais genes alvo de miR-374a incluem Akt3 ABI1, PDCD6, ABCC5 e assim por diante. Entre eles, ABI1 tem provado ser associada com a inibição do crescimento e proliferação de células [31], que pode ser um dos mecanismos de regulação de miR-374a sobre a resistência à cisplatina, no entanto, continua a ser ainda verificada por expriments.

recentemente, Xiang et al. [32] relatou que miR-152 e miR-185 foram significativamente regulada negativamente na SKOV3 /DDP e células A2780 /DDP, em comparação com a sua linha de pai sensível SKOV3 e A2780, e up-regulação da expressão de miR-152 ou miR-185 sensibilidade aumentada cisplatina de SKOV3 /DDP e células A2780 /DDP suprimindo DNA metiltransferase 1 (DNMT1) diretamente. De forma inconsistente, miR-152 e miR-185 (redução de 0,4 e 0,6 vezes em A2780 /células DDP em comparação com células A2780 no estudo de Xiang) foi encontrado para ser para cima ou para baixo-regulado em menos de duas vezes em A2780 /células DDP comparação com células A2780, assim que estes miRNAs não foram listados como miRNAs de interesse. No entanto, devemos estar cientes de que matriz miRNA é um ensaio preliminar cujos resultados precisam de uma validação adicional, como por qRT-PCR, ea menos de duas vezes miRNAs diferencialmente expressos também pode ter efeito sobre a resistência aos medicamentos de câncer de ovário.

em conclusão, este estudo demonstra que miARNs diferencialmente expressos em células de cancro do ovário resistentes à cisplatina, provavelmente, desempenham um papel importante no desenvolvimento ou na regulação da resistência a cisplatina. Além disso, a transfecção com miR-130a e inibidores de miR-374a aumentou o efeito citotóxico de cisplatina. O papel de miR-130a na resistência aos medicamentos foi conseguido, pelo menos parcialmente, através da regulação da expressão de P-gp e proteína PTEN. PTEN pode ser um gene alvo de miR-130a, no entanto, é necessária a validação de relatórios de luciferase duplo. Estes resultados sugerem que miR-130a e miR-374a pode ser promissor como novos alvos terapêuticos para superar a resistência aos medicamentos.

Reconhecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Programa de Changjiang Estudiosos e da Pesquisa Inovativa Team (PCSIRT) na University (IRT0935), ea Fundação locais de Ciência e Tecnologia Departamento de Chengdu (No. 11DXYB133SF-027).