Abstract
A ubiquitina-like com domínios PHD e anel de dedo 1 (UHRF1), como um regulador de epigenética, desempenha um papel importante na progressão tumorigênese e câncer. KISS1 funciona como um supressor de metástase em vários cancros, e silenciamento epigenético de KISS1 aumenta o potencial metastático de células cancerosas. Por isso, investigou se UHRF1 promove a invasão de células de câncer de bexiga inibindo KISS1. Os níveis de UHRF1 e KISS1 expressão foram examinadas por quantitativa PCR em tempo real ensaio
in vitro
e
in vivo
. O papel da UHRF1 na regulação da metástase do câncer da bexiga foi avaliada em células de câncer de bexiga. Descobrimos que os níveis UHRF1 está regulada na maioria dos espécimes clínicos de cancro da bexiga, quando comparado com os tecidos normais emparelhados e UHRF1 níveis de expressão são significativamente aumentados em tumores primários que posteriormente metástase comparação com tumores não-metastáticos. A expressão forçada de UHRF1 promove a invasão de células de câncer de bexiga, enquanto UHRF1 knockdown diminui invasão celular. A sobre-expressão de UHRF1 aumenta a metilação dos nucleótidos CpG e reduz a expressão de KISS1. nível de expressão UHRF1 e KISS1 está negativamente correlacionada
in vivo
e
in vitro
. Knockdown de KISS1 promove a invasão de células de câncer de bexiga. É importante ressaltar que a expressão forçada de KISS1 parcialmente anula invasão celular induzida UHRF1. Estes dados demonstram que UHRF1 upregulated aumenta a invasão de células de câncer de bexiga por silenciamento epigenético de KISS1
Citation:. Zhang Y, Z Huang, Zhu Z, Zheng X, Liu J, Han Z, et al. (2014) regulada UHRF1 Promove o cancro de bexiga invasão celular por epigenética silenciamento de KISS1. PLoS ONE 9 (10): e104252. doi: 10.1371 /journal.pone.0104252
editor: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de abril de 2014; Aceito: 07 de julho de 2014; Publicação: 01 de outubro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
Human cancro da bexiga ocupa o segundo lugar na freqüência de câncer geniturinário [1], e aproximadamente 50% dos pacientes diagnosticados com câncer de bexiga músculo-invasivo (CINM) desenvolver metástases distantes nos pulmões e fígado, resultando em taxas de sobrevivência de 5 anos pobres [2]. Actualmente, os avanços na terapia apropriada para melhorar a taxa de sobrevivência são limitadas porque os mecanismos subjacentes que causam metástases do cancro não são bem compreendidos. Portanto, é muito importante para revelar o mecanismo molecular de metástases de cancro da bexiga para o desenvolvimento de uma terapia eficaz.
UHRF1, também chamado ICBP90 em seres humanos e em murganhos NP95, é uma proteína de múltiplos domínios, a qual é necessária para a regulação de epigenética expressão gênica e cromatina alteração [3], [4]. UHRF1 aumenta o S /transição G1 como o alvo de factor de transcrição E2F [5], e mudanças no nível de expressão UHRF1 regula a progressão do ciclo celular, proliferação celular e migração celular [6], [7]. UHRF1 é regulada em vários tipos de câncer, e superexpressão de UHRF1 está envolvido na tumorigênese e câncer progressão [8], [9]. Vários relatórios demonstraram que UHRF1 pode ser um biomarcador importante para o diagnóstico e prognóstico de cancros [5]. Unoki
et al
demonstrou que UHRF1 superexpressão está associado ao grau e estágio do câncer de bexiga [10]. A sobre-expressão de UHRF1 no cancro da bexiga também está correlacionada com o aumento do risco de progressão da doença após a ressecção transuretral [10]. Wang
et al
mostrou que UHRF1 é sobre-expresso em cancro colorectal (CRC) linhagens celulares e amostras clínicas [5]. Os níveis de expressão UHRF1 estão correlacionadas com a metástase do câncer e má encenação Dukes. UHRF1 knockdown induz a apoptose celular e interrupção do ciclo celular na fase G0 /G1 e suprime a proliferação e migração celular.
UHRF1 é um regulador muito importante de metilação do DNA, e metilação do DNA aberrante é um evento epigenético frequente no cancro da bexiga [6], [11]. UHRF1 reconhece DNA hemimethylated gerado durante a replicação do DNA e recruta DNMT1 (methyltransferase1 DNA) para assegurar a manutenção fiel de padrões de DNA-metilação em células filhas [6]. KISS1 é identificado como suprimir as metástases em vários tipos de câncer, como câncer de bexiga, células de câncer de mama e melanoma [12]. KISS1 codifica uma proteína de 145 aminoácidos que é processado em KiSSpeptins (KP), incluindo KP10, KP13, KP14 e KP54 [12], [13], [14]. Estudos recentes mostraram que KISS1 é epigenetically silenciado por hipermetilação no cancro da bexiga [15]. Cebrian
et al
demonstrou que KISS1 hipermetilação é frequentemente observada e está correlacionada com baixa expressão do gene, que está sendo restaurado por desmetilação azacitidina em células de cancro da bexiga [12]. Hipermetilação do KISS1 também está correlacionada com alto grau de tumor e estágio. Apesar desses achados intrigantes, pouco se sabe sobre se UHRF1 aumenta bexiga invasão de células cancerosas pelo silenciamento epigenético de KISS1.
No estudo, nós testamos se UHRF1 /KISS1 representa uma nova via que regula a invasão de células de câncer de bexiga. Nossos resultados revelaram que a expressão UHRF1 é regulada em tumores primários que posteriormente metástase, e superexpressão de UHRF1 promove a invasão de células de câncer de bexiga por silenciamento epigenético de KISS1.
Materiais e Métodos
As amostras clínicas e linhas celulares
tecidos bexiga humana foram obtidas com consentimento informado por escrito do Hospital Amizade Beijing filiada à Universidade médica Capital. O estudo foi aprovado pelo Comitê de University Medical Capital Ética. 47 peças (Tabela 1) de amostras de biópsia patologicamente e normalmente diagnosticados (≥ 3 cm de distância de tecidos de câncer de bexiga) foram coletadas de pacientes com câncer de bexiga, incluindo 22 com não-músculo invasivo [NMI, estágio PTA-pT1] e 25 com músculo-invasiva [MI, fase ≥T2] .Human células cancerosas da bexiga foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e foram mantidas em RPMI 1640 com 10% de FBS (Gibco, Carlsbad, CA).
-PCR quantitativo em tempo real
O ARN total a partir de linhas celulares de cancro da bexiga e amostras foi extraída utilizando Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA). A reacção RT (transcrição reversa) foi realizada utilizando um kit de M-MLV de Transcriptase Reversa (Invitrogen). PCR em tempo real quantitativo foi realizado utilizando um protocolo padrão de SYBR Verde PCR Master Mix (Life Technologies) nas StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante respectivo. p-actina foi utilizada como controlo interno para o ARNm. ΔCt valores respectivos (tanto UHRF1 e KISS1) foram obtidos através da normalização para a p-actina. A expressão relativa foi calculada em relação ao controlo. Os resultados foram expressos como 2
-ΔΔCt. *
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. 0,05
A superexpressão e pequeno RNA de interferência
Para superexpressarem UHRF1, plasmídeo pcDNA-UHRF1 foi construído através da introdução de um
HindIII-EcoRI
fragmento contendo o ADNc UHRF1 nos mesmos locais em pcDNA3.1. O gene UHRF1 foi amplificado por PCR usando o primers directo e inverso: cccaagcttgggATGTGGATCCAGGTTCGGACCATGGACGGG e ggaattccTCACCGGCCATTGCCGTAGCCGGGGAAG. pcDNA-UHRF1 foi transfectado em linhas celulares de cancro da bexiga, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Para inibir UHRF1 endógena e expressão KISS1, células cancerosas da bexiga foram transf ectadas com 30 nm, indicou que indicado de siRNA ou um controlo negativo utilizando Lipofectamina 2000. UHRF1-siRNAs (sequência de referência, SC-76805) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). O KISS1-siRNAs (sequência de referência, SC-37443) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology.
Transwell ensaio de invasão
invasão celular foi examinada utilizando um ensaio de invasão Transwell com inserções de tamanho de poro de 8 mícrons (Corning Costar) tal como descrito anteriormente [16]. Resumidamente, as células de cancro da bexiga (RT4 ou T24) foram suspensas em meio sem soro, e depois semeadas em filtros Transwell revestidas com Matrigel em câmaras de invasão Biocoat Matrigel. O meio contendo soro foi usada como um quimio-atractor na câmara inferior. As células cancerosas da bexiga foram tratados com reagentes indicados durante 72 h, e depois as células que não invadem através dos poros foram eliminados usando um cotonete de algodão. As células na superfície inferior da membrana foram coradas com violeta de cristal. Os números de células foram determinados pela contagem das células penetrantes sob um microscópio em 200 × ampliação em campos aleatórios em cada poço.
análise de metilação de
KISS1
A busca por enriquecimento de CpG em KISS1 foi realizado e os iniciadores de sequenciação bissulfito foram projetados usando a ferramenta on-line CpG Ilha Searcher (MethPrimer, https://www.urogene.org/methprimer/). Os iniciadores forward estão GATGGAAGGGGAATAGTTTTATTAGA, e os iniciadores reversos são TACAACTAAAACTCCTTCCACCTAC [12].
O ADN genómico foi preparado a partir de células de cancro da bexiga, utilizando o ADN do sangue QiAmp Mini-kit, e em seguida, o DNA genómico foi bissulfito modificados por metilação do DNA EZ Kit -Gold da pesquisa Zymo [17]. Os produtos de PCR foram clonados em pmd-18T (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. 9 clones positivos foram sequenciados. Os dados foram analisados usando o software analisador de BIQ [17].
Análise Estatística
Os dados são expressos como média ± SD (desvio padrão) de pelo menos três experiências separadas. As diferenças entre os grupos foram analisadas utilizando
t
teste de Student. A diferença foi considerada estatisticamente significativa em
p
. 0,05
Resultados
nível UHRF1 é regulada em metastático bexiga urothelial carcinoma
Resultados UHRF1 em anormal metilação do DNA e metástase do câncer, e expressão UHRF1 está correlacionada com um prognóstico pobre em vários tipos de câncer. Para avaliar se UHRF1 regula a metástase do câncer da bexiga, examinamos primeiro UHRF1 expressão em linhas celulares de cancro da bexiga e tecidos de câncer. Figura 1A mostraram que os níveis de UHRF1 de expressão são significativamente regulada na maioria dos tecidos de cancro da bexiga em comparação com controles normais adjacentes. UHRF1 é notavelmente a expressão aumentada em 77% (36/47) de tecidos de cancro da bexiga (Figura 1A). Quando os 47 tecidos de tumor foram estratificados com base em progressão clínica, a expressão UHRF1 é significativamente aumentada nos tumores primários que subsequentemente metástase em comparação com tumores não-metastáticas (Figura 1B). Então nós ensaiado os níveis de UHRF1 expressão em ambas as linhas de células de câncer de bexiga invasivo e linhas celulares de cancro da bexiga não invasivo. Entre as três linhas de células invasoras (253J, T24 e KU7) os níveis UHRF1 são relativamente mais elevados do que aqueles em os não invasivos (Figura 1C). Estes dados sugerem que UHRF1 overexpressoin pode estar relacionado com a metástase do cancro da bexiga.
(A) A análise quantitativa do nível de expressão UHRF1 foi realizado em tecidos de cancro da bexiga (n = 47) e os tecidos normais adjacentes. O ARN total foi extraído e submetido a PCR em tempo real para analisar a expressão de UHRF1 em cada amostra. β-actina foi utilizado como um controlo interno. O nível UHRF1 relativo foi calculado por 2
-ΔΔCt onde ΔCt = Ct (UHRF1) – Ct (β-actina) e ΔΔCt = ΔCt (tecido tumoral) – ΔCt (tecido normal adjacente). espécimes de cancro (B) da bexiga foram divididos em dois grupos com base na progressão clínica. Os níveis UHRF1 no grupo de metástase (n = 25) foram mais elevadas do que aqueles no grupo sem metástases (n = 22). *
p Art 0,05. (C) UHRF1 nível de expressão foi analisada por PCR em tempo real em três não-invasiva e três linhas de células de cancro da bexiga invasivo. urothelial células normais foram utilizados como controle. *
p
. 0,05
regulada UHRF1 aumenta a invasão de células de câncer de bexiga
in vitro
Para investigar o papel do UHRF1 na regulação invasão de células, as linhas celulares de cancro da bexiga tratados com UHRF1 siRNA ou pcDNA-UHRF1 foram analisados. Em primeiro lugar, demonstrou se RT4 e células T24 pode ser utilizado como o
In vitro
modelo para investigar UHRF1 ensaiando a sua expressão em células RT4 ou T24 após sobre-expressão ou knockdown de UHRF1. A Figura 2A e C mostraram que o tratamento pcDNA-UHRF1 aumenta significativamente os níveis de UHRF1 em células RT4 não invasivos, enquanto o tratamento com siRNA UHRF1 diminui a expressão em células T24 UHRF1 invasivos. Além disso, a regulação positiva de UHRF1 promove a invasão de células RT4 (Figura 2B), ao passo que siRNA mediada silenciamento UHRF1 inibe a invasão de células T24 (Figura 2D). Estes resultados demonstraram que UHRF1 regula positivamente a invasão de células do cancro da bexiga.
células RT4 (A) foram tratados com pcDNA-UHRF1, e o nível relativo de UHRF1 foi analisada por PCR em tempo real. *
p Art 0,05. (B) UHRF1 foi sobre-expresso em células RT4, e ensaio de invasão foi realizada como descrito em Material e Métodos. figuras representativas de cada experiência são mostrados. Estes resultados mostram dados de cinco experiências independentes, expresso como a média ± DP. *
p Art 0,05. (C) As células T24 foram tratados com UHRF1 siRNA, e o nível relativo de UHRF1 foi analisada por PCR em tempo real. *
p Art 0,05. (D) Ensaio de Invasão foi realizada após UHRF1 knockdown. figuras representativas de cada experiência são mostrados. Estes resultados mostram dados de cinco experiências independentes, expresso como a média ± DP. *
p
. 0,05
UHRF1 aumenta a metilação de nucleotídeos CPG e reduz a expressão de KISS1
Estudos anteriores mostraram que KISS1 é frequentemente hipermetilado na bexiga câncer e está correlacionada com a progressão do câncer [12]. Aqui nós investigamos se UHRF1 regula a invasão de células de câncer de bexiga por silenciamento epigenético de KISS1. Nós primeiro ensaiadas se UHRF1 regula a expressão KISS1. Como mostrado na Figura 3A e B, a expressão forçada de UHRF1 inibe a expressão KISS1, enquanto knockdown de UHRF1 aumenta a expressão KISS1. Nós então testado o nível de expressão de UHRF1 e KISS1 em ambas as linhas de células de câncer de bexiga invasivo e linhas celulares de cancro da bexiga não invasivo. Figura 3C mostram que os níveis UHRF1 são relativamente mais elevada com baixos níveis de KISS1 simultâneas em linhas de células invasivas. A correlação negativa significativa também é observada entre os níveis de mRNA UHRF1 e os níveis de mRNA KISS1
in vivo
(
r
2 = 0,0648,
p
= 0,0063, Figura 3D). Nós investigou também se UHRF1 inibe a expressão KISS1 através do aumento da metilação de nucleotídeos CpG de
KISS1
. Analisamos o estado de metilação de ilhas CpG em KISS1 por seqüenciamento bissulfito, conforme relatado anteriormente [12], [15]. Os resultados do ensaio de metilação para o
KISS1
gene em 14 tecidos de cancro da bexiga e controles normais adjacentes estão resumidos na Figura 4A. seqüenciamento bissulfito revelou que
KISS1
frequência de metilação é significativamente aumentada em tecidos de cancro da bexiga em comparação com os controles adjacentes (Figura 4A). A análise de correlação mostrou que o
KISS1
nível de metilação é positivamente correlacionada com a expressão UHRF1 tanto em câncer de bexiga e tecidos da bexiga normais (Figura 4B, p = 0,0036, R
2 = 0,2091). análise de sequenciação de bissulfito mostrou ainda que a sobre-expressão UHRF1 aumenta a metilação de CpG nucleótidos de
KISS1
(Figura 4C, D). Estes resultados sugerem que suprime a expressão UHRF1 KISS1 por silenciamento de KISS1 epigenética.
(A e B) KISS1 nível de expressão foi analisada em células RT4 sobre-expressos com UHRF1 ou células T24 tratadas com UHRF1 siRNA. *
p Art 0,05. os níveis de (C) e UHRF1 KISS1 foram testados por PCR em tempo real em três não-invasiva e três linhas de células de cancro da bexiga invasivo. urothelial células normais foram utilizados como controle. *
p Art 0,05. (D) correlação negativa entre os níveis de mRNA UHRF1 e os níveis KISS1 em 24 amostras de cancro da bexiga (
r
2 = 0,0648,
p
= 0,0063).
(a) a análise de metilação do
KISS1
gene em 14 tecidos de cancro da bexiga e amostras normais adjacentes. A análise revelou que BSQ
KISS1
metilação frequência é significativamente aumentada com amostras de câncer de bexiga. ** P 0,01. é observado (B) A correlação positiva entre o
KISS1
metilação e expressão UHRF1 (R
2 = 0,2091, p = 0,0036). (C e D) Estado ilha CpG de metilação KISS1 foi analisado por sequenciação de bissulfito de células RT4. Nove clones individuais foram mostrados por linha celular. dinucleótidos CpG foram representados como quadrados escuros para citosinas metiladas e praças abertas para citosinas não metiladas.
UHRF1 aumenta a invasão de células de câncer de bexiga inibindo KISS1
UHRF1 diminui expressão KISS1 através do aumento da metilação do nucleotídeos CpG de
Kiss
e regulação negativa da KISS1 promove a invasão de células de câncer de bexiga. Portanto especulamos que o papel de UHRF1 na regulação da invasão de células é, em parte, mediada por KISS1. Nós primeira ensaiada se a inibição KISS1 aumenta a invasão de células de câncer de bexiga. Como mostrado na Figura 5A e B, knockdown de KISS1 promove a invasão de células RT4. Mais importante, a sobre-expressão KISS1 parcialmente inibe a invasão de células RT4-UHRF1 indução (Figura 5C e D). Estes resultados confirmam que UHRF1 promove a invasão de células de câncer de bexiga, pelo menos em parte, pelo silenciamento epigenético de KISS1. Células RT4
(A e B) foram tratados com KISS1-siRNA e ensaio de invasão foi realizada após KISS1 knockdown. figuras representativas de cada experiência são mostrados. Estes resultados mostram dados de cinco experiências independentes, expresso como a média ± DP. *
p Art 0,05. células RT4 (C e D) foram sobre-expresso com o UHRF1 UHRF1 ou mais KISS1, e ensaio de invasão foi realizada. *
P
. 0,05
Discussão
Nos mamíferos, a metilação do DNA ocorre na posição C5 da citosina no contexto de dinucleótidos CpG, resultando em cinco -methylcytosine (5mC) [18]. A modificação de DNA genómico por metilação é um sinal importante epigenética, e alterações no padrão de metilação do DNA ter sido um resultado consistente em vários tipos de tumores [19]. Estudos recentes mostraram que a herança epigenética de metilação do DNA requer UHRF1, que recruta DNMT1 para garfos de replicação de ADN através de uma actividade hemimethylated única CpG vinculativo [20]. Liu
et al
informou que UHRF1 recruta DNMT1 para a metilação de manutenção DNA através da ligação quer CpG hemi-metilado ou H3K9me2 /3, e que a presença de ambas as actividades de ligação garante alta fidelidade manutenção de metilação do DNA [20].
superexpressão UHRF1 está associada com os estágios tumorais e prediz mau prognóstico em vários tipos de câncer [21]. coordena UHRF1 PPARG (γ PPAR) silenciamento epigenético e medeia a progressão do cancro colorectal [22]. Knockdown de UHRF1 provoca PPARG re-ativação, acompanhada por marcas histonas positivos e desmetilação DNA, corroborando o seu papel na PPARG silenciamento. Babbio
et al
mostrou que UHRF1 contribui para o silenciamento do gene epigenético na progressão do cancro da próstata [23]. No presente estudo, verificou-se que os níveis de UHRF1 de expressão são significativamente aumentado na maioria dos tecidos de cancro da bexiga em comparação com controles normais adjacentes. Além disso, a expressão UHRF1 é significativamente aumentada nos tumores primários que subsequentemente metástase em comparação com tumores não-metastáticas. Nós também descobrimos que os níveis UHRF1 são relativamente mais elevados em linhas celulares de cancro da bexiga invasivo do que aqueles em os não-invasivos. Além disso, regulada positivamente UHRF1 promove a invasão de células RT4 não invasiva, enquanto que knockdown de UHRF1 inibe a invasão de células T24 invasiva. Estes dados demonstraram que a sobre-regulação de UHRF1 contribui para a invasão de células de cancro da bexiga.
KISS1 é um gene supressor de metástases de tumores em vários cancros. expressão KISS1 é marcadamente diminuída em tumores de bexiga invasivo em comparação com os seus respectivos urothelium normais [24]. Menor nível KISS1 está correlacionada com a sobrevida global em tumores de bexiga [24]. KISS1 é significativamente metilado. Inactivação de KISS1 por metilação do promotor é um evento pouco frequente no adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC) [25]. KISS1 também é epigeneticamente modificado no cancro colo-rectal, e a metilação KISS1 está associada com o grau do tumor, a recorrência e sobrevivência global previsto [15]. Aqui descobrimos que UHRF1 regula negativamente a expressão KISS1. níveis UHRF1 são relativamente mais elevados com baixos níveis simultâneos de KISS1 em linhas celulares de cancro da bexiga invasivo. A correlação negativa significativa também é observada entre os níveis de mRNA UHRF1 e os níveis de mRNA KISS1
in vivo
. seqüenciamento bissulfito mostrou que UHRF1 inibe a expressão KISS1 pelo aumento da metilação de nucleotídeos CpG de
KISS1
. Mais importante, KISS1 superexpressão em parte, inibe a invasão de células RT4 em células UHRF1-superexpressão.
Conclusão
Nossos dados mostraram que UHRF1 regulada positivamente contribui para a invasão de células de câncer de bexiga por silenciamento epigenético de KISS1.