Abstract
Fundo
Os microRNAs (miRNAs) são pequenos, não codificante RNAs (ácidos ribonucleico) que regulam a tradução. Vários miARNs ter sido mostrado a ser alterado no tecido de cancro do conjunto, em relação ao tecido normal, quando quantificados por microarranjo. Com base no anterior, as provas de expressão diferencial, optamos por estudar o significado funcional de miRNAs
miR-30a
e
-191
alterações no cancro do pulmão humano.
Metodologia /as principais conclusões
o significado funcional de miRNAs
miR-30a
e
-191
foi estudada através da criação de transfectantes estáveis da linha celular A549 adenocarcinoma de pulmão e da célula epitelial brônquica imortalizado linha BEAS-2B com superexpressão modesto de
miR-30a
ou
-191
usando um sistema lentiviral. Quando comparado com os controles correspondentes, ambas as linhas celulares superexpressão
miR-30a
ou
-191
não demonstram quaisquer alterações significativas na distribuição do ciclo celular, proliferação celular, formação de colônias aderentes, colónia de agar mole formação, a formação de um modelo de xenoenxerto em ratinho SCID subcutânea, e sensibilidade à droga doxorubicina e cisplatina. Há um modesto aumento na migração celular em linhas celulares superexpressão
miR-30a
comparados aos seus controles.
Conclusões /Significado
A superexpressão do
miR-30a
ou
-191
não conduz a uma alteração no ciclo celular, proliferação, formação de xenotransplante e quimio-sensibilidade de A549 e linhas de células BEAS-2B. Usando dados de microarranjos de tumores inteiros para selecionar miRNAs específicos para estudo funcional pode ser uma estratégia sub-óptima
Citation:. Patnaik SK, Kannisto E, Yendamuri S (2010) sobre-expressão de MicroRNA
miR-30a
ou
miR-191
em A549 do câncer pulmonar ou BEAS-2B normal pulmão linhas celulares não Altera fenótipo. PLoS ONE 5 (2): e9219. doi: 10.1371 /journal.pone.0009219
editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 11 de dezembro de 2009; Aceito: 24 de janeiro de 2010; Publicação: 15 de fevereiro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Patnaik et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é apoiado por bolsas de investigação da Fundação Thoracic Surgery para Pesquisa e Educação e da Câncer e leucemia Grupo B; SY é apoiado por uma bolsa da Fundação Buswell. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o significado de RNAs não-codificantes na regulação de processos celulares tem vindo a ser cada vez mais [1] apreciado. Os RNAs não-codificantes melhor estudados são microRNAs (miRNAs), 18-25 nt de comprimento pequeno RNA que epigenetically regular a tradução através da ligação a uma sequência complementar “semente” comum para o seu “target” mRNA [2]. Uma vez que esta complementaridade não tem de ser perfeito, um único miARN pode regular a expressão de várias centenas de genes simultaneamente [3]. A explosão da tecnologia de microarray levou à sua aplicação em genômica de miRNA. Por conseguinte, antes da função de uma proporção significativa de miARNs eram conhecidos, foram efectuadas de miARN perfis de vários tecidos humanos normais e anormais [4]. A diferença distinta entre os dados obtidos entre miARN perfilamento e ARNm de perfis é na magnitude da expressão diferencial visto nos grupos de comparação. Considerando que várias mudanças de dobragem são normalmente vistos na expressão de ARNm utilizando estas tecnologias, as mudanças de dobragem com experiências de miARN são mais modestos e estão tipicamente na gama de 1 a 2 vezes. Portanto, experimentos para estudar a relevância biológica destas mudanças dobra modestos são importantes para avaliar o significado dessas mudanças. Com base em dados de microarray de miARN anteriormente publicados que demonstram diferenças na expressão em cancros humanos em comparação com o tecido normal correspondente, dois miARNs foram escolhidos neste estudo para tais experiências biológicas. Estes dois miRNAs foram escolhidos por causa de alterações consistentes na sua expressão entre o tecido normal e canceroso de vários órgãos, uma análise bio-informática de suas metas previstas que sugeriu um papel importante na proliferação e migração celular e pouco trabalho publicado em seus papéis funcionais no cancro do pulmão .
miR-30a
está localizado no cromossomo humano 6q.13 e é gerado a partir de uma unidade de transcrição intrônica que produz três miRNAs:
miR-30a
,
-30C
e
-30e
[5]. Duas formas maduras do gene existe –
miR-30a-3p
e
miR-30a-5p
. Vários estudos têm detectado mudanças na expressão
miR-30a
no câncer humano. Calin et al. demonstraram uma diminuição da regulação da
miR-30a
em pacientes leucemia linfocítica crónica (CLL) [6]. Da mesma forma,
miR-30a
é regulada no cancro do pulmão [7], o cancro do cólon [8], câncer pancreático [9], câncer hepatocelular metastática (em comparação com primário) [10] e na leucemia mielóide aguda (AML) pacientes com pelo (11q23) translocação (em comparação com outros pacientes com LMA) [11].
miR-30a
é importante para o desenvolvimento do córtex pré-frontal através da regulação do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) [12] e no desenvolvimento de vertebrados hepatobiliar [13]. Outros confirmada experimentalmente alvos de
miR-30a Quais são adenilato-quinase (AK1) ea proteína GW182 (Tnrc6a), um componente da interferência de RNA silenciamento complexo [13].
MiR -191
está localizado no cromossomo humano 3p21.31 e é gerado a partir de uma unidade de transcrição intrônica que pode produzir dois miRNAs:
miR-191 Comprar e
-425
[5]. Apenas uma única forma madura de
miR-191
se sabe que existe.
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expressão é regulada para cima no pâncreas [14], cólon, pulmão e próstata [7] cânceres. Também é regulado para cima em pacientes com LMA com cariótipo anormal [11], e regulada para baixo em pacientes com LLC [6].
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expressão também é alterado nos pulmões expostos à fumaça do cigarro [15]. Não alvos de mRNA de
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foram verificados experimentalmente.
Neste estudo, avaliamos as alterações fenotípicas vistos por constitutiva sobre-expressão de
miR-30a Comprar e
-191
, sobre uma linha celular de adenocarcinoma de pulmão (A549) [16] e uma linha celular epitelial bronquial (BEAS-2B) imortalizada [17]. A linha celular A549 foi escolhido por causa da existência de uma grande quantidade de dados experimentais sobre a sua utilização em vários ensaios. A linha celular BEAS-2B foi escolhido porque é a linha de células imortalizadas mais próximo de epitélio brônquico normal. Como os efeitos da sobre-expressão de um microRNA é específico do contexto, foram comparadas as alterações no fenótipo de células malignas e não malignas.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Todos os estudos in vivo foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal do Instituto do Câncer Roswell Park.
Cultura de células
linhas de células de carcinoma de pulmão humano A549 bronquioloalveolar e BEAS-2B normais epiteliais brônquicas foram obtida a partir de ATCC (Manassas, VA). As células foram cultivadas, respectivamente, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM +; Invitrogen®, Carlsbad, CA) com 10% de soro bovino fetal (PAA Laboratories, Áustria), e LHC-9 médio (Invitrogen®) a 37 ° C em 5% de CO
2. As células estavelmente transf ectadas foram cultivadas na presença de 2 ug /ml de puromicina (Roche®, Indianapolis, IN).
A geração de linhas de células transfectadas de forma estável
oligonucleótidos de ADN de cadeia simples com humano
pré-miR-30a
ou
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(adesão miRBase IDs MI0000088 e MI0000465, respectivamente) sequências e com saliências local de enzima de restrição foram obtidos a partir Integrated DNA Technologies® (Coralville, IA). sequências complementares foram hibridados e o ADN de cadeia dupla resultante foi ligado com Xho I /Not I-vector digerido pLemiR ™ (Open Biosystems®, Huntsville, AL). As células A549 foram então infectadas com plasmídeos usando o sistema Trans-Lentivirus ™ GIPZ embalagem (Abertas Biosystems; Huntsville, AL), de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células TLA-HEK293TTM foram transfectadas utilizando parada-Na ™ com 37,5 ug de ADN de plasmídeo em meio isento de soro durante 4 horas. O meio foi então substituído com meio contendo soro durante 36 horas. Os meios foram recolhidos, centrifugados para remover detritos celulares e usado para transfectar células A549 e BEAS-2B. Quarenta e oito horas após a adição do vírus, foram seleccionadas células transfectadas pela adição de 2 ug /ml de puromicina para o meio de crescimento.
Tempo real de RT-PCR (qPCR) para a quantificação de pequenos RNAs
total RNA (20 ng), isolado a partir de células utilizando o kit PureLink ™ Micro-para-Midi total de isolamento de ARN (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante, foi transcrito de forma reversa utilizando TaqMan ™ kit de transcrição reversa (Biosystems® Aplicada, Foster City, CA) e iniciadores específicos de ARN fornecida com ensaios de TaqMan ™ microRNA (Biosystems® Aplicada) em 15 ul, com recozimento a 16 ° C durante 30 min seguida por extensão a 42 ° C durante 30 min. 1,33 mL da reacção RT foi então usado com 1 mL primers específicos para ambos os
RNU6B
,
miR-30a
, ou
miR-191
(Biosystems® Aplicada, Foster City, CA) em poços em triplicado de 44-ciclo de PCR em um termociclador 7900HT (Applied Biosystems®). O passo de desnaturação a 95 ° C foi de 15 s, e o passo de emparelhamento e extensão a 60 ° C foi de 1 minuto. software SDS (Biosystems® Aplicada, Foster City, CA) foi utilizado para determinar os valores de ciclo limiar (Ct) da fluorescência medidos durante a PCR. software 5.0b Prism (GraphPad®; La Jolla, CA) foi utilizado para a análise estatística e gráficos
Pathway Enriquecimento Análise
O software miRgator publicamente disponível (http: //genome.ewha.. ac.kr/miRGator/miRGator.html) foi utilizado para realizar a análise de enriquecimento via. Os miRNAs específicos selecionados foram
miR-191 Comprar e –
30a-5p
. O algoritmo de selecção do alvo escolhido foi miRanda [3]
celular Ensaio de Proliferação
ensaios de proliferação celular foram realizadas utilizando o kit celular Titer 96®. (Promega; Madison, WI), que utiliza a conversão de MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio, sal interno) em formazano para medir a viabilidade das células. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 4000 células em 100 uL por poço. As células foram colhidas em quadruplicado em vários pontos de tempo durante 150 horas. Para as células colhidas, foi adicionado 20 uL de reagente de ensaio e as células viáveis foram determinados por absorvância a 450 nm uma hora mais tarde um Multiskan Plus (LAB SYSTEMS MTX; Vienna, VA) leitor de placas. Os valores de absorvância foram normalizadas para controlo de meio.
Formação Aderente Colony
células em cultura foram tratadas com tripsina e plaqueadas em duplicado em placas de 6 poços a 200 células por poço e para A549 e 500 células por poço para linha de células derivados de BEAS-2B, respectivamente. As células foram deixadas a crescer a 37 ° C, 5% de CO2 com meios muda a cada 3-4 dias até as colónias eram visíveis a olho nu. O meio foi aspirado e as células foram coradas com 0,2% azul em 40% de metanol durante 30 minutos de metileno. As células foram lavadas e as placas foram digitalizados usando um scanner V700 Foto Epson Perfection como uma transparência. Quantificação de colônias foi feito usando software ImageJ (Research Services Branch, Instituto Nacional de Saúde Mental, Bethesda).
Formação macio Agar Colony Ensaio
agar Base /media mistura foi adicionada a 6 poços placas (concentração final de 0,7% de agar, 1x + DMEM, FBS a 10%, 2 ug /ml de puromicina) para revestir a placa e deixou-se polimerizar. Células foram feitas suspensões a 100 células /ml em meios mistura agar /(concentração final de 0,35% de agar, 1x + DMEM, FBS a 10%, 2 ug /ml de puromicina). 1,5 ml da suspensão de células foi semeada em agar de topo da base de em cada recipiente e deixados a polimerizar. 2 ml de meio completo foi adicionado no topo do agar, uma vez polimerizado. As placas foram postas em 37 ° C, 5% de CO2, e meios de comunicação de sobreposição foi trocado a cada 3-4 dias. As culturas foram cultivadas até que algumas colónias eram visíveis a olho nu, 2 mg /ml de azul de tiazolilo tetrazólio em PBS foi adicionado às células e foram devolvidas ao incubador, até as colónias foram coradas. Uma vez que as colónias foram coradas azul, a mancha foi removido dos poços e as fotos foram tiradas com a câmera de canhão Powershot A590IS.
In Vitro zero Ensaio
Para estimar diferenças na migração celular, um in-vitro ensaio de zero foi realizado. Mira foram desenhados no fundo de placas de 6 poços para orientação para imagiologia. As células foram plaqueadas em poços em triplicado de pelo alta densidade para atingir 100% de confluência 24 horas mais tarde. Um arranhão foi então feita diretamente ao lado da linha vertical traçada na placa usando uma pressão moderada e consistente usando uma ponta de 10 mL e a tampa placa como uma borda em linha reta. Arranhões foram fotografadas imediatamente em um microscópio Axio Observer (Zeiss; Maple Grove, MN) em 5X e orientação para a cruz observou. As células foram, em seguida, voltou a 37 ° C, 5% de CO2 e fotografada em vários pontos temporais até que todos os arranhões foram fechados.
Formação de Xenoenxerto Ensaio
in vivo Todos os estudos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee do Roswell Park Cancer Institute. Controlo e que sobre-expressam linhas de células A549 (6,0 x 105 células) foram injectados por via subcutânea entre as omoplatas de murganhos SCID de 4-5 semanas de idade (5 murganhos em cada grupo). Os tumores foram monitorizados 2-3 vezes por semana por medições de calibre até que a maior tumor foi de 2 cm em sentido mais longo, altura em que todos os ratinhos foram sacrificados. Os tumores foram dissecados e pesados.
análise do ciclo celular
Células cultivadas em 70% -90% de confluência foram descoladas por tripsinização, fixados em 70% de etanol a 4 ° C durante 1-2 dias, lavou-se com PBS, e incubou-se a uma densidade de 1-2 x 10
6 células /ml com 0,3