Abstract

Acumulando a evidência indica que as células cancerosas epiteliais, incluindo carcinoma da nasofaringe (NPC) células, imunoglobulinas expressas (Ig). Nós encontramos anteriormente de que a expressão da proteína da cadeia leve kapa em células NPC pode ser regulada positivamente pela proteína de membrana codificada latente de EBV-1 (LMP1). No presente estudo, utilizou-se linhas celulares NPC como modelos e constatou que a produção de kappa aumentada-LMP1 corresponde a elevações de ERK fosforilação. PD98059 atenua induzida por LMP1 fosforilação ERK resultando em diminuição da expressão da cadeia leve kapa. pequena interferência RNA específico do ERK embota LMP1 induzida por

leve kappa de cadeia

expressão do gene. ensaios de repórter de luciferase demonstrar que imunoglobulina

κ Sims 3 ‘potenciador (3’E

κ) é ativo em células NPC Igκ expressam e LMP1 regula positivamente a actividade de 3’E

κ em células de NPC. Além disso, a análise de mutações de local de ligação de PU em 3’E

κ e inibição da via de MEK /ERK por PD98059 indicam que o local de PU é funcional e-LMP1 reforçada 3’E

κ actividade é em parte regulada por esse site. PD98059 tratamento também conduz a uma inibição dependente da concentração da ETS-1 induzida por expressão e fosforilação de LMP1, o que corresponde a uma atenuação, dependente da dose de fosforilação de ERK induzida por LMP1 e expressão da cadeia leve kapa. Supressão de endógena

Ets-1 | pelo pequeno RNA interferente é acompanhada por uma diminuição da expressão da cadeia leve de Ig kappa. ensaios de desvio em gel, utilizando extractos nucleares de células NPC indicam que o fator de transcrição Ets-1 é recrutado por LMP1 ao motivo PU dentro 3’E

κ

in vitro

. ChIP ensaios demonstram ainda Ets-1 se ligar ao motivo de PU 3’E

κ em células. Estes resultados sugerem que regula positivamente a LMP1

actividade κ 3’E e

kapa

a expressão do gene através da activação do factor de transcrição Ets-1 através da via de sinalização de ERK. Nossos estudos fornecem evidências de um novo mecanismo de regulação da expressão kappa, pelo qual as proteínas codificadas pelo vírus ativar o

kappa

3 ‘potenciador através da activação dos factores de transcrição em células cancerosas epiteliais não-B.

Citation : Liu H, Duan Z, Zheng H, Hu D, Li M, Tao Y, et al. (2012) LMP1 codificado-EBV regula positivamente Ig

κ

3’Enhancer Actividade e Ig

κ

expressão em células de carcinoma da nasofaringe, ativando o Ets-1 a ERK sinalização. PLoS ONE 7 (3): e32624. doi: 10.1371 /journal.pone.0032624

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de julho de 2011; Aceite: 1 de fevereiro de 2012; Publicação: 01 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Plano de Estado-chave de Pesquisa básica e Desenvolvimento (973) do Ministério da Ciência e Tecnologia da China (No. 2004CB518703), Pesquisa Nacional de Tecnologia alta Programa de Desenvolvimento e (863) da China (No. 02A 2006AA 404) e Nacional Nature Science Foundation da China (No. 30.471.968, No. 30.973.399). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a restrição da expressão de imunoglobulina (Ig) de células da linhagem de células B está bem estabelecida. No entanto, verificou-se Ig de cadeia leve kappa foi “inesperadamente” expresso em linhas celulares de cancro epiteliais e tecidos epiteliais [1], [2], [3]. A expressão de Ig de cadeia leve kappa em linhas de células de tumor não-hematopoiéticas também foi relatada por outros laboratórios [4], [5], [6], [7].

Imunoglobulina

cadeia leve kappa

expressão do gene está sob o controlo de elementos distintos cis-reguladoras, incluindo promotores e intensificadores. Dois importantes

kappa

potenciadores: o potenciador intrônica (IE

κ), que se situa entre o J

κ-C

κ região e do potenciador 3 ‘(3’E

κ), que está localizado a jusante do C

κ região, foram identificados [8], [9], [10]. Ambos os potenciadores estão inativos nas fases de células pró-B e pré-B e ativo nas Igκ expressando fases de células B e células plasmáticas maduras [10], [11]. A actividade destes potenciadores geralmente é transcricionalmente silencioso em outras células que não conseguem produzir a cadeia kapa, tais como as células T-linfóides (Jurkat) [10], as células epiteliais (HeLa) [10] e fibroblastos NIH3T3 [12]. Com base nestas observações, a ativação desses elementos reguladores que geralmente se acredita ser necessário para

imunoglobulina kappa expressão do gene

e é uma restrição de linhagem evento células B [10]. Curiosamente, verificou-se que humana ou seja,

κ é activa em Igκ-expressando linhas celulares de carcinoma nasofaríngeo (CNP), que é importante para a expressão da cadeia leve capa nestas células [13]. No entanto, se os outros

kappa

potenciador, 3’E

κ, é funcional em Igκ-expressando células cancerosas epiteliais permanece desconhecida.

A função de promotores é mediado por DNA proteínas de ligação que são recrutados para os elementos regulatórios dos intensificadores. Vários elementos reguladores positivos foram identificados em 3’E

κ, incluindo um motivo de consenso PU (TTTGGGGAA) para proteínas relacionadas com o factor de transcrição Ets-[10]. A família Ets compreende várias subfamílias, incluindo ETS (ETS-1, Ets-2), TCF (Elk-1, SAP-1, etc.) e SPI (PU.1, Spi-B, SPI-C etc.) . Os membros da família são identificados com base na sua composição estrutural e suas semelhanças nos domínios Ets evolutivamente conservadas que medeiam a ligação de sequências de DNA ricos em purinas com um GGAA centro /T núcleo consenso [14], [15]. As proteínas da família Ets são proteínas nucleares e fosforilação é uma modificação importante pós-traducional de diversos membros da família Ets, que pode afectar as suas actividades de transcrição e as actividades de ligação de ADN [15]. Em células B, a ligação da proteína PU.1 para o intensificador de kapa 3 ‘desempenham um papel importante na 3’E

função κ [16]. A fosforilação de PU.1 a Ser148 é necessário para a interacção de PU.1 com a semente no ADN e esta fosforilação pode regular a actividade transcricional de PU.1 [17]. No entanto, a proteína PU.1 é expresso exclusivamente em células hematopoiéticas [15], [18] e é pouco provável para executar a função reguladora em Igκ-expressando células cancerosas epiteliais. estudo recente usando imunoprecipitação da cromatina juntamente com microarrays promotores de todo o genoma para consultar a ocupação de três proteínas ETS em uma linha de células T humanas, revelou que a ocupação redundante foi frequentemente detectado, enquanto a ocupação específica era menos provável [19]. Assim, podemos especular que, se 3’E

κ é realmente funcional em Igκ-expressando células cancerosas epiteliais, outras proteínas da família Ets são mais propensos a ter um papel na 3’E

atividade κ que PU.1 . Portanto, decidimos investigar mais esse fator de transcrição que (s) vinculada ao site da PU ligação de 3’E

κ e se a ligação é importante para 3’E

κ activação funcional em Ig kappa-expressando epitelial células cancerosas.

o nosso estudo anterior mostrou que o

gene kappa de cadeia leve

foi expressa em NPC e outras células tumorais epiteliais. Mais interessante, verificou-se que os níveis da cadeia leve kappa eram substancialmente mais elevada em células LMP1-positiva em comparação com células LMP1-negativos [2]. Devido à sua transformação e actividades tumorigénicas, LMP1 é considerado uma grande proteína oncogénica codificados pelo EBV. LMP1 medeia uma variedade de vias de sinalização celulares, incluindo NF-kB, C-Jun-NH

quinases 2-terminal (JNK), p38 /MAPK, PI3K /Akt e JAK /STAT e faz com que sobre-regulação da transcrição de vários genes celulares, tais como

IL-6, IL-8, Bcl-2, CD23, A20

e

EGFR

[20], [21], [22]. LMP1 também pode ativar a via de sinalização /ERK /MAPK Ras [23], eo Ras /MAPK quinases de sinalização, Raf, MEK e ERK, são ativados nas células epiteliais da nasofaringe expressando LMP1 [24]. Além disso, Kim [25] relatou que a transfecção estável da

LMP1

gene em células MDCK expressão de Ets-1 induzido, sugerindo que

Ets

pode ser um gene alvo de LMP1. Como mencionado acima, a ETS-1 e Ets-2 são membros da subfamília de proteínas relacionadas com o Ets. Ambos são alvos nucleares da via Ras e a fosforilação de resíduos de treonina conservada, Thr38 e Thr72 de sinalização, é um evento molecular necessário para a activação de Ras-mediada destes factores de transcrição [26]. Cumulativamente, um LMP1 /ERK /ETS /kappa cascata de sinalização pode existir pelo qual LMP1 regula positivamente kappa expressão da cadeia leve em células de NPC.

No presente estudo, o inibidor de MEK, PD98059, foi usado para investigar o papel do a via de ERK em kappa de produção de cadeia leve-LMP1 reforçada em células de NPC. Os dados aqui apresentados demonstram que a produção de kappa aumentada-LMP1 corresponde a elevações de ERK fosforilação. PD98059 inibe a fosforilação induzida por LMP1 ERKs resultando em diminuição da expressão da cadeia leve kapa. pequena interferência RNA específico do ERK embota LMP1 induzida por

leve kappa de cadeia

expressão do gene. ensaios de repórter de luciferase demonstrar que 3’E

κ é ativo em Igκ células que expressam APN e expressão LMP1 estável regula positivamente a actividade de 3’E

κ em células de NPC. Mutações do sítio de ligação do PU na 3’E

k diminuir significativamente

atividade κ-LMP1 reforçada 3’E. 3’E induzida por LMP1

κ actividade é drasticamente inibida pelo inibidor da cinase a montante ERK, PD98059. O tratamento de PD98059, também conduz a uma inibição dependente da concentração da ETS-1 induzida por expressão e fosforilação de LMP1, o que corresponde a uma atenuação, dependente da dose de fosforilação de ERK induzida por LMP1 e expressão da cadeia leve kapa. O knockdown da endógena

Ets-1 | pelo pequeno RNA interferente é acompanhada por uma diminuição da expressão da cadeia leve de Ig kappa. ensaios de desvio em gel, utilizando extractos nucleares preparados a partir de várias linhas de células NPC confirmar que o fator de transcrição Ets-1 é recrutado por LMP1 ao motivo PU do humano

cadeia leve kappa

gene. ChIP ensaios demonstram ainda que Ets-1 se liga directamente ao motivo de PU 3’E

κ em células. Estes resultados sugerem que regula positivamente a LMP1

actividade κ 3’E e

de cadeia leve kapa

a expressão do gene através da activação do factor de transcrição Ets-1 através da via de sinalização de ERK.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura de células

HNE2 é uma linha celular humana NPC-EBV-LMP1 negativo. HNE2-LMP1 é uma linha de células que expressa constitutivamente LMP1 após a introdução de todo o comprimento

LMP1

ADNc em HNE2 células [27]. As linhas celulares de mieloma humano, XG6, que expressa a cadeia leve citoplasmática λ, e XG7 que expressa a cadeia leve citoplasmática κ [28], foram utilizados como a cadeia kapa controlos negativos e positivos, respectivamente. Raji é uma linha celular de linfoma de células B humano de Burkitt. Todas as linhas celulares foram mantidas em RPMI1640 (Gibco, EUA) suplementado com 10% de FBS (Gibco, EUA), 1% de glutamina, 1% e antibióticos numa atmosfera humidificada a 37 ° C que contém 5% de CO

2. Para as células XG6 e XG7, 1 ng /ml de rIL-6 (Sigma, St. Louis, MO) foi adicionada a meio RPMI 1640 suplementado como descrito anteriormente [28]. As células em fase logarítmica de crescimento foram utilizadas em todas as experiências.

de produtos químicos e os tratamentos com células

O inibidor da quinase MEK a montante ERK, PD98059 (Cell Signaling, EUA), foi preparado como uma solução estoque de 20 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO, Sigma). As células subconfluentes foram tratados com o composto a várias concentrações para diferentes tempos. procedimentos de tratamento detalhado estão descritos nas legendas das figuras. A concentração final de DMSO no meio de cultura foi mantida a menos do que 0,1%, que não teve nenhum efeito significativo sobre o crescimento celular. comandos do veículo foram preparados para todos os tratamentos.

Os plasmídeos

O humano

β-globina

promotor era um de 128 bp promotor mínimo idêntico ao utilizado anteriormente [29]. O promotor foi obtido através de amplificação a partir de ADN genómico humano HNE2 celular com os seguintes iniciadores: sentido, a 5 ‘-

gagctc

acggctgtcatcacttagacctcac-3′, que contém o

Sac I

sítio de clonagem; anti-sentido, a 5 ‘-

AAGCTT

taagcaatagatggctctgccctgac-3′, que contém o

Hind III

local. O fragmento foi inserido no

Sac I /Hind III

locais da

pGL3-Basic

vector (Promega, Madison, WI) e o plasmídeo foi designado como o

pGL3-β

.

Um fragmento de 313 pb contendo o 3’E humano

núcleo κ potenciador e 90 pb a montante das sequências núcleo potenciador [10], [30], [31] foi clonado. O 3’E

fragmento κ potenciador foi amplificado a partir de DNA genómico celular HNE2 por PCR utilizando iniciadores específicos do humano

gene de Ig kapa

(acesso do GenBank NG_000834.): Sentido, a 5 ‘-

GGATCC

cctcttggtaccccagcata-3 ‘, que contém uma artificial

BamH I

local; antisense, 5′-

GTCGAC

ctgaaagggtgtggagtgct-3 ‘, que contém uma artificial

Sal I

site. Os fragmentos amplificados por PCR foram, em seguida, digerido com

BamH I /Sal I

e inserido nos locais de restrição correspondentes de

pGL3-β

plasmídeo descrito acima, para gerar

pβ-3 ‘ E

κwt

. Os produtos de PCR foram confirmados pelo seu tamanho, conforme determinado por electroforese e por sequenciação de ADN. O mutante motivo PU (designado como

pβ-3’E

κmt

) a partir de

pβ-3’E

κwt

foi gerado por PCR com base em uma técnica de extensão de sobreposição [ ,,,0],32]. Os iniciadores utilizados para a geração de mutações foram: para a frente, 5′-accctttgggcccctgaaaacagaacc-3 ‘; reverso, 5’-ttttcaggggcccaaagggtcttctcc-3 ‘. Os fragmentos amplificados por PCR que transportam as mutações desejadas foram então clonados no

BamH I /Sal I

sítios de o

pGL3-β

plasmídeo. As mutações esperados e a integridade do intensificador foi confirmada por sequenciação automática utilizando um sequenciador Applied Biosystems e o software (Foster City, CA).

Células

ARN interferência

HNE2-LMP1 foram cultivadas em 6 placas -bem e transfectadas com um pequeno oligonucleotídeo interferência RNA específico do ERK (si-ERK; Cat não: # 6560; 100 pmol; Cell Signaling) ou oligonucleotídeos mexidos (si-mexidos; Cat não: # 6568; 100 pmol; Cell Signaling ); uma pequena interferindo oligonucleotídeo RNA Ets-1-específico (si-Ets-1; Cat não: SC-29309; 150 pmol; Santa Cruz) ou mexidos oligonucleotídeos (si-mexidos; Cat não: sc-37007; 150 pmol; Santa Cruz ) usando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, EUA) durante 72 horas de acordo com as instruções do fabricante. Para confirmar ERK ou Ets-1 knockdown, as células transfectadas com si-ERK, si-Ets-1, ou oligonucleotídeo mexidos foram colhidas para extração de proteínas e immunoblotting.

ensaios de repórter de luciferase

O

pGL3-β, pβ-3’E

κwt

e

pβ-3’E

κmt

pirilampo plasmídeos repórter luciferase acima descritos foram usados ​​em conjunto com o controle de

pGL3-Basic vector

(Promega) e o plasmídeo de controlo interno

pRL-SV40

(Promega). As células foram cultivadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1 x 10

5 por poço durante a noite e, em seguida, transfectadas com o plasmídeo indicado utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. Cada transfecção continha 800 ng /cavidade do plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo e 80 ng /cavidade do controlo interno

pRL-SV40

plasmídeo. Às 24 h após a transfecção, as células foram deixadas não tratadas ou tratadas com 50? M PD98059 ou 0,1% de DMSO durante 12 horas. As células foram colhidas às 36 h após a transfecção e os lisados ​​foram analisados ​​por vaga-lume e

Renilla

actividade da luciferase de acordo com as instruções do fabricante utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) com um luminómetro GloMax 20/20 (Promega) . Os plasmídeos repórter da luciferase foram co-transfectadas com o

pRL-SV40

vector para corrigir as variações na eficiência de transfecção. Os dados estão representados como a indução de dobragem em comparação com o

pGL3-Basic vector

. Pelo menos três experiências de transfecção independentes foram realizadas em triplicata para cada construção experimental.

A transcrição reversa e da polimerase em cadeia reação

células subconfluentes HNE2 e HNE2-LMP1 foram tratados ou não tratados com 50 mM PD98059 para 12 hr. O ARN total foi isolado a partir das células, incluindo XG6, XG7 ou linhas de células de Raji como controlos, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA foi dissolvido em 20 uL de água tratada com DEPC e quantificada a 260 nm. O ARN total (2 ug) foi transcrito de forma inversa com SuperScript ™ IIRT (Invitrogen) a 42 ° C durante 50 min, e o cDNA resultante foi sujeito a PCR. Para

de cadeia leve kapa

de RT-PCR, a fim de determinar o número de ciclos de PCR optimizada, uma quantidade constante de ADNc de entrada foi usado em reacções de PCR, o número de ciclos foi variada entre 25 e 40 (25, 28, 32, 36, 38, 40) e o produto de PCR de 36 ciclos apresentaram um bom sinal detectável e foi na gama linear. As condições de ciclismo para

kappa humano de cadeia leve

(GenBank AJ010442 sem.) Ou para

actina

: 94 ° C durante 5 min seguido por 36 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 50 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg, e uma extensão de 10 min a 72 ° C. condições de ciclos térmicos de PCR para os membros da família Ets, LMP1 e de GAPDH são 95 ° C durante 5 min seguido por 32 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 40 seg, e uma extensão de 10 min a 72 ° C. Para quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR), iTaq SYBR Green Supermix com ROX foi usado com as seguintes condições de ciclo (N ° Cat 172-5850, Bio-Rad..): 95 ° C durante 10 min, em seguida 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos seguido por 60 ° C durante 1 min num Prism 7500 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems). Os níveis de expressão de ARNm relativos foram calculados de acordo com o método comparativo CT (ΔΔCT) depois da normalização para a expressão de GAPDH. As sequências dos iniciadores para a amplificação de Ig da cadeia leve kapa, membros da família Ets [33], LMP1 [34] e controlos internos estão listados na Tabela S1. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 1,5-2% e visualizado com brometo de etídio.

Proteína extracção

lisados ​​de células inteiras foram preparados essencialmente de acordo com um método previamente descrito [2]. Para os ensaios de deslocamento da mobilidade electroforese (EMSAs), extractos nucleares foram preparados utilizando o Kit de NE-PER nuclear e citoplasmática da extracção (Cat. No. 78833, Pierce, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A concentração de proteína foi determinada usando o reagente de ensaio BCA (Cat. no. 23228, Pierce).

Western blot análise

Proteínas (50 a 100 pg) foram fervidas em tampão de amostra de SDS durante 5 min , resolvidas em géis de 10% SDS-poliacrilamida e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Millipore, EUA). reactividade não específica foi bloqueada por incubação da membrana durante 30 minutos numa solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de leite seco de Tween-20 e 10% sem gordura. A membrana foi incubada durante a noite a 4 ° C com vários anticorpos primários, seguido por incubação à temperatura ambiente durante 1 h com um rato conjugado com peroxidase de rábano ou um anticorpo secundário de coelho (Santa Cruz, EUA), e, em seguida, lavada três vezes durante 10 minutos cada com solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20. As proteínas ligadas a anticorpo foram detectados utilizando um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Cat. No. 34075, Pierce) seguido por exposição a filme de autorradiografia. Depois de sondagem para ERK fosforilada ou fosforilada Ets-1 para examinar ERKs estado de activação ou o nível de fosforiladas Ets-1, as membranas foram retirados por incubação a 50 ° C durante 30 min em decapagem tampão (mM β-mercaptoetanol 100, 2% (em peso /vol) de sulfato de dodecilo de sódio e Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8) e sondado com anticorpos anti-ERK ou anti-ETS-1. Os anticorpos seguintes foram utilizados para a transferência de Western: monoclonal de ratinho anti-anticorpo de LMP1 (CS.1-4, DAKO, Dinamarca), anticorpo de coelho anti-cadeia leve kapa humana (A0191, DAKO), Ets-1 (SC-350), treoninas fosforilados (sc-5267), ERK (SC-93), ERK fosforilada (sc-7383), e α-tubulina (sc-5286) (todos da Santa Cruz).

p> lisados ​​de células inteiras (200 ug) foram misturados com esferas de proteína a-Sepharose (Sigma), incubada a 4 ° C durante 2 h, e centrifugado durante 2 min a 2000 rpm durante preclearing. Em seguida, a fracção de sobrenadante foi incubado a 4 ° C durante a noite com 4 ug de um ETS-1 de anticorpos e esferas de proteína A-Sepharose, seguida por centrifugação durante 2 min a 12000 rpm. Os imunoprecipitados foram recolhidos e lavados cinco vezes com tampão de PAPI (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, contendo 1% de NP-40, 0,05% de SDS, 0,5% de desoxicolato de sódio, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, e inibidores de protease). Os precipitados foram eluídas das esferas de proteína A-Sepharose por ebulição durante 5 min e, finalmente, submetido a análise de Western blot utilizando um anticorpo para detectar a fosforilação treonina.

electroforéticas ensaios de mudança de mobilidade de desvio de mobilidade

electroforética os ensaios (EMSAs) foram conduzidas utilizando o Kit ™ LightShift quimioluminescente EMSA (Cat. no. 20148, Pierce) seguindo as instruções do fabricante. A concentração da proteína nos extractos nucleares foi determinada usando o reagente de ensaio de proteína BCA (Cat. No. 23228, Pierce) e EMSAs foram realizados utilizando aliquotas contendo quantidades iguais de proteína. As misturas reaccionais (20 ul) contendo extractos nucleares (8 ug) foram incubadas com as sondas marcadas com biotina de cadeia dupla de oligonucleótido (2 nM) em tampão de reacção (Pierce) durante 20 min à temperatura ambiente. As reacções foram sujeitos a electroforese em géis de poliacrilamida a 5% em 0,5 × tampão Tris-borato-ácido etilenodiaminotetra-acético (TBE) Tampão seguido de electrotransferência para membranas Biodyne ™ B de nylon (Cat. No. 77016, Pierce) e UV reticulação . oligonucleótidos biotinilados foram então detectado por sondagem com estreptavidina conjugada com HRP e visualizadas utilizando um kit ECL e autorradiografia. Para as análises de competição, um excesso de 100 vezes do correspondente tipo selvagem não marcada-oligo ou o oligo mutante foi incluída na reacção de ligação. Para as experiências de supershift de anticorpos, as misturas da reacção foram pré-incubadas com 2 ug de um anticorpo Ets-1 (SC-350X, Santa Cruz) à temperatura ambiente durante 1 h. Os oligonucleótidos complementares utilizados como sondas ou concorrentes são os seguintes: de tipo selvagem oligonucleótidos κPU humanos, 5′-gaagaccctttggggaactgaaaacaga-3 ‘e 5′-tctgttttcagttccccaaagggtcttc-3’, derivada da sequência do sítio de PU dentro do 3’E humano

κ. Os oligonucleótidos mutados κPU (designados como mutPU) utilizados foram 5′-gaagaccctttgggcccctgaaaacaga-3 ‘e 5′-tctgttttcaggggcccaaagggtcttc-3’. As sondas concorrentes não específicos foram 5′-ccagagggggatttccaagaggcca-3 ‘e 5′-tggcctcttggaaatccccctctgg-3’, que foram derivados a partir da sequência do sítio de NF-kB dentro do ser humano ou seja,

κ. locais de ligação estão sublinhadas e as mutações são mostradas em negrito. As sondas de oligo mutadas contra o sítio de ligação para κPU EMSAs são idênticos aos das sequências mutadas nas construções de gene repórter.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio

análise chip foi realizada utilizando um chip kit de ensaio (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, uma solução de formaldeído foi adicionada directamente a células HNE2-LMP1 a uma concentração final de 1% e incubou-se à temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, as células foram neutralizados durante 5 minutos com glicina à temperatura ambiente e lavou-se duas vezes com inibidores de protease geladas 1 × solução salina tamponada com fosfato contendo. As células foram rebentadas utilizando tampão de lise de SDS contendo inibidores de protease. Cromatina no lisado (350 mL) foi cortado para um comprimento médio de -500 pb por sonicação com um celular sonicador Branson Disruptor B15 (controle de saída 4, ciclo de trabalho de 40%), com 14 ciclos de pulsos de 20 seg a 20 seg intervalos. A suspensão foi pré-aclarados num ADN de esperma de salmão /proteína A /agarose-50% de pasta durante 1 hora a 4 ° C. Depois da cromatina foi “pré-aclarados”, uma pequena aliquota (10 uL) foi guardado como “ADN de entrada” para análise de PCR mais tarde. As alíquotas restantes (100 uL cada) de cromatina reticulado tosquiada foram incubadas durante a noite com 2? G ETS-1 (SC-350X), IgG de coelho (sc-2027) (Santa Cruz), ou sem anticorpo, a 4 ° C com ligeira tremer. Os complexos imunes foram incubadas durante 2 horas a 4 ° C num ADN de esperma de salmão /proteína A /agarose-50% de pasta com agitação suave, lavados, e eluídos. A reticulação foi revertida utilizando 5 M de NaCl. Após digestão com proteinase K, o ADN presente nas amostras foi extraída com fenol, precipitado com etanol e ressuspenso em 50 ul de DDH

2O. A solução de ADN (2 mL) foi utilizado para 36 ciclos de amplificação por PCR. Os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese num gel de agarose a 2% e visualizados por coloração com brometo de etídio. Os seguintes iniciadores foram utilizados nos ensaios de ChIP:. 3’E humano

κ potenciador incluindo a região de ligação ao PU, 5′-ccagggaccaagatagcaac -3 ‘e 5′-ctgaaagggtgtggagtgct -3’ (158 pb)

a análise estatística

Todos os cálculos estatísticos foram realizados usando o SPSS (v. 12.0) estatística programa de software. Diferenças entre os vários grupos foram avaliados pelo

t

teste de Student. A diferença foi estatisticamente significativo quando

p

. 0,05

Resultados

LMP1 aumenta a expressão da cadeia leve kappa através da via de sinalização ERK em células NPC humanos

LMP1 pode activar a via de sinalização /ERK /MAPK Ras [23] e o nosso estudo anterior indicou que LMP1 regula positivamente a expressão da cadeia leve kapa em linhas celulares de NPC [2]. Para confirmar se ERK via é envolver na expressão da cadeia leve kappa aumentada-LMP1, PD98059 foi usado para manipular a ativação ERK e upregulation cadeia kappa induzida por LMP1. O nível de fosforilação de ERK foi maior em células HNE2-LMP1 do que em células HNE2, demonstrando que a LMP1, de facto activa a via de ERK em células NPCs (Figura 1A). O tratamento de células HNE2-LMP1 com PD98059 resultou numa supressão dependente da dose da cadeia leve kapa induzida por LMP1 (Figura 1B), o que correspondeu com uma atenuação, dependente da dose de fosforilação de ERK induzida por LMP1 (Figura 1A). PD98059 (50 | iM) mostrou claramente um efeito inibitório sobre as células HNE2-LMP1, mas não teve nenhum efeito sobre as células HNE2 (Figura 1C). A fim de determinar se a inibição da expressão de kapa de Ig por tratamento PD98059 ocorre ao nível da transcrição, células HNE2 e HNE2-LMP1 foram mantidos sob as mesmas condições e os níveis de

de cadeia leve kapa

ARNm foram examinados por RT -PCR. O tratamento com PD98059 (50? M) induziu uma acentuada diminuição na

kappa

expressão de mRNA induzido por LMP1, mas o

kappa

nível de mRNA em HNE2 permaneceu essencialmente inalterada (Figura 1D), que concorda com a resultados immunoblot. Para confirmar ainda que a via de ERK desempenha um papel na induzida por LMP1

de cadeia leve kapa

expressão do gene, que derrubado

ERK

expressão por interferência de ARN. Considerando que a transfecção de células HNE2-LMP1 com um oligonucleótido mexidos não afectou induzida por LMP1

expressão do gene kapa

,

Si-ERK

embotada o efeito de LMP1 (Figura 1E), indicando que a ERK via é envolvido neste caso. No geral, estes resultados confirmam a ideia de que a regulação positiva de cadeia leve kapa de LMP1 ocorre através da activação da via de ERK /MAPK sinalização.

células HNE2-LMP1 (A) foram tratados com as concentrações indicadas de PD98059 ou 0,1 % de DMSO durante 2 horas. Os lisados ​​celulares totais foram preparados e os níveis totais e fosforiladas ERK foram determinados por Western blotting. (B) As células HNE2-LMP1 foram tratados com as concentrações indicadas de PD98059 ou 0,1% de DMSO durante 12 horas. de expressão da cadeia leve Kappa em células NPC foi avaliada por Western blotting utilizando um anticorpo específico. células HNE2-LMP1 (C) HNE2 e foram tratados com PD98059 50 uM ou 0,1% de DMSO durante 12 horas e transferência de Western foi realizada para detectar a expressão da cadeia leve kapa. (D) As células HNE2 e HNE2-LMP1 foram incubadas com meio contendo a concentração indicada de PD98059 ou 0,1% de DMSO durante 12 horas. O ARN total foi isolado a partir de células e submetido a RT-PCR, utilizando iniciadores específicos desenhados para amplificar

de cadeia leve kapa

e

actina

mRNAs. células HNE2-LMP1 (E) foram transfectadas com

si-ERK

ou oligonucleotídeo mexidos. Os níveis de proteína ERK e Ig kappa foram detectados por immunoblotting. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. A fosforilação ou nível de expressão de proteína total de cada, bem como ARNm foi estimada por densitometria e são apresentados como uma razão para o respectivo controlo de carga (painéis da direita). células XG7 e XG6 são mostradas como controlos positivos e negativos, respectivamente, para a cadeia leve kapa.

O local de ligação de PU está envolvido na actividade de LMP1 aumentada de 3’Eκ através da via de ERK

a ativação do 3’E

κ é necessário para

imunoglobulina kappa expressão

gene. A fim de investigar se 3’E

κ poderia ser funcionalmente activado em células NPC, ligámos

fragmento κ intensificador de 313 pb humano 3’E, que contém o núcleo potenciador e 90 pb a montante das sequências núcleo potenciador que é necessário para a actividade potenciadora máxima quando o núcleo potenciador não é directamente adjacente ao promotor [31], ao humano

β-globina

promotor para conduzir a expressão do gene da luciferase do pirilampo e analisadas por esta construção repórter transiente transfecção de linhas celulares de NPCs (Figura 2A, B). O ser humano

β-globina

promotor foi escolhido porque ele já tiver sido utilizado por vários estudos de potenciadores de imunoglobulina [35], [36], [37], e também porque nós achamos que seja minimamente afetado pela LMP1 nas nossas experiências (Figura 2C e na Figura 3). As construções foram introduzidas em células HNE2 e HNE2-LMP1 para testar a actividade de 3’E

κ. Transfecção de

pβ-3’E

κwt

gerado maior atividade luciferase de transfecção do

pGL3-β

construção (sem potenciador), independentemente de LMP1-negativas (

p Art 0,05) ou LMP1-positivo (

p Art 0,01) células NPC foram examinados. Estes resultados indicaram que 3’E

κ é activa em células que expressam APN da cadeia leve capa de Ig. Além disso, a actividade de 3’E

κ em células HNE2-LMP1 foi aproximadamente 3 vezes maior do que em células HNE2 (

P

0,05) (Figura 2C), que concordou com o kappa estes padrões de duas linhas de células de expressão da cadeia [2]. Notavelmente, a actividade de luciferase de

pGL3-β

em ambas as células HNE2 e HNE2-LMP1 era essencialmente equivalente, o que sugeriu que a diferença na 3’E

actividade κ entre células HNE2 e HNE2-LMP1 Foi Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.