Sumário

ETV1

é abundante em um subgrupo de cancros da próstata clínicos como uma transcrição de fusão com muitos parceiros diferentes. No entanto,

ETV1

também pode ser sobre-expresso como um transcrito de comprimento completo. funções das proteínas ETV1 Full-length diferente de ETV1 truncado produzido por genes de fusão. Neste estudo descrevemos o fundo genético de full-length

ETV1

superexpressão e as propriedades biológicas de diferentes isoformas ETV1 full-length no câncer de próstata. FISH quebrar-apart mostrou em cinco das seis amostras de pacientes com superexpressão de full-length

ETV1

um rearranjo genómico do gene, indicando translocação frequente. Fomos capazes de estudar os rearranjos mais detalhadamente em dois tumores. No primeiro tumor 5′-RACE em cDNA mostrou ligação da completa

ETV1

transcrição para o primeiro exão de um gene ncRNA dois exão específico da próstata que mapeia no cromossoma 14 (

EST14

) . Isso resultou na expressão de ambos os full-length

ETV1

transcrições e

EST14 ETV1-

transcrições de fusão. Dos spreads de cromossomos de um xenoenxerto derivado do segundo tipo de câncer de próstata observamos um complexo

ETV1

translocação envolvendo um fragmento de cromossomo 7, que abriga

ETV1 Comprar e fragmentos de cromossomos 4 e 10. Outros estudos revelaram a a sobre-expressão de vários diferentes transcritos de comprimento integral, dando origem a quatro isoformas proteicas com diferentes regiões N-terminais. Mesmo a isoforma mais curta sintetizado por full-length

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estimulada

in vitro

crescimento ancoragem-independente das células da próstata PNT2C2. Isto contrasta a falta de atividade de ainda mais curto ETV1 N-truncado produzido por transcrições de fusão. Nossas descobertas que, em superexpressão cancro da próstata clínico de full-length

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é devido a rearranjos genômicos envolvendo diferentes cromossomos e a identificação de uma isoforma ETV1 biologicamente ativa encurtado são altamente relevantes para a compreensão do mecanismo da função ETV1 no câncer de próstata .

Citation: Gasi D, van der Korput HA, Douben HC, de Klein A, de Ridder CM, van Weerden WM, et al. (2011) sobre-expressão de Full-Length

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Transcrições em Clinical Câncer de Próstata Devido a Gene translocação. PLoS ONE 6 (1): e16332. doi: 10.1371 /journal.pone.0016332

editor: Andrew Wilber, Escola de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de setembro de 2010; Aceito: 10 de dezembro de 2010; Publicação: 26 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Gasi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma Curie Grant Marie (Cancure) fornecida pela União Europeia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

fusões de genes são importantes para o desenvolvimento de muitas doenças malignas hematológicas e sarcomas, mas são raras na maioria dos outros tipos de tumores [1]. No entanto, a fusão frequente entre

TMPRSS2

eo gene ETS

ERG

mostrou que gene de fusão é um evento de grande relevância no câncer de próstata [2], [3]. A sobre-expressão da TMPRSS2-ERG

gene de fusão

foi avaliado em 40-70% dos casos de cancro da próstata [2] – [5]. Fusões de

TMPRSS2

e outros três genes que codificam fatores de transcrição ETS,

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,

ETV4

e

ETV5

, que estão localizados em cromossomos diferentes, ocorrem em baixa frequência no câncer de próstata [2], [6], [7]. No entanto, para

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pelo menos 10 parceiros de fusão diferentes têm sido descritas [8] – [10]. A maioria destes têm em comum que, como

TMPRSS2

, eles são específico da próstata e andrógeno-regulamentado expressa. As propriedades de parceiros de fusão são elementos-chave para explicar a sobre-expressão regulada por androgénio de um oncogene ETS no câncer de próstata. No entanto, uma característica única de

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é que não só pode ser sobre-expresso no cancro da próstata como uma transcrição de fusão, mas também como um de comprimento completo de tipo selvagem transcrição.

A grande família de fatores de transcrição ETS é composto por 27 membros [11] – [13]. Todos os membros têm em um domínio de ligação ao DNA altamente homólogo comum, o domínio ETS. As demais regiões da maioria das proteínas ETS mostram homologia estrutural limitado. ETV1, ETV4 e ETV5 são os membros de uma pequena subfamília de proteínas estruturalmente relacionadas ETS. Estas proteínas contêm na região N-terminal de um domínio de transactivação conservada curto ácida (TAD) que está ausente em ERG. ETS proteínas regulam muitos genes alvo que modulam processos biológicos como o crescimento celular, angiogénese, migração, proliferação e diferenciação. No entanto, qual das muitas funções moleculares e biológicas das proteínas ETS são mais importantes no câncer de próstata não é conhecida.

Na sequência

ERG, ETV1

é o gene ETS mais frequentemente overexpressed no cancro da próstata ( ~ 10% dos tumores) [10]. A proteína traduzida a partir ETV1 maioria dos transcritos de fusão é truncada, sem os 131 aminoácidos N-terminais (dETV1). Aprox. metade dos tumores com

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superexpressão expressar uma transcrição de fusão, os outros mostram um alto nível de

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expressão full-length. O

In vitro

propriedades biológicas e moleculares de dETV1 parecem diferentes das da proteína ácido 477 aminoácidos de comprimento completo [10]. Esta observação sugere que tumores com superexpressão de ETV1 full-length são diferentes de tumores que expressam dETV1.

Pouco se sabe sobre o mecanismo de full-length

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superexpressão e sua função no câncer de próstata clínica . Nossos resultados atuais mostram que a sobre-expressão de completo

ETV1

está correlacionada com rearranjo do

ETV1 e região cromossômica. Além disso, identificamos um romance, N-truncado

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isoforma com a mesma actividade que full-length

ETV1

.

Resultados e Discussão

Anteriormente , informamos

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superexpressão em oito dos 84 amostras de câncer de próstata. Em quatro casos, isso foi causado por um gene de fusão, nos outros quatro a full-length

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transcrição foi sobre-expresso [10]. No presente estudo, investigamos superexpressão de

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pela reação de transcriptase reversa quantitativa (qPCR) em um romance de coorte de 66 cancros da próstata. Em seis RNAs

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superexpressão foi detectado. Amostras G51, G59, G233, G270 e G268 foram derivadas de tumores primários e G210 foi derivada de um tumor recorrente. As seis amostras foram ainda estudados através de QPCR com pares de iniciadores na extremidade 5 ‘

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ARNm (1F exão e o exão 4R) e na extremidade 3′ do ARNm (exão e o exão 11F 12R) (Figura 1A). Uma alta exão 11-12 ao exão 1-4 razão é indicativa de um gene de fusão; um rácio de 1:01 indicada superexpressão de full-length

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mRNA. Com base nestes critérios, os tumores G51, G59, G233 e G270 expresso full-length

ETV1

enquanto G210 e G268 expressa uma transcrição de fusão (ver também controlar PC374 que expressa

TMPRSS2-ETV1

).

HNRPA2B1-ETV1

foi encontrado como o transcrito de fusão em G210 amostra (dados não mostrados); o transcrito de fusão em G268 não tenha sido identificado até agora. Estas duas amostras não foram investigada neste estudo.

(A) QPCR em RNA a partir de amostras clínicas que mostram

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superexpressão. Dois pares de iniciadores foram utilizados para determinar

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expressão:

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exão 1 para a frente e exão 4 reversa e exão 11 para a frente e exão 12 inversa, respectivamente. As sequências dos iniciadores são dadas na Tabela Suplementar S1. Os produtos amplificados foram quantificadas em relação à expressão da porfobilinogénio-desaminase (

PBGD

) gene de manutenção. Os dados foram normalizados para comprimento total

ETV1 overexpressed na PC135 xenotransplante. Uma alta exão ao exão 11/12 04/01 proporção indica um

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evento de fusão, uma proporção 1: 1 indica a sobre-expressão de um comprimento total

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transcrição. PC374 é um xenoenxerto de controlo que expressa um gene de fusão

TMPRSS2-ETV1. Uma experiência representativa das seis amostras que mostram

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superexpressão está representado. (B) FISH Interphase em secções de tecido de cancro da próstata fresco congelado. BACs utilizados são indicados abaixo da região do cromossoma 7 investigada. BAC RP11-124L22 (vermelho) vãos

ETV1 Comprar e RP11-1149J13 (verde) se sobrepõe

DGKB

(painel esquerdo). As posições dos genes a partir do topo do cromossoma 7 estão indicados na MBP. Um sinal de divisão que representa um ETV1

translocação é indicado por uma seta. (C) A translocação de

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ao cromossoma 14 em G270 tumor. As secções de tecido foram hibridizadas com BAC RP11-460G19 (verde) que se sobrepõe

MIPOL1 Comprar e flancos

ETS14

e com a

ETV1

BAC RP11-124L22 (vermelho) (ver B para detalhes). No painel à esquerda da posição do

MIPOL1

BAC no cromossomo 14 é indicado. No painel da direita um sinal de fusão (amarelo) mostra co-localização de

ETV1

e

MIPOL1

/

EST14

em G270, como indicado pela seta.

nos próximos experimentos voltados para a elucidação do mecanismo da superexpressão de full-length

ETV1

. Recentemente, tem sido mostrado que, em duas linhas celulares de cancro da próstata que sobre-expressam de comprimento completo

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, LNCaP e MDA PCa2b,

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é translocado [8]. Temos agora abordou a questão de saber se em amostras clínicas translocação do total

ETV1

gene possa ocorrer. Para detectar genômicas lâminas rearranjos de tecido de todas as amostras de câncer de próstata quatro com full-length

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superexpressão foram analisados ​​por FISH de interfase quebra-apart com duas sondas BAC marcados, um BAC reconhecido

ETV1

eo segundo o gene flanqueando

DGKB

(Figura 1B). A série foi suplementado com duas amostras abrigando full-length

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superexpressão do nosso estudo anterior, G89 e G308 [10], para que os tecidos congelados de qualidade morfológica suficientes estavam disponíveis. A Figura 1B mostra os resultados das experiências de FISH. Curiosamente, encontramos sinais de divisão em todas as amostras, exceto para G59, indicando frequente

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rearranjos em cancros da próstata que superexpressam full-length

ETV1

. Ausência de um sinal de divisão no G59 sugere ausência de translocação, embora não se possa excluir um ponto de interrupção fora da região investigada. Sua alta frequência observada indica rearranjo genómico como um importante mecanismo de full-length

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superexpressão no cancro da próstata clínica. Obviamente, a região cromossómica que

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é translocada pode contribuir para a elucidação do mecanismo de

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superexpressão. Fomos capazes de identificar mais detalhes sobre os rearranjos em amostras G270 e G89.

Tem sido demonstrado em células LNCaP que

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é translocado para 14q13.3-q21.1. Todo o gene está integrado no último intrão de

MIPOL1

. Em MDA PCa2b,

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é translocado para a mesma região, embora a posição precisa é desconhecida [8]. inserção Além disso, nós já descrita truncado

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no intrão de um gene dois exão que codifica uma ncRNA, denotado

EST14

, dando origem a um

EST14-ETV1

fusão transcrição que contém

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exão 5-12 sequências (G342 amostra ref 10;. Figura 2A). Importante,

EST14 Mapas diretamente junto ao

MIPOL1

em 14q. Como a maioria

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parceiros de fusão,

EST14

é um gene específico da próstata regulada por androgénio. Para investigar se a mesma região cromossômica estava envolvido em full-length

ETV1

translocação em nosso romance coorte, FISH interfase foi realizada com o

ETV1

BAC (Figura 1B) em combinação com um

MIPOL1

BAC (Figura 1C). Um sinal amarelo fundindo foi detectado na amostra G270 (Figura 1C), mas em nenhum dos outros tumores. Estes dados indicam que embora pareça uma preferência por cromossomo 14q13.3-21.1, outras regiões genômicas também contribuirá para rearranjo e superexpressão de full-length

ETV1

.

(A) Representação esquemática de

ETV1 Restaurant –

EST14

transcrições de fusão em tumores de próstata G270 e G342 (G342 amostra é de ref. 10). As setas indicam as posições dos iniciadores utilizados no ensaio de RT-PCR. As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela Suplementar S1. (B) Sequência do ponto de fusão de

EST14

e

ETV1

na amostra G270. A posição do ponto de fusão em G270 tumor foi mapeada pelo longo alcance PCR em DNA genómico com um iniciador directo no

EST14

intron e inverter a montante do iniciador de

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exão 1. No ponto de fusão dois resíduos T foram perdidos. O ponto de interrupção no

EST14

em G270 e G342 são indicados por setas.

Informações adicionais de

ETV1

rearranjo no G270 veio de 5′-RACE de cDNA de tumor (dados não mostrados). Surpreendentemente, não detectam apenas como esperado o full-length

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transcrição, mas também uma transcrição de fusão (Figura 2A). Tal resultado não foi encontrado para qualquer um dos outros tumores com superexpressão full-length

ETV1

. A sequenciação revelou que o transcrito de fusão em G270 foi composta de

ETV1

exão 1-12 precedida por o primeiro exão de

EST14

(Figura 2A). A varredura do

EST14

intron e

flanqueando região, de longo alcance PCR e sequenciamento ETV1

mapeou os pontos de interrupção no G270 ~1.9 Kbp a montante do

ETV1

exão 1 e ~ 5 Kbp jusante da

EST14

exão 1. o ponto de interrupção no

EST14

é de apenas 180 pb para além do ponto de interrupção no G342 (Figura 2B e ref. 10).

Para mais informações de

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rearranjo também foi coletado para G89 amostra. Anteriormente, um xenoenxerto propagados em ratos nus masculinos foram gerados a partir deste tumor (PC135). Como G89 tumor, PC135 overexpressed full-length

ETV1

[3]. A disponibilidade do xenoenxerto permitiu a preparação de metáfase cromossómicas. Em FISH multicolor foi encontrado um padrão de rearranjo cromossómico complexo (dados não mostrados). tintas de cromossomos individuais foram usadas para validar os dados multicolor peixe. A pintura de cromossoma 7 indicou a presença de vários fragmentos de cromossoma 7 (Figura 3). Hibridação com um

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BAC identificou a presença de três cópias do gene: dois em cromossomos de aparência normal, 7 e uma em um cromossomo marcador complexa. experimentos de acompanhamento mostraram que o cromossomo marcador continham fragmentos de cromossomos 4, 7 e 10, como o primeiro indicado por FISH multicolor (Figura 3). O

ETV1

BAC hibridizada na junção do cromossoma 7 e do fragmento de cromossomo 4, sugerindo fortemente que o 4; translocação 7 foi fundamental na superexpressão de

ETV1

. As posições precisas dos pontos de interrupção em 4 e 7 continuam a ser determinado. Nossos dados prevêem que várias regiões cromossômicas estão envolvidos na superexpressão de full-length

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. Pelo menos uma destas regiões é no cromossoma 14, e um segundo no cromossoma 4. O cromossoma 14 região está também envolvida na

fusão ETV1

gene. tecnologia de sequenciamento de profundidade poderia ser instrumental na identificação de outras

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rearranjos.

Tintas de cromossomos 4, 7 e 10 são verdes e o

ETV1

BAC (Figura 1b) é vermelho. Setas pretas indicam a translocado

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. No painel inferior do cromossomo marcador relevante é embalado em vermelho.

caracterização detalhada do full-length

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transcritos nos diversos tumores por 5′-RACE e sequenciamento mostrou que não só

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exão 1- exão 12 transcrições estavam presentes, mas também vários outros full-length

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transcrições, resultante do uso alternativo promotor. Essas transcrições foram indicados como

ETV1

,

ETV1-1a

,

ETV1-1b

e

ETV1-1c.

Figura 4A e Suplementar Figura S1 mostra as posições dos diferentes primeiros exões no gene e indicam os vários codões de iniciação ATG. De ambos

ETV1-1a

e

ETV1-1b

duas variantes de splicing foram encontrados (dados não mostrados). QPCR experiências utilizando iniciadores específicos para o transcrito de ARN a partir de todas as seis amostras clínicas de cancro da próstata que sobre-expressos

ETV1

mostrou que o nível de expressão dos diferentes transcritos foi variável nas várias tumores (ver Figura S2).

ETV1

quase não foi expressa no controle benigna da próstata G277 amostra hiperplasia. A Figura 4B representa esquematicamente a composição prevista das várias isoformas da proteína ETV1 que serão produzidos. Note-se que ETV1-1c é de longe a mais curta, sem os ácidos N-terminais de 60 aminoácidos, incluindo a maior parte do ácido TAD conservada. Em dETV1 que é expresso pela maioria dos genes de fusão, os aminoácidos N-termimal 131 estão ausentes. ETV1, ETV1-1b1 e -1b2 eram de tamanho semelhante, como mostrado em transferências de Western de lisados ​​de células HEK293T transfectadas (Figura 4B)

.

(A) Representação esquemática da organização do

ETV1

gene. primeiros exões alternativos são 1a, 1, 1b e 1c. As posições dos quatro diferentes codões ATG de início são indicados. Mais detalhes são apresentados na Figura Suplementar S1. (B) Representação esquemática da composição de diferentes proteínas ETV1 e sua expressão em células HEK293T transfectadas. As cores diferentes das regiões N-terminais indicar uma composição de aminoácido diferente. dETV1 é a proteína ETV1 truncado produzido por genes de fusão. Esta proteína é incapaz de induzir crescimento independente de ancoragem. No painel da direita mostra-se uma transferência de Western de isoformas ETV1 produzidas pelas células HEK293T transientemente transfectadas. p-actina foi utilizado como controlo de carga. (C) ensaio de agar suave, que mostra o crescimento independente de ancoragem de células infectadas com lentivírus PNT2C2 expressando as várias isoformas ETV1 ou controlar GFP. As barras representam o número médio de colónias por campo de microscópio de três experiências independentes (± DP). Imagens representativas das colónias coradas são mostrados abaixo do valor bar.

Anteriormente, mostramos que ETV1 e dETV1 diferiam na estimulação da

in vitro

crescimento ancoragem-independente [10] . PNT2C2 células infectadas com todas as novas construções de ETV1 induzidas crescimento independente de ancoragem de um modo semelhante como ETV1 (Figura 4C). Notavelmente, ETV1-1c, embora expresso a um nível inferior e em muito menor, é tão activa como as isoformas ETV1 mais longos. Assim, o TAD N-terminal completo não foi necessária, mas os aminoácidos 61-131 parecem essenciais para a actividade biológica de ETV1 (Figura 4B, C).

Em resumo, os dados apresentados revelam dois importantes aspectos inovadores do papel da ETV1 no câncer de próstata. Em primeiro lugar, é mostrado que em cancros da próstata clínicos um subgrupo de pacientes positivos mostram ETV1 de comprimento completo

ETV1

superexpressão devido à translocação de todo o gene de cromossomas diferentes. Esta nova observação complementa o mecanismo bem descrito da superexpressão de ETV1 truncada causada por fusões de genes em que a regulação de expressão é determinado pelo promotor e intensificadores dos parceiros de fusão. Em segundo lugar, em contraste com dETV1 produzidos por fusões de genes, uma isoforma curta de ETV1 de comprimento completo, ETV1-1c, faltando a maior parte do TAD N-terminal, é tão activo como isoformas ETV1 mais longos, contendo o TAD ácida N-terminal completa. Esta constatação aponta o crescimento independente de ancoragem para uma pequena região que está ausente em ETV1 truncada expressa por genes de fusão.

É altamente relevante para ampliar o número de amostras clínicas, a fim de ser capaz de comparar a progressão do tumor no os dois subgrupos de cancros da próstata que mostram superexpressão de ETV1 truncada vs. full-length, e determinar os mecanismos moleculares envolvidos no seu comportamento biológico diferente.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Use das amostras foi aprovado pela Comissão de Ética médica do Erasmus MC de acordo com a pesquisa clínica envolvendo seres humanos agem no protocolo MEC-2004-261, intitulado “o uso de tecido residual normal e câncer humano a partir de um banco de tecidos para caracterização de DNA, RNA e proteínas “.

os ratos foram alojados de acordo com as orientações do Centro Médico Erasmus, e os procedimentos foram realizados em conformidade com as normas para o uso de animais de laboratório. Experiências com animais realizadas neste manuscrito foram aprovados pela comissão experimental de animais do Centro Médico Erasmus (DEC-consult Erasmus MC projeto 102-10-01).

As amostras de tecido, RNA e isolamento de ADN

cancros da próstata snap-congelados foram obtidos por prostatectomia radical ou ressecção transuretral. Hematoxilina /eosina (HE) secções de tecido coradas foram histologicamente avaliadas por um patologista (G. van Leenders). Todas as amostras continham pelo menos 50% de células tumorais.

ARN a partir de espécimes clínicos foi isolado utilizando ARN-abelha (Campro Scientific, Berlim, Alemanha). O ADN foi isolado utilizando o kit DNeasy DNA Extraction (Qiagen, Valencia, CA, EUA). ARN a partir de linhas celulares foi isolado utilizando o kit RNeasy Extração de RNA (Qiagen).

mapeamento Breakpoint

A posição do ponto de fusão no tumor 270 foi mapeado por PCR de longo alcance em ADN genómico usando um iniciador directo no

EST14

intrão e a montante do iniciador de

ETV1

exão 1. os produtos de PCR foram separados num gel de agarose a 1% e sequenciados num analisador genético ABI 3100 (Applied Biosystems reversa, Carlsbad, CA, EUA).

Q-PCR

expressão de mRNA foi analisada por qPCR. O ADNc foi preparado com MMLV-RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e o oligo (dT) 12 primers. QPCR foi realizada em Power Green PCR Master Mix SYBR num Prism 7700 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems). Os produtos amplificados foram quantificados em relação ao porfobilinogénio-desaminase (

PBGD

) pelo método de curva padrão. Para primers ver Tabela S1.

RNA mediada por ligase amplificação rápida de cDNA termina

5′-RLM-RACE foi realizada utilizando o kit GeneRacer de Invitrogen. O ADNc foi amplificado utilizando o iniciador 5′-GeneRacer e um iniciador específico do gene reversa (ETV1 exão 6). Os produtos de PCR foram analisados ​​num gel de agarose a 1,5%, e as bandas foram excisadas, purificadas e sequenciadas.

fluorescência

hibridação in situ

FISH foi feito em 5 mícrons secções de tecido congelado, de acordo com protocolos padrão com pequenas modificações [14]. BAC clones RP11-124L22 (

ETV1

), RP11-460G19 (

MIPOL1

), RP11-1149J13 (

DGKB

) foram adquiridos de Recursos BacPac (bacpac.chori. org). BACs foram ou digoxigenina-11-dUTP ou biotina-16-dUTP (Roche, Basileia, Suíça) marcado e visualizada com anti-digoxigenina FITC (Roche) ou estreptavidina-Alexa 594 (Invitrogen). As secções de tecido foram contrastadas com DAPI. As imagens foram recolhidas num microscópio de epifluorescência (Leica DM, Wetzlar, Alemanha) equipado com um dispositivo de carga acoplada arrefecida câmara (fotométricos, Tuscon, AZ, EUA).

Para a preparação dos spreads metáfase, xenotransplante PC135 foi propagada em ratinhos nus machos. As células individuais foram recolhidos por filtração e picagem. preparação metáfase e hibridação foram essencialmente como descrito [14]. tintas cromossomo 4, 7 e 10 eram da Euro-Diagnostica (Malmö, Suécia). Metáfases foram analisados ​​com uma imagem de microscópio Axioplan 2 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) e as imagens foram capturadas usando software Isis (MetaSystems, Altiussheim, Alemanha).

Os plasmídeos de expressão

cDNAs dos diferentes ETV1 isoformas foram amplificados por PCR e clonados em pGEM-TEasy (Promega). Inserções foram verificados e sequência clonada no vector de expressão pcDNA3 (Invitrogen) ou o vector pWPXLd lenti-viral (Didier Trono, University of Geneva).

Western blot análise

Para a análise de Western blot, células HEK293T foram transfectadas com os diferentes expressão pcDNA3-ETV1 construções utilizando o método de precipitação com fosfato de cálcio. As células foram colhidas 48 h após a transfecção. A análise por Western blot foi realizada utilizando processos padrão, com o anticorpo dirigido para ETV1 terminal C (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EUA). p-actina foi utilizado como controlo de carga (Sigma, St Louis, MO, EUA). As proteínas foram visualizadas por quimioluminiscência (Pierce, Rockford, IL, EUA).

infecções lentivirais

células HEK293T foram co-transfectadas com vectores de expressão pWPXLd-ETV1, ou pWPXLd-GFP (controlo), e pPAX2 e pMD2.G (Trono) usando o método de precipitação com fosfato de cálcio. O vírus foi colhido a partir do sobrenadante e usado para a infecção de células PNT2C2. Piscinas de células infectadas foram propagadas.

agar mole ensaio

Uma camada de 0,6% de agarose de baixo ponto de fusão no meio de cultura normal foi preparado em placas de seis poços. No topo, uma camada de agarose a 0,3% contendo 1 × 10

4 PNT2C2 células infectadas com vírus diferentes ou células expressando ETV1 PNT2C2-GFP de controlo foram plaqueadas. No dia 14, as células foram coradas com violeta de cristal e as colónias foram contadas.

Informações de Apoio

Figura S1.

Parte da sequência genômica de

ETV1

. Os diferentes exons são destacadas em amarelo. codões de iniciação da tradução estão sublinhados. Note-se que a transcrição a partir de exon 1a pode ou não incluir o exão 1a1, mas o início da tradução é a mesma que a da transcrição a partir de exão 1. O final do exão 1B1 é indicado no vermelho.

ETV1

transcritos a partir de exão 1c falta exões 1, 2 e 3, o que resulta em um TAD truncada na proteína traduzida

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016332.s001

(DOC)

Figura S2.

Expressão dos diferentes

ETV1

transcrições foi determinada por qPCR no sistema em tempo real rápida 7900HT PCR a partir de Applied Biosystems utilizando o SYBR green Master Mix-potência (Applied Biosystems). Os níveis de expressão são em relação ao gene de manutenção

PBGD.

ETV1

e

PBGD

primers estão listadas na Tabela Suplementar S1. Amostra G277 é uma BPH. Tem muito baixa ou nenhuma expressão de todas as diferentes

ETV1

transcrições. Amostras G51, G59, G89, G233, G270 e G308 tudo superexpressam

ETV1 Tours A diferentes transcritos são expressos em níveis variáveis ​​

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0016332.s002

(TIF )

Tabela S1.

As sequências dos iniciadores

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016332.s003

(TIF)