Sumário

Nós demonstramos pela primeira vez que uma notável capacidade de rosiglitazona para mediar uma melhoria profunda da apoptose induzida por LA-12 associados a ativação da via mitocondrial em células cancerígenas do cólon humano. Este efeito foi observado preferencialmente na fase G1 do ciclo celular, independente da p53 e proteínas PPARy, e acompanhada com mudanças significativas de níveis de proteína da família Bcl-2 seleccionados. Além disso estimulação da ação citotóxica sinérgica cooperativa de rosiglitazona e LA-12 foi demonstrada nas células deficientes para PTEN, onde via apoptótica mitocondrial foi mais estimulado e moribundos G1-phase-associado foi reforçada. Nossos resultados sugerem que o tratamento combinado com rosiglitazona e LA-12 pode ser estratégia promissora anticancerígeno em tumores derivados de cólon, independentemente do seu estatuto de p53, e também favorável naqueles com defeito na função PTEN

Citation:. Lauková J, Kozubík Um, Hofmanova J, J Nekvindová, soba P, Moyer MP, et ai. (2015) Perda de PTEN Facilita Rosiglitazona-Mediated Enhancement de platina (IV) Complexo LA-12 induziu a apoptose em células cancerígenas do cólon. PLoS ONE 10 (10): e0141020. doi: 10.1371 /journal.pone.0141020

editor: Yoshiaki Tsuji, da Universidade da Carolina do Norte, Estados Unidos

Recebido: 04 de maio de 2015; Aceito: 02 de outubro de 2015; Publicação: 22 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lauková et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação científica checa (15-06650S) (https://www.gacr.cz; AHV) e IGA do Ministério da Saúde da República Checa (NT 11.201-5 /2010) (https://iga.mzcr.cz; AK). Platina Pharmaceuticals, A.S. (Dr. Petr Sova) e Incell Corporação LLC (Dr. Mary Pat Moyer) forneceu apoio na forma de material de pesquisa, e seu papel específico também é indicado na seção Autor Contribuições do formulário de inscrição online.

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. Petr Sova é um empregado da empresa proprietária dos direitos de propriedade intelectual sobre LA-12 e co-autor de patentes na área de LA-12. Mary Pat Moyer é um empregado da empresa proprietária dos direitos de propriedade intelectual sobre linhagem de células NCM460. Essas instituições comerciais não alteram a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

γ PPAR (PPAR) é um membro do receptor da hormona nuclear superfamília de factores de transcrição activados por ligandos que estão envolvidos na regulação do metabolismo energético, o desenvolvimento do cancro e a resposta anti-inflamatória [1]. Apesar de um papel principal de PPARy tem sido mostrado na diferenciação de adipócitos e insulina sensibilização [2], o PPARy é também bem conhecido para afectar o crescimento e o ciclo celular [3, 4], diferenciação [5] e a apoptose [6], de vários tipos de células cancerosas incluindo os do cólon. Da mesma forma como nos adipócitos, expressão de PPARy é também mantido em níveis relativamente elevados em várias linhas de células de cancro de cólon humano e tumores de cólon primários [7]. As mutações do gene PPAR têm sido relatadas como evento raro em neoplasias humanas, incluindo cólon [8]. Tem sido sugerido que a regulação de genes induzida por PPARy pode contribuir para a tumorigénese, mas o significado desta via do receptor no desenvolvimento e tratamento do cancro do cólon ainda permanece controverso.

rosiglitazona, um ligando sintético de PPARy é um anti amplamente utilizados agente -diabetic da família de medicamentos chamados tiazolidinedionas. Devido à sua capacidade para inibir a proliferação e /ou induzir a morte de células de cancro, a rosiglitazona, também foi examinada em diversos estudos voltados para o tratamento do cancro. Embora uma eficácia antitumoral insuficiente de rosiglitazona tem sido demonstrado em muitos casos, quando utilizado em monoterapia, o seu potencial promissor como um adjuvante combinada com radiação [9] ou vários tipos de agentes antineoplásicos tem sido relatada. Rosiglitazona aumentada a sensibilidade de células de cancro do cólon para os efeitos citotóxicos do 5-FU [10], citoquinas LIART [11] ou o ácido trans-retinóico [12]. Curiosamente, os efeitos aditivo /synergicanticancer de rosiglitazona e convencionalmente utilizados cisplatina medicamentos à base de platina ou a carboplatina têm sido demonstrados em cólon, pulmão ou linhas celulares de cancro do ovário e

In vitro

[13, 14]. Combinação de carboplatina e rosiglitazona reduziu a incidência de formação de pólipos em ratinhos modelo de carcinogénese do cólon induzida por azoximetano [13], o tamanho do tumor em ratinhos nus com xenoenxertos injectados subcutaneamente derivadas de células de cancro do pulmão A549 [13] ou induziu uma regressão de K- Ras-driven adenocarcinomas do pulmão de murino [14]. O pré-tratamento com rosiglitazona também synergized actividade anti-cancro de cisplatina em tumores mamários induzidos por DMBA em ratos [15]. Apesar de alguns mecanismos moleculares por trás desses efeitos têm sido sugeridos, muitos deles ainda devem ser esclarecidas. Além disso, uma completa falta de informação existe em relação aos potenciais efeitos anticancerígenos de cooperação de rosiglitazona com novos medicamentos quimioterapêuticos à base de platina.

LA-12, (OC-6-43) -bis (acetato) (1- adamantilamina) amminedichloroplatinum (IV), representa um grupo (IV) contendo um ligando hidrofóbico 1-adamantilamina volumoso platina recentemente introduzido, permitindo a sua maior hidrofobicidade em comparação com outros medicamentos à base de platina tais como cisplatina [16]. A ação de LA-12 tem sido intensamente estudada por nós e os outros, tanto

in vitro

e

in vivo

, e os resultados destacou o seu potencial anticancerígeno favorável ao longo de vários medicamentos quimioterápicos à base de platina usados ​​convencionalmente [17]. LA-12 exerceram uma forte efeito citotóxico em várias linhas celulares de cancro resistentes a cisplatina de diferentes origens incluindo cólon [18-20]. Além disso, LA-12 poderiam superar a resistência dependente de confluência de células cancerígenas do cólon, que foi descrito na platina (II) compostos de cisplatina e oxaliplatina [21]. Demonstramos ainda que uma maior eficácia de LA-12 em células de cancro do cólon foi associada à sua capacidade para superar o bloco de entrada em M-fase desencadeada por oxaliplatina, a fim de reparar o dano celular [22]. Recentemente, relatou em uma maior capacidade /única de LA-12 em comparação com cisplatina para induzir a regulação positiva de várias proteínas importantes envolvidas na regulação da apoptose, como Noxa, Bim, c-Myc ou DR5 [23, 24]. Além disso, a absorção celular de LA-12, foi mostrado mais rápida e eficaz em comparação com a cisplatina no carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano [25]. propriedades anticancro promissora de LA-12, também foram demonstrados

In vivo

em ratinhos nus portadores de xenoenxertos de carcinoma humano do cólon, da próstata e do ovário origem, onde a LA-12 foi mais eficaz na supressão do tumor comparada com satraplatina [26]. No entanto, nem os mecanismos moleculares detalhados envolvidos no citotóxicos e citostáticos ação da LA-12 em células de câncer de cólon são ainda totalmente compreendido, nem são suas potenciais aplicações em terapia combinada.

No presente estudo, foram os primeiros para demonstrar a capacidade de rosiglitazona para estimular a resposta antiproliferativa e apoptótico desencadeado pela LA-12 em células de adenocarcinoma de cólon humano HCT-116. Nós investigamos os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela ação cooperativa das drogas, com um foco particular na modulação da progressão do ciclo celular, PTEN envolvimento e ativação da via apoptótica mitocondrial. A resposta citotóxica induzida pela combinação de rosiglitazona e LA-12 também foi investigado em outras linhas de células de cancro do cólon e as células derivadas a partir do epitélio do cólon normal.

Materiais e Métodos

Cultura celular e tratamentos

Dois pontos humanos linhas celulares adenocarcinoma HCT116 em peso (p53

+ /+, Bax

+/-, Chk2

+ /+, PTEN

+ /+), p53

– /-, Bax

– /-, Chk2

– /- e PTEN

– /- (obtido a partir Prof. Bert Vogelstein, John Hopkins University, Baltimore, MD, EUA, e T. Waldman , Georgetown University School of Medicine, Washington, EUA, em 2007) [27] [28] foram mantidas em meio McCoy’s 5A (Gibco, Invitrogen, Life Technologies, EUA), suplementado com penicilina (100 U /ml), estreptomicina (0,1 mg /ml) e 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria e Gibco, Invitrogen). células de adenocarcinoma do cólon humano DLD-1 (ATCC, CCL-221, obtido em 2009) e RKO (ATCC, CRL-2577, obtida em 2007) foram mantidas em meio RPMI ou DMEM (tanto Gibco, Invitrogen, Life Technologies), respectivamente, complementados com penicilina (100 U /ml), estreptomicina (0,1 mg /ml) e 10% de FBS. O ser humano adulto normal do cólon linha de células derivadas do epitélio NCM460 foi recebido (em 2010) por um Acordo de Transferência de Material com Incell Corporation (San Antonio, Texas, EUA) [29], e rotineiramente propagado sob condições normais, no M3: médias 10TM (Incell Corporação). As células foram cultivadas em TPP (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiça) pratos de cultura, frascos ou placas numa incubadora humidificada a 37 ° C em atmosfera de 5% de CO

2, passadas duas vezes por semana após a exposição ao EDTA tripsina /PBS e soluções. Os números de células foram determinados utilizando um contador de CASY Modelo TT-celular e Analyzer (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha).

Vinte e quatro horas após a sementeira, as células foram pré-tratados (24 h) com 50 uM de rosiglitazona (RGZ ) (5 – [[4- [2- (metil-2-piridinilamino) etoxi] fenil] metil] -2,4-tiazolidinodiona, Cayman Chemical, Michigan, EUA) e, subsequentemente, tratada (48 h) com 0,75 uM LA- 12 ([(OC-6-43) -bis (acetato) (1-adamantilamina) aminedichloroplatinum (IV)], platina Pharmaceuticals, como, Brno, República Checa). MEK1 /2 Inibidor U0126 (# 9903, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) e pan-caspase inibidor z-VAD-fmk (# 550377, BD Bioscience Pharmingen, San Diego, CA, EUA) foram adicionados a células 1H antes do tratamento com RGZ. As soluções de reserva foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, Praga, República Checa).

A transfecção celular e RNA Interferência

transfections RNA foram realizadas utilizando X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche, Basileia, Suíça) ou Lipofectamine ™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. As células foram semeadas em meio de McCoy com FBS a 10%, sem antibióticos, e incubadas durante a noite. Pouco antes de meio de transfecção foi mudado para Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco, Invitrogen). As células foram transfectadas com 100 nM de duplexes de siARN dirigidos contra o PPARy (# 29455, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) ou controlo não-alvo ARNsi (# 37007, Santa Cruz Biotechnology). Após 4 horas, o meio foi mudado para meio de McCoy com FBS a 10% (PAA Laboratories GmbH e Gibco, Invitrogen) com antibióticos. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram pré-tratados (24 h) com RGZ e subsequentemente tratados (48 h) com LA-12.

análise de imunotransferência

As células foram lisadas em 1% SDS de tampão de lise contendo mistura de inibidores de protease (# P2714, Sigma-Aldrich) ou inibidor de protease jogo do cocktail I (# 5391313, Calbiochem, Merck Millipore, Bedford, MA, EUA), para a detecção fosfoproteína NAVO

4 e NaF foram adicionados a solução de lise. DC ™ Protein Assay (# 500-0113, Bio-Rad Laboratories, Praga, República Checa) foi utilizado para a quantificação de proteínas. As proteínas foram então separadas em 15% de gel de poliacrilamida-SDS e transferidas para uma membrana de PVDF (Merck Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas em leite magro a 5% ou BSA durante 1 h à temperatura ambiente, lavou-se com TBS (Tris-HCl a 50, NaCl 150 mM e 0,1% de Tween), e incubadas durante a noite em anticorpos primários diluídos em 5% de não- gordura do leite a 4 ° C. A imunodetecção foi realizada utilizando os seguintes anticorpos primários: anticorpo monoclonal anti-p53 (1: 000, DO-1, # 126) produzido contra os aminoácidos 11-25 de p53 de origem humana, de coelho policlonais anti-Akt (1: 500, # 8312) contra os aminoácidos 345-480 de Akt1 de origem humana, de ratinho monoclonal anti-ciclina B1 (1: 1000, # 245) contra uma proteína recombinante correspondendo a ciclina B1 humana, D1 monoclonal de ratinho anti-ciclina (1: 1000, # 20044) contra a proteína recombinante de comprimento completo humana, de murganho monoclonal anti-PTEN (1: 500, # 7974) contra os aminoácidos 388-400 de PTEN de origem humana, anticorpo policlonal de coelho anti-p21 (1: 000, # 397) criado contra um mapeamento peptídico na extremidade C-terminal da p21, de origem humana, de coelho policlonal anti-p27 (1: 1000, # 528) criado contra um mapeamento peptídico na extremidade C-terminal da p27 de origem humana (todas da Santa Cruz Biotechnology), policlonal de coelho anti-fosfo-AKT (Ser473) (1: 500, # 9271) produzido por imunização de animais com um fosfo-péptido sintético correspondente aos resíduos que cercam Ser473 de rato Akt-purificada por proteína a, anticorpo policlonal de coelho anti-Bak (1: 1000, # 3792) produzido por imunização de coelhos com um péptido sintético (acoplado a KLH) que corresponde aos resíduos amino-terminais de humano Bak-purificada por proteína a, anticorpo policlonal de coelho anti-Bax (1: 1000, # 2772) produzido por imunização os animais com um péptido sintético (acoplado a KLH) que corresponde aos resíduos do terminal amino da Bax humana purificada por proteína a, anticorpo policlonal de coelho anti-Bid (1: 1000, # 2002) produzido por imunização de animais com um péptido sintético (KLH- acoplado) correspondente aos resíduos que circundam o local de clivagem de humano Bid-purificada por proteína a, coelho monoclonal anti-Bim (1: 1000, # 2933) produzido por imunização de animais com um péptido sintético correspondente aos resíduos que cercam Pro25 de Bim, monoclonal de ratinho anti -Chk2 (1: 000, # 3440) produzido por imunização de animais com truncada recombinante GST-Chk2, policlonal de coelho anti-caspase-3 (1: 500, # 9661) produzido por imunização de animais com um péptido sintético correspondente aos aminoácidos do terminal os resíduos adjacentes a (Asp175) em caspase-3 humana, anticorpo policlonal de coelho anti-caspase-9 (1: 500, # 9505) produzido por imunização de animais com um péptido sintético correspondente aos resíduos do terminal amino que cercam a Asp330 de caspase-9 humana – purificado por proteína a, anticorpo policlonal de coelho anti-ERK (1: 1000, # 9102) produzido por imunização de animais com um péptido sintético (acoplado a KLH) derivada de uma sequência no terminal C de p44 de rato da cinase MAP purificada por proteína a , policlonal de coelho anti-fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (1: 1000, # 9101) produzido por imunização de animais com um fosfo-péptido sintético correspondente aos resíduos que cercam Thr202 /Tyr204 de p44 humana da cinase MAP purificada por proteína a , policlonal de coelho anti-PARP clivada (Asp214) (1: 1000, # 9541) produzido por imunização de animais com um péptido sintético correspondente aos resíduos carboxi-terminal circundantes Asp214 em PARP humana purificada por proteína a, anticorpo policlonal de coelho anti-peroxissoma proliferator- γ receptor activado (PPARy) (1: 500, # 2435) produzidos por imunização de coelhos com um péptido sintético correspondente aos resíduos que cercam Asp69 de PPARy humano, de coelho policlonal anti-Puma (1: 1000, # 4976), produzido por imunização de animais com um peptídeo sintético correspondendo à região terminal carboxilo de humano Puma-purificada por proteína a, coelho monoclonal anti-survivina (1: 1000, # 2808) produzido por imunização de animais com um péptido sintético correspondente aos resíduos que cercam cisteína 60 de survivina humana ( tudo a partir de Cell Signaling Technology), rato monoclonal anti-Noxa (OP180; Calbiochem-MERC, Praga, República Checa) com imunógeno de GST-fusion com Noxa recombinante humana, rato anti-citocromo c (1: 500, # 556433, BD Pharmingen ™, San Jose, EUA) com peptídeos sintéticos de pombo citocromo c como imunógeno, monoclonal anti-complexo IV subunidade II (anti-cit oxidase subunidade II) (# A-6404, Invitrogen ™, Life Technologies) com o complexo humano IV subunidade II como imunógeno. As membranas foram então lavadas e incubadas com secundárias anticorpos anti-IgG de ratinho (1: 3000, # NA931) e anticorpo anti-IgG de coelho (1: 3000, # NA934) (ambos da Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA) para 1 h à temperatura ambiente. A detecção dos complexos de anticorpo foi realizada com peroxidase de rábano substratos Immobilon Ocidental HRP quimioluminescente Substrato (# WBKLS0500, Merck Millipore, Bedford, MA, EUA). -Anti-anticorpo β actina (1: 5000, A5441, Sigma-Aldrich), com β-actina citoplasmática ligeiramente modificado péptido N-terminal, Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile- Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys, conjugado com KLH como imunogénio, foi utilizada para um controlo de carregamento.

Preparação de fracções de células

As células foram colhidas por tripsinização, centrifugou-se a 200 g durante 5 min, ressuspenderam-se em tampão de fracção (150 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, EGTA 0,2 mM, Tris 5 mM e 0,01% de digitonina pH 7,2-7,4) e deixado em TA durante 20 min para lisar. As células lisadas foram centrifugadas a 13 000 rpm, foram utilizados sobrenadantes de fracções citoplasmáticos e peletes foram ressuspensos no mesmo volume de tampão fracção misturada com tampão de 4x Laemmlli, fervido durante 10 min e as amostras após a quantificação de proteína foram utilizadas em imunotransferência análise.

Análise do potencial de membrana mitocondrial (MMP)

Detecção de MMP foi realizada utilizando 0,2 uM tetrametilrodamina éster etílico do perclorato (TMRE; Molecular Probes®, Eugene, OR, EUA) como descrito anteriormente [30] e analisadas utilizando citometria de fluxo (FACS Calibur

TM, Becton Dickinson, San José, CA, EUA). Os dados foram avaliados por software CellQuest (Becton Dickinson) e os resultados foram expressos como a percentagem de células com diminuição da MMP.

anexina V /iodeto de propídio apoptose ensaio

Por externalização de fosfatidilserina como um marcador de apoptose, as células foram colhidas, lavadas com PBS e coradas com anticorpo conjugado com FITC anexina V (# ANXV-FT100, Apronex, Praga, República Checa) durante 20 min em RT com fabrica ‘buffer fornecido específica. Imediatamente antes da análise, 5 ug /mL de iodeto de propídio (PI) (# P-4170, Sigma-Aldrich) foi adicionada. A fluorescência foi então medida utilizando citometria de fluxo (FACS Calibur

TM, Becton Dickinson). Utilizando software de busca celular, os resultados foram expressos como a percentagem de células positivas para anexina V e negativas para o iodeto de propídio (apoptose).

ciclo celular análise

As células foram processadas como descrito anteriormente [22] e analisadas por citometria de fluxo (FACSVerse

TM; Becton Dickinson); mínimo de 20 000 eventos foram recolhidos por amostra. Os dados foram analisados ​​usando a versão ModFit LT 3.1 software (Verity Software House, Topsham, ME, EUA). células e detritos foram excluídos doublet e apenas as células individuais foram tiradas para análise do ciclo celular. Os resultados foram expressos como a percentagem de células em G1, S e G2 /M de fase.

caspase-3 activa de detecção

As células foram colhidas, lavadas em PBS, fixadas e coradas com FITC kit de caspase-3 activa a apoptose (# 550480, BD Pharmingen ™) de acordo com o protocolo MANUFACTURER’S. A percentagem de células com a caspase-3 activa foi detectada por citometria de fluxo (FACS Verso

TM, Becton Dickinson) e analisadas por software BD FACSuite versão 1.0.5 (Becton Dickinson).

A detecção simultânea das activa caspase-3 e a progressão do ciclo celular

as células foram colhidas, lavadas em PBS, fixadas e coradas com FITC utilizando kit de caspase-3 activa a apoptose (# 550480, BD Pharmingen ™) de acordo com o protocolo MANUFACTURER’S. Subsequentemente, as células foram lavadas e coradas com iodeto de propídio para análise do ciclo celular tal como descrito acima. A percentagem de células em G1, S e G2 /fase M com a caspase-3 activa foi detectada por citometria de fluxo (FACS Verso

TM, Becton Dickinson) e analisadas por software BD FACSuite versão 1.0.5 (Becton Dickinson).

isolamento do RNA e em tempo real RT-PCR

isolamento do RNA.

imediatamente após a coleta, 1×10

6 células foram novamente suspensas em 200 ul de PBS, homogeneizado em 400 kit ul de lise /Tampão de Ligação e congelado a -80 ° C até o tempo de isolamento do RNA. isolamento do RNA total foi realizada utilizando o kit de isolamento de ARN alta puro (Roche, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante. quantidade e a pureza do RNA foram avaliadas por espectroscopia UV e uma alíquota de ARN foi transcrito reversamente em ADNc.

a síntese de cDNA.

O ADNc foi sintetizado a partir de 1 ug de ARN total por primeira cadeia de ADNc transcriptor kit de síntese (Roche, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante, utilizando fornecida iniciadores oligo-dT (1 ul) e iniciadores de hexâmero aleatório (2 mL) num volume total de 20 ul.

-PCR em tempo real quantitativa.

0,5 mL de cada cDNA foi analisada por PCR quantitativa utilizando Gene TaqMan Expressão Mix master e ensaios de expressão gênica TaqMan (Life Technologies, EUA) CCND1, ciclina D1 (Hs00765553_m1), BIRC5, survivin (Hs04194392_s1), CDKN1A, p21 (Hs00355782_m1), CDKN1B, p27 (Hs01597588_m1), CCNB1, ciclina B1 (Hs01030099_m1), HPRT1 (Hs99999909_m1) de acordo com as instruções do fabricante, num volume reaccional total de 10 ul. Todas as reacções de PCR foram efectuadas em três repetições em técnicas RotorGene 6000 instrumento (Corbett Life Science, Austrália). PCR perfil térmico era o seguinte: 50 ° C durante 2 min (UDG de incubação), 95 ° C durante 10 min (activação de enzimas), seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. controles NTC e RT- foram incluídos em cada série. A análise dos dados foi realizada utilizando o método DDCT com HPRT1 utilizado como o gene de manutenção.

Os dados estatísticos de análise

Os dados são expressos como média +/- S.E.M. de três experimentos independentes, e analisados ​​estatisticamente por análise de variância one-way seguido por diferença mínima significativa de Fisher teste (LSD) com significância estatística p 0,05, utilizando Statistica for Windows, V 10 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, EUA) .

a fim de examinar mais detalhadamente o interativa (sinergismo ou aditividade) efeitos citotóxicos entre as drogas, os resultados da análise de apoptose (anexina V /ensaio iodeto de propídio, citometria de fluxo, a percentagem de anexina V positiva, propídio iodeto de células HCT116 negativa) após o tratamento com várias doses diferentes de rosiglitazona (até 75 uM) e LA-12 (até 1,5 ^ M) ou as suas combinações foram examinados. Construção de curvas de regressão e cálculo das quantidades equieficaz de agentes na mistura foram feitas utilizando análise isobolographic em 6 software GraphPad Prism. As doses de medicamentos suficientes para efeito sinérgico foram calculados e foi determinado o tipo de resposta.

Resultados

RGZ reforçada HCT116 do cólon humano sensibilidade de células cancerosas à apoptose dependente da caspase induzida-LA-12

o pré-tratamento de HCT116 em peso linha celular de adenocarcinoma humano com rosiglitazona eficazmente estimulados apoptose LA-12-induzida, tal como demonstrado por um aumento significativo na percentagem de células com externalização específica fosfatidil-serina (Figura 1A; S1 Figura), e a clivagem de caspase-3 e PARP seu substrato (Fig 1B). Uma análise isobolographic da resposta apoptótica de células HCT116 de várias doses diferentes de rosiglitazona e LA-12 utilizado em combinação (ver Materiais e Métodos) demonstrou claramente um efeito sinérgico significativo (dados não apresentados). Usando um inibidor da pan-caspase z-VAD-fmk, confirmou-se que os efeitos apoptóticos da combinação de drogas totalmente dependia activação de caspases (Figura 1A e 1B). A estimulação significativa dos efeitos apoptóticos (fosfatidil serina externalização) induzidas por LA-12 e rosiglitazona combinação em comparação com as drogas individuais também foi demonstrado em linhas de células DLD-1 e RKO cólon humano adenocarconima (Fig 1C).

(a) Percentagem de apoptose (iodeto de anexina V positiva /propídio negativo, citometria de fluxo) células HCT116 em peso e (b) a clivagem de caspase-3 e PARP (transferência Western) na sequência de pré-tratamento (24 horas) com rosiglitazona (RGZ, 50 uM) e o tratamento subsequente (48 h) com LA-12 (0,75 ^ M), na ausência (DMSO) ou na presença de Z-VAD-fmk (10 pM). (C) Percentagem de apoptose (iodeto de anexina V positiva /propídio negativo, citometria de fluxo) células RKO ou DLD1 seguinte de pré-tratamento (24 horas) com rosiglitazona (RGZ, 50 uM) e o tratamento subsequente (48 h) com LA-12 (0,75 ^ M ). Os resultados são médias + S.E.M. ou representantes de três experimentos independentes. A significância estatística: P 0,05, * versus controle, ‡ contra RGZ, Ο contra LA-12, e Δ para com /sem z-VAD-fmk.

As mitocôndrias desempenham um papel indispensável no melhoramento da apoptose das células HCT116 na sequência da sua tratamento combinado com rosiglitazona e LA-12

a resposta apoptótica de células HCT116 WT tratados com a combinação de rosiglitazona e LA-12 estava associada com a estimulação da via mitocondrial, como indicado pela libertação aumentada de citocromo c em o citoplasma (Fig 2A), a clivagem de caspase-9 (Figura 2B) e gota de MMP (Figura 2C). Um papel funcional das mitocôndrias foi ainda confirmada usando HCT116 Bax – /- células, onde os efeitos apoptóticos da combinação de fármacos foram significativamente suprimida. Isto foi demonstrado por um bloqueio de caspase-9 e a clivagem de PARP (Fig 2B), e gota de MMP (Figura 2C) em HCT116 Bax – /- células tratadas com a combinação de rosiglitazona e LA- 12 em comparação com os seus homólogos wt. Seguindo o tratamento com células HCT116 em peso com a combinação de drogas, um aumento do nível de BH3-somente proteínas pró-apoptóticas Noxas e Bim (23 e 15 kDa, o que corresponde a EL e forma L, respectivamente) observou-se, enquanto que o nível de PUMA e Bid manteve praticamente inalterado. Um ligeiro aumento no nível de proteínas Bax e Bak, também era evidente em células HCT116 WT-12 tratadas com LA (Figura 2D).

(a) A libertação de citocromo c na (fracção citoplasmática) citoplasma de células HCT116 pré-tratada (24 h) com rosiglitazona (RGZ, 50 uM) e subsequentemente tratados (48 h) com LA-12 (0,75 ^ M), detectados por transferência de Western após fraccionamento celular. (B) A clivagem de caspase-9, PARP, Bax nível de proteína (Western blotting), e (c) as alterações no potencial de membrana mitocondrial (MMP, citometria de fluxo) em peso HCT116 e Bax – /- células tratadas como em a). (D) O nível de Noxa, Bim, Puma, Bid, Bax e proteína Bak (Western blot) em células wt HCT116 tratados como em a). Os resultados são médias + S.E.M. ou representantes de três experimentos independentes. A significância estatística: P 0,05, * versus controle, ‡ contra RGZ ou Ο contra LA-12, e Δ para peso contra Bax – /-. Células

A apoptose induzida por LA-12 rosiglitazone- e ocorre preferencialmente no G1 fase do ciclo celular HCT116

Um fluxo simultâneo análise de citometria da apoptose celular (clivagem de caspase-3) e do ciclo celular revelaram que as células tratadas com a combinação de drogas, preferencialmente morrer da G1 (e para baixo medida também S ) fase (Figura 3A e 3B). Sob as condições de deficiência de Bax, percentagem significativamente mais baixa das células tratadas com a combinação de drogas sofreram apoptose em comparação com as suas contrapartes expressando o Bax, e essas células apoptóticas estavam na fase G1 do ciclo celular (Figura 3A).

( a) a caspase-3 de activação (% de todas as células com caspase-3 ativa) relacionada com a progressão do ciclo celular (citometria de fluxo) em peso HCT116 e Bax – /- células após a sua pré-tratamento (24 h) com rosiglitazona (RGZ, 50 mM ), e o tratamento subsequente (48 h) com LA-12 (0,75 ^ M) (b) percentagem de células apoptóticas (com a caspase-3 activa) na fase G1 do ciclo celular, a quantificação de dados a partir de uma). Os resultados são médias + S.E.M. ou representantes de três experimentos independentes. A significância estatística: P 0,05, * versus controle, ‡ contra RGZ, Ο contra LA-12, e Δ para peso contra Bax – /-. Células

Como p53 e Chk2 pode agir ciclo celular tão importante (incluindo G1- ou a entrada de fase M) e reguladores da apoptose, foi investigado o seu possível envolvimento na modulação da melhoria mediada por rosiglitazona de sensibilidade das células HCT 116 a apoptose induzida por LA-12. Os nossos resultados mostraram que ambas p53 e Chk2 são dispensáveis ​​para a apoptose desencadeada pela combinação de drogas, como se observou resposta semelhante (caspase-3, caspase-9, a clivagem de PARP) em parental e apropriado knock out (p53 – /-, Chk2- /-) linhas de células (Figura 4)

a clivagem de caspase-9, caspase-3, a PARP e o nível de proteínas p53 e Chk2 em peso HCT116, Chk2 -. /- e p53 – /- células pré-tratadas (24 h) com rosiglitazona (RGZ, 50 uM), e subsequentemente tratadas (48 h) com LA-12 (0,75 ^ M), detectados por transferência de Western. Os resultados são representantes de três experimentos independentes.

melhoria relacionada com a fase de deficiência de PTEN suportado G1 da apoptose dependente da mitocôndria induzida pela rosiglitazona e LA-12 em células HCT116

O tratamento combinado de HCT116 células wt com rosiglitazona e LA-12 induziu uma diminuição no nível de PTEN (Fig 5A), que foi acompanhada por um aumento da ativação da Akt (fosforilação em Ser473), sem alterações no nível total de proteína quinase (S2 Fig). A fim de investigar o papel funcional de PTEN, a resposta citotóxica para a combinação droga foi comparada em células HCT116 que expressam ou sem a proteína. HCT116 PTEN – /- células eram mais sensíveis aos efeitos apoptóticos de sozinha e ainda mais à sua combinação com rosiglitazona LA-12, como mostrado por uma PARP aumentada e caspase-9 clivagem (Fig 5A), e um aumento da queda de membrana mitocondrial potencial (Fig 5B) em comparação com os seus homólogos HCT116 wt. Uma morte preferencial a partir da fase do ciclo celular G1 induzido pela combinação de fármacos nas células wt HCT116 foi ainda apoiada ainda mais na ausência de PTEN, em que a percentagem de células apoptóticas (com a activação da caspase-3) aumentou significativamente (Figura 5C). A estimulação da droga de apoptose relacionado com G1-fases induzida pela combinação foi também evidente em pontos de tempo posteriores dos tratamentos (dados não apresentados).

(a) clivagem de PARP, caspase-9 e nível de PTEN (Ocidental blotting), (b) mudanças no potencial da membrana mitocondrial (MMP, citometria de fluxo) e percentual (c) de células em apoptose (com caspase-3 ativa) em fase do ciclo celular G1 em peso HCT116 ou PTEN – /- células pré-tratadas (24 h) com rosiglitazona (RGZ, 50 uM), e subsequentemente tratadas (48 h) com LA-12 (0,75 ^ M). (D, e) Percentagem de peso HCT116 e PTEN – /- células em fases do ciclo celular individuais (citometria de fluxo) na sequência dos tratamentos especificados na A-C). Os resultados são médias + S.E.M. ou representantes de três experimentos independentes. A significância estatística: P 0,05, * versus controle, ‡ contra RGZ, Ο contra LA-12, e Δ para peso contra PTEN – /-. Células

Enquanto rosiglitazona sozinho não afetou a distribuição do ciclo celular em relação ao controle, observou-se uma diminuição significativa na percentagem de células HCT116 wt em fase G1, e aumento simultâneo na fase G2 /M, após a sua exposição a LA-12 ou a sua combinação com rosiglitazona (Figura 5D). de três experiências independentes. de três experiências independentes.