Abstract

Fundo e objetiva

E2A fator de transcrição é crucial para o desenvolvimento normal e diferenciação dos linfócitos B e T. A desregulação de E2A leva a leucemia e tumorigénese de alguns tumores sólidos. A expressão e significado clínico E2A, bem como o seu papel no cancro colorectal (CRC) ainda são desconhecidos. Este estudo visa avaliar a expressão E2A em tecidos CRC, avaliar seu valor prognóstico, e investigar seu papel no crescimento de células de câncer de cólon.

Métodos

expressão E2A em tecidos CRC e mucosa normal foi detectado por coloração imuno-histoquímica; curva de sobrevivência de Kaplan-Meier e modelo de regressão de Cox foram utilizados para avaliar o valor prognóstico da E2A. Lentivírus foi usado para construir E2A células estavelmente knocked-down. ensaio MTT foi utilizado para detectar alteração proliferação celular; ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo; e ensaio de cromatina imunoprecipitação (CHIP) foi usado para validar a meta vinculativa prevista de E2A

Resultados

A expressão de E2A foi menor em tecidos CRC que a mucosa normal.; baixa expressão E2A correlacionada com o estádio TNM avançada e maior tamanho do tumor, e previu mau prognóstico dos pacientes com CCR. E2A knockdown resultou num aumento da taxa de proliferação celular e a aceleração do ciclo celular. ensaio ChIP mostrou miR-320a era um alvo direto de E2A e regulação positiva de miR-320a em E2A subregulado poderiam reverter a proliferação celular e ciclo celular mudanças causadas pela deficiência de E2A.

Conclusões

E2A é um fator prognóstico independente para pacientes com CCR e tem como alvo miR-320a para regular a proliferação celular de células cancerígenas do cólon

Citation:. Huang a, Zhao H, Quan Y, Jin R, Feng B, Zheng M (2014) E2A prevê Prognosis colorretais pacientes com câncer e regula o cancro do Crescimento celular pela segmentação miR-320a. PLoS ONE 9 (1): e85201. doi: 10.1371 /journal.pone.0085201

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de setembro de 2013; Aceito: 25 de novembro de 2013; Publicação: 13 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela National Natural Science Foundation da China (NSFC, 30,873 milhões). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O gene E2A mamífero está localizado no cromossoma 19 e é-não-tecido específica e universalmente expresso numa grande variedade de tipos de células. Através de splicing alternativo, o gene E2A codifica duas isoformas, E12 e E47 (colectivamente referidos como proteínas E2A), que ambos têm o domínio de hélice-volta-hélice (bHLH) e poderia regulam a transcrição do gene por ligação ao ADN de E-box sequências, CAGGTG. Embora amplamente expresso, E2A não é essencial em algumas organogeneses como tecido muscular esquelético ou cardíaco, eritropoiese, condrogénese, e neurogénese [1], mas desempenha um papel importante no desenvolvimento e diferenciação dos B [2], [3] e linfócitos T [4 ]. E2A camundongos deficientes mostrou uma prisão na fase de células pró-B durante o desenvolvimento de células B [3] e de expressão transgênica de qualquer E12 ou E47 poderia parcialmente resgatar o início B linfopoese; Da mesma forma, a deficiência de E2A levou a um bloco na fase mais precoce do desenvolvimento de células T [4] e perturbado timócitos selecção positiva [5]. Além disso, E2A, foi encontrada a ser envolvido em algumas actividades celulares incluindo a diferenciação de células [6], a proliferação de [7], a apoptose [8], do ciclo celular [9] e epitelial-mesenquimal transição (EMT) [10].

Além de seu papel crucial na B normal e desenvolvimento de células T, E2A também participa na tumorigênese. Estudos relataram o papel bem estabelecido de E2A em leucemogênese: duas proteínas de fusão, E2A-HLF [11] e E2A-PBX1 [12], ambos contendo o domínio de transactivação de E2A e o domínio de ligação ao ADN da hLF ou PBX1, poderia levar a células pró-B leucemia aguda linfoblástica (ALL) em adolescentes e células pré-B ALL em crianças, respectivamente [13]. Além disso, E2A foi encontrado para ser envolvido na oncogénese de tumores sólidos, quer como oncogene ou como gene supressor de tumor. Presença de proteína de fusão E2A-PBX1 no cancro do pulmão foi recentemente relatada e correlacionada com sobrevida global de pacientes com adenocarcinoma de pulmão in situ [14]. aumento da expressão de E2A foi detectada no cancro da mama [15], [16] e câncer de próstata [17], da qual ele foi encontrado para promover a oncogênese. No entanto, os ratinhos com mutação nula de E2A eram susceptíveis à linfomas desenvolvida espontaneamente tímicos [18] e a perda de E2A no linfoma primário conduzido a resistência a apoptose [19], sugerindo o papel de E2A alternativa como um gene supressor de tumor. Além disso, a expressão de E2A, foi proposto para ser de valor diagnóstico em determinado subtipo de MALT (tecido linfóide da mucosa-associado) linfoma [20]. Tomados em conjunto, E2A pode actuar como um gene supressor de tumor, ou como um oncogene em diferentes tipos de cancro.

A expressão de E2A em cancro colorrectal (CRC) e o seu valor prognóstico não foram discutidos antes e ainda é desconhecido se E2A ou reprime promove o desenvolvimento de CRC. Neste estudo, a nosso conhecimento, pela primeira vez, nós investigamos o significado clínico da E2A no CRC e encontrou a sua utilidade como um marcador de prognóstico; Além disso, encontramos E2A suprimiu o crescimento do tumor, visando miR-320a em células cancerígenas do cólon, demonstrando o seu papel tumor-supressora na CRC.

Métodos

Pacientes e amostras clínicas

Um total de 98 pacientes com câncer colorretal foram incluídos; os pacientes foram tratados com cirurgia entre junho de 2007 e janeiro de 2008 em Shanghai Minimamente Invasiva Centro de Cirurgia. Os pacientes foram excluídos se: tinha recebido quimioradioterapia neoadjuvante; tinha câncer colorretal não ressecáveis; tinha tumores de outros órgãos; não eram susceptíveis de ser entrevistado durante o follow-up. Os dados demográficos e clínico-patológicos foram extraídos por revisão de prontuários. Os pacientes foram entrevistados por telefone em três meses, seis meses, e depois anualmente, após a cirurgia. As amostras de tumor foram cortadas imediatamente após a remoção ‘espécimes cirúrgicos durante as operações e, em seguida, fixadas com formalina e conservados a 4 ° C durante duas semanas antes do tratamento seguinte; tecidos normais foram definidos como a mucosa localizado, pelo menos, cinco centímetros de distância da margem do tumor e de corte, fixada, preservados e tratados como acima. Este estudo foi realizado com o consentimento informado por escrito de todos os pacientes inscritos antes da cirurgia e no âmbito do protocolo aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Ruijin Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

A imuno-histoquímica e pontuação

coloração imunohistoquímica foi efectuada como protocolo previamente descrito [21]. Resumidamente, após a fixação com formalina, tecidos foram embebidos com parafina, cortadas e montadas em lâminas. Em seguida, as lâminas foram lavadas com xileno para Desparafinar, com etanol graduado para re-hidratar, incubaram-se com tampão de citrato para recuperar o antigénio, e bloqueadas com 3% H

2O

2 para inactivar a peroxidase endógena. As lâminas foram incubadas com anticorpo primário de E2A (Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA; 1:200 diluição) a 4 ° C durante a noite, seguida de incubação com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário anti-coelho de cabra (Santa Cruz) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Complexo visualização foi realizada com uma solução de 2-DAB Kit (Invitrogen). Os controlos negativos foram obtidos através da substituição do anticorpo primário E2A com soro de coelho pré-imune.

As lâminas foram examinadas por dois investigadores (Huang e quan) de forma independente. Critérios de pontuação foram utilizados como anteriormente descrito com pequenas modificações. intensidade da coloração foi pontuada como 0 (nenhuma coloração), 1 (coloração fraca), 2 (coloração moderada), e 3 (coloração forte); células positivas em cada secção foram marcados como 0 (menos de 10%), 1 (10% -25%), 2 (26% -50%), e 3 ( 50%). O resultado final foi um produto de dezenas de intensidade e celular positiva de cada slide. Slides com marcador para 0-3 foram definidos como de baixa expressão e 4-9 como alta expressão.

cultura celular

linhas celulares de cancro do cólon LaVO, HCT116, Caco-2, HT29, SW480 e SW1116 foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC) e subcultivados e preservados por Shanghai Institute of Surgery digestivo; células do cólon mucosa do epitélio humano normal NCM460 foi gentilmente doado por Jingqing Zeng (Hospital Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, o doador comprou linha de células NCM460 de Incell Corporation, LLC, San Antonio, TX, EUA). LOVO foi cultivada em F-12K Nutrient Mixture Médio (Corning Cellgro®, MA, EUA), HCT116 e HT29 em 5A de McCoy (Corning Cellgro®), SW480 e SW1116 em Leibovitz ‘G-15 (Corning Cellgro®), e em NCM460 DMEM (Corning Cellgro®). Todos meio de cultura acima foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Caco-2 foi cultivada em Meio Mínimo Essencial (Corning Cellgro®) com 20% de FBS. As células foram colocadas na incubadora (Heracelles, Alemanha) a 37 ° C, numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2.

Extracção de proteínas e de Western blot

As células foram colhidas aos uma confluência de 80%, com RIPA (Solarbio, Beijing, China) e a concentração de proteína foi determinada com o kit de Ensaio BCA Protein (Thermo Scientific, EUA), medindo OD

562 usando leitor de microplacas (Epoch, BioTek, Winooski, EUA) . Western blot foi realizada de acordo com o protocolo relatado anteriormente [22] e anticorpos primários utilizados foram E2A (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA). GAPDH (Kangchen, Xangai, China) foi utilizado como controlo de carga.

ARN e isolamento microARN, qRT-PCR

ARN celulares totais foram extraídos utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) e microARNs celulares totais ( miARNs) foram extraídos com miRvana ™ kit de isolamento de miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). ARN de transcrição reversa foi realizada usando RT PrimeScript mestre mistura perfeita Tempo real (Takara, Shiga, Japão). O nível de ARNm de E2A (para a frente: 5′-CCACT TCACT GAGTC GCACAG-3 ‘; reverso: 5′-GTCTC TCCCG GGCATA AAGGA-3′) foi avaliada por meio de qRT-PCR, utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems); o nível de ARN de GAPDH (para a frente: 5’-GGAGC Gagat CCCTC CAAAAT-3 ‘; reverso: 5′-GGCTG TTGTC ATACT TCTCA TGG-3’) foi utilizado para normalização. A expressão de miR-320a foi avaliada por qRT-PCR utilizando Kit Taqman microARN RT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), TaqMan MicroRNA Ensaios (Applied Biosystems), e Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante; o nível U6 miRNA foi utilizado para normalização.

Lentivirus transfecção de clones de expressão estáveis ​​

partículas

E2A /shRNA-eGFP-lentivírus e E2A controle /sh-negativo (SHNC) partículas -eGFP-lentivírus , ou seja, E2A /shRNA-LV e E2A /SHNC-LV, foram adquiridos de Novobio (Xangai, China). SHNC foi sintetizado com as mesmas bases de shRNA mas com sequência mexidos. transfecção lentiviral e triagem de células foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante para estabelecer o E2A estavelmente reprimidos ea forma estável NC transefected SW480 clones, isto é, SW480 /shE2A e SW480 /SHNC. A eficiência de transfecção foi avaliado por exame visual da percentagem de células que expressam eGFP sob o microscópio de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão), Western blot, e qRT-PCR.

transfecção transiente

Os plasmídeos, Pez-M29-E12 (plasmídeo isoforma E12), Pez-M29-E47 (plasmídeo isoforma E47), Pez-M29-NC (plasmídeo com a sequência de controle negativo) e vetor controles foram adquiridos de Genecopoeia (Rockville, MD, EUA) e validado por sequenciamento; imita miRNA-320a (moléculas de cadeia dupla de RNA que imitam miR-320a) e imita NCS (sequências de controlo negativo com base em C. elegans microRNAs têm identidade de sequência mínima em humanos) foram adquiridos de GenePharma (Xangai, China). As células da fase logarítmica foram recolhidas e semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 4 * 10

5 células /poço, 24 horas antes da transfecção. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA) foi utilizado para a transfecção, de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência de transfecção transiente foi analisado por western blot ou qRT-PCR. As células transfectadas com vectores foram usadas como controlo.

proliferação celular ensaio

ensaio de proliferação celular foi realizado com o kit de contagem celular-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japão). Resumidamente, as células foram digeridas com tripsina (Beyotime, Xangai, China), lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes, filtrada com um filtro (BD Falcon), ressuspenderam-se em RIPA 1640, contadas e diluídas até uma concentração final de 5 células /mL. Em seguida, as células foram semeadas em placas de 96 poços, 200 ul (1000 células) por cavidade, em sixplicate, e colocado na incubadora durante 6 dias. As células viáveis ​​foram quantificadas em cada intervalo de 24 h com CCK8, em conformidade com o protocolo do fabricante, e a absorvância a 450 nm foi medida utilizando o leitor de microplacas (Epoch, BioTek).

ciclo celular análise

Antes da análise, as células (2 x 10

6) foram colhidas 48 horas após a transfecção transiente, bem como os controlos correspondentes. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, fixadas com etanol a 75% e armazenadas a 4 ° C durante a noite. Após a análise, as células foram lavadas duas vezes com PBS e tratadas com RNase a 37 ° C durante uma hora, seguido por coloração com iodeto de propídio durante 30 minutos no escuro. análise do ciclo celular foi, então, realizada com citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson, MD, EUA).

Cromatina ensaio de imunoprecipitação

EZ-chip ™ Cromatina imunoprecipitação Kit (Millipore, Billerica, MA, EUA ) foi comprado para realizar o ensaio de chip, de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, uma placa de cultura celular de 15 cm de células SW480 (cerca de 80% de confluência) foi fixada com PFA a 1% (Sigma). Em seguida, as células foram lisadas, sonicada a cisalhamento de ADN e imunoprecipitados com anticorpo anti-E2A (Santa Cruz) e anticorpo de controlo (IgG). Depois disso, ligações cruzadas proteína /DNA foi invertida e DNA foi purificado pelo seguinte PCR, usando Takara Ex Taq Hot Start Version (Takara).

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 15.0. A correlação de fatores clínicos com expressão E2A foi examinado por análise de correlação de Pearson. O efeito da E2A na sobrevivência foi estimada utilizando a curva de Kaplan-Meier e teste log-rank. Uni e modelo de risco proporcional multivariada de Cox foram utilizados para avaliar os efeitos da expressão E2A e os parâmetros clínico no OS 5 anos e DFS, respectivamente. teste t de Student foi utilizado para analisar as diferenças entre os dois grupos e ANOVA one-way foi empregue no caso de dados consistiu em mais do que dois grupos. Um valor de duas caudas de

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A expressão de E2A correlacionada com CRC estágios patológicos

Em primeiro lugar, avaliou-se a expressão da proteína E2A nos tecidos de mucosa normal CRC e por imuno-histoquímica (Figura 1). espécimes de tumor colorretal obtidos de 98 pacientes CRC e mucosa normal disponível a partir de 43/98 pacientes foram examinados. Os parâmetros demográficos e clínico-patológicos de todos os doentes foram mostrados na Tabela 1. Dos 98 pacientes, elevada expressão de E2A foi detectada em tecidos normais da mucosa 35/43 e 39/98 de tumor (

P

0,01) . Coloração de E2A em mucosa normal apresentado no núcleo e no citoplasma de ambos, mas em tecidos de cancro, E2A coloração foi predominantemente nucleares (Figura 1). Mais importante ainda, a expressão de E2A diminuiu como CRCs avançada (Figura 1E-H). Em seguida, fez uma análise de correlação para estudar a associação entre a expressão de E2A e os fatores clínico-patológicos. Como mostrado na Tabela 2, a baixa expressão de E2A foi significativamente associada com maior estádio TNM (

P Art 0,01) e maior tamanho do tumor (

P

= 0,035), mas não foi relacionada com a pacientes idade (

P

= 0,761), sexo (

P

= 0,655), a histologia do tumor (

P

= 0,985), ou local do tumor (

P

= 0,120). Assim E2A era susceptível de ser envolvido no desenvolvimento e progressão de CRC

Imagens representativas de IHC são mostrados como:. (A) coloração HE de mucosa normal; (B) coloração HE de tecido CRC; (C) a alta expressão de E2A (cor marrom) apresentado como coloração nuclear e citoplasmática na mucosa normal; (D) a baixa expressão E2A na mucosa normal; (E-H) a fase I (E) para a fase II tecidos com diferentes intensidades de coloração E2A (F), III (G), e IV (H) CRC; E2A apareceu predominantemente no núcleo. As imagens foram tomadas no âmbito de 200 × ampliação.

Baixa expressão de E2A previu mau prognóstico dos pacientes com CCR

Para investigar o valor prognóstico da E2A, foi utilizado Kaplan -Meier curva de sobrevida em 5 anos para mostrar as diferenças nos resultados entre pacientes com CCR expressão E2A altas e baixas. Como mostrado na Figura 2, os pacientes com elevada expressão de E2A tinha maior sobrevida de 5 anos global (OS) e doença de sobrevivência livre (DFS) do que os pacientes com baixa expressão. O sistema operacional de 5 anos e DFS para pacientes expressão alta E2A eram 84,6% e 82,1%, e para pacientes com baixa expressão de E2A eram 47,5% e 42,4% (

P

= 0,000, para OS e DFS ambos). Em seguida, aplicou-se o modelo de regressão de Cox para examinar o valor prognóstico da E2A. Na análise univariada, expressão palco e E2A TNM foram encontrados para ser preditivo para OS e DFS; enquanto que na análise multivariada, os dois fatores também previu piores resultados clínicos (Tabela 3). Daí a expressão E2A parecia ser um fator preditivo útil para o prognóstico de pacientes com CCR

(A) OS para pacientes expressão E2A altas e baixas.; (B) o DFS para pacientes de expressão de E2A de alta e baixa. Pacientes com alta expressão de E2A têm OS mais favorável e DFS (

P

= 0,000, para OS e DFS ambos).

inibição da proliferação celular por E2A em células CRC

Considerando o significado clínico da E2A, queríamos perguntar se E2A desempenhado um papel no desenvolvimento da CRC. Seis linhas celulares de cancro do cólon, LOVO, HCT116, Caco-2, HT29, SW480, SW1116 e células do cólon e de mucosa do epitélio humano normal NCM460 foram rastreados quanto à expressão de E2A, utilizando Western blot (Figura 3A). Dos sete linhas celulares, NCM460 mostrou muito maior nível de expressão de E2A do que todas as outras células cancerígenas. Tomados em conjunto com a sua expressão em pacientes com CCR, E2A foi significativamente regulada negativamente em tecidos e células de CRC.

(A) Expressão de E2A na célula humana normal epitélio da mucosa do cólon e NCM460 CRC linhas celulares foi mostrado por Western blot. GAPDH foi usada como controlo de carga; (B) e (D) As células com expressão de E2A regulados negativamente (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) mostrou maior taxa de proliferação de células do que o do controlo negativo (SW480 /SHNC, Caco-2 /SHNC) e de tipo selvagem (SW480 /WT, Caco-2 /p) de células; (C) e (E) células parentais (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) foram co-transfectadas com E12 ou plasmídeo E47 (SW480 /shE2A_E12 e SW480 /shE2A_E47; Caco-2 /shE2A_E12 e Caco-2 /shE2A_E47) para restaurar a expressão de E2A. As células transfectadas com Co mostrou diminuição da taxa de proliferação de células do que o do controlo parental ou vector (SW480 /shE2A_VC, Caco-2 /shE2A_VC) células transfectadas. Todos os dados representados como valor médio ± DP de 3 experiências independentes. (*,

P Art 0,05).

Para investigar diretamente a função de E2A, construímos E2A estavelmente clone knocked-down, as células SW480 /shE2A, eo controle negativo clone, as células SW480 /SHNC, com E2A /shRNA-LV e E2A /SHNC-LV, respectivamente. eficiência knockdown foi validado por Western blot e qRT-PCR (Figura S1 A). Então, nós detectamos as mudanças de proliferação celular de SW480 /shE2A e células SW480 /SHNC com o ensaio MTT, utilizando células SW480 tipo selvagem (SW480 /WT) como controle. Tal como mostrado na Figura 3B, SW480 /shE2A apresentaram maior taxa de proliferação de SW480 /SHNC e células SW480 /p, indicando um papel supressor de E2A em proliferação. Para demonstrar ainda mais o papel anti-proliferação de E2A, foi realizada a co-transfecção em células SW480 /shE2A estáveis ​​com dois plasmídeos, Pez-M29-E12 (que codificam isoformas E12) e Pez-M29-E47 (que codificam isoformas E47) para compensar o efeito de regulação negativa por shE2A. A co-transfecção resgatado a expressão de E2A de células SW480 /shE2A para o nível normal (Figura S1 A) e também restaurou a taxa de proliferação (Figura 3C). Além disso, a transfecção de E12 ou E47 em células SW480 tipo selvagem pode inibir significativamente a proliferação celular e os efeitos de inibição causados ​​pela E12 e E47 não mostraram diferenças (Figura S1 B). Para excluir a possibilidade linha celular dependente, construímos Caco-2 /shE2A e Caco-2 clones /SHNC repetir as experiências acima e os resultados mostraram E2A tinha o mesmo papel anti-proliferação em células Caco-2 (Figura 3D E) . Além disso, manipulada a expressão E2A em células NCM460. E2A silenciamento e restauro também afetou o crescimento celular NCM460 de forma supressiva (Figura S1 C). Conclusivamente, E2A pode ser um regulador negativo da proliferação de células cancerígenas do cólon.

E2A regulada progressão do ciclo celular de células SW480

Em seguida, queria saber os mecanismos através dos quais E2A regulados proliferação de células SW480. Em publicações anteriores, E2A foi referida como estando envolvida na regulação do ciclo celular [9], [23], [24]. Assim, fizemos análise do ciclo celular por citometria de fluxo para detectar possíveis alterações após E2A downregulation e restauração. Consistentemente, a mudança do ciclo celular explicado alteração na proliferação celular: como mostrado na Figura 4A, o ciclo celular de células SW480 /shE2A diferiam SW480 /SHNC e células SW480 /p, com mais células progrediu para a fase S, indicando um aumento da proliferação celular. Quando as células SW480 /shE2A foram co-transfectadas quer com E12 ou E47 plasmídeo, o ciclo celular foram normalizados, o que estava de acordo com a restauração da proliferação das células (Figura 4B). Além disso, a transfecção de E12 ou E47 de tipo selvagem em SW480 resultou numa diminuição de células em fase S (Figura S1 D). efeitos de regulação semelhantes também foram observados em NCM460 células (Figura S1 E). Assim, E2A pode regular o ciclo celular para controlar a proliferação de células

(A) regulação negativa de E2A em células SW480 conduziram a um aumento de células em fase S e, concomitantemente, uma redução de células na fase G1 /G0.; (B) A expressão ectópica de E12 ou E47 células aumentou em fase G1 /G0 de células SW480 /shE2A e reduziu células em fase S. Os dados representam médias ± DP de 3 experiências independentes. (*,

P Art 0,05).

controlada E2A ciclo celular, visando miR-320a

Os resultados acima nos levou ainda mais para investigar como E2A regulamentada ciclo celular mudança. Nas últimas décadas, microARNs (miARNs) ter sido encontrado para ser envolvido na patogénese de doenças humanas incluindo o cancro [25]. Inesperadamente, encontramos um miRNA, miR-320a, que era um supressor de metástase [26], foi regulamentada pelo E2A. Em células SW480 /shE2A, a expressão de miR-320a foi regulada negativamente (Figura 5A) e a transfecção de ambos os E12 ou E47 neste grupo de células (Figura 5B) ou em células de tipo SW480 selvagem (Figura S1 F) pode regular positivamente o miR-320a . Para investigar se a miR-320a era um alvo diretamente regulada por E2A, foi realizado o ensaio de cromatina imunoprecipitação (CHIP). Os resultados mostraram que E2A poderia ligar-se a E-box (GCAGGTG, a -138bp, a montante do stemloop miR-320a) de miR-320a, sugerindo E2A pode regular a expressão de miR-320a, visando a sua sequência promotora directamente (Figura 5C) .

(a), a expressão de miR-320a foi diminuída em células SW480 /shE2A como mostrado por qRT-PCR; (B) co-transfecção de E12 ou E47 em células SW480 /shE2A podia normalizar a expressão de miR-320a; (C) Painel superior: sequência do gene miR-320a mostrando o E-box, o local de ligação previsto de E2A; painel inferior: Ensaio ChIP mostrou E2A obrigado a miR-320a no seu E-box, GCAGGTG; A co-transfecção imita de miR-320a inverteu as alterações do ciclo celular (D) e o crescimento de células (E) de células SW480 /shE2A; (F) A co-transfecção imita de miR-320a diminuição da taxa de proliferação celular de células Caco-2 /shE2A. Os dados são expressos com as médias ± DP de 3 experiências independentes. (*,

P Art 0,05).

Em seguida, foi perguntado se miR-320a foi alvo através do qual a proliferação de células regulamentado E2A. Por transfecção imita miR-320a em células SW480 /shE2A, encontramos a progressão do ciclo celular causada por E2A knockdown foi preso e taxa de proliferação celular foi diminuída (Figura 5D E). Além disso, a co-transfecção imita de miR-320a em células Caco-2 /shE2A inibida taxa de proliferação das células (Figura 5F). Assim, E2A regulada proliferação celular diretamente pela segmentação miR-320a

Discussão

Apesar dos grandes esforços terem sido feitos para melhorar a prevenção e tratamento da CRC, sua morbidade e mortalidade ainda permanecem elevados:. Ambas foram estimados para ser o terceiro lugar entre todos os cânceres nos EUA, 2013 [27]. A tumorigénese de CRC é um processo de múltiplos mediada pela acumulação de alterações na capacidade de proliferação de células e uma ampla gama de distúrbios genéticos [28]. Com base nestes, estudos recentes têm-se centrado em encontrar novos biomarcadores e características genéticas aberrantes no CRC [29]. Aqui nós mostramos E2A foi um novo marcador de prognóstico para CRC e miR-320a era um alvo direto através do qual E2A regulada ciclo celular do cancro do cólon para controlar a proliferação celular.

O papel de E2A no B normal e desenvolvimento de células T e leucemogênese tem sido bem estudada [13], [30], [31] e também foi demonstrado para ser envolvido no cancro da mama, cancro da próstata, gástrico MALT e linfoma tímico [15], [17], [18], [20 ]. Especialmente, a expressão de E2A está associada com a diferenciação de células de tumor e o resultado dos pacientes no cancro da mama [15] e as fases de tumor no cancro da próstata [17]. Assim, E2A é susceptível de ser um factor ligado ao desenvolvimento de tumores e tem valor prognóstico. Em apoio a isso, verificou-se que a expressão E2A foi significativamente diminuída em tecidos CRC comparação com mucosa normal e imuno-histoquímica mostrou uma diminuída gradualmente pontuação da coloração E2A positiva como estádio clínico avançado, indicando uma associação negativa de E2A com o desenvolvimento CRC e provavelmente tumor- efeito supressor de E2A. Na análise de regressão Cox, encontramos baixa expressão de E2A previu mau prognóstico de OS e DFS em pacientes CRC independentes da idade, sexo, local do tumor, histologia do tumor e tamanho do tumor. Estes resultados, que sugerem um papel supressor de E2A no CRC, estavam em consonância com as conclusões do linfoma [18], [32] e leucemia [4], mas contrariada com aqueles encontrados na mama e cancro da próstata [15], [17 ]. Considerando o processo de passos múltiplos de CRC carcinogénese e diferentes comportamentos biológicos de tumores, a discrepância pode ser compreendido, pelo menos, parcialmente

Estudos anteriores demonstraram as funções de auto-contradictive de E2A em proliferação:. Silenciamento de E2A nos cancros da mama [15 ] e células de cancro da próstata [17] inibiu o crescimento celular, mas no linfoma, leucemia, as células estaminais hematopoiéticas e células cancerosas de CRC, perda de E2A conduziu a proliferação melhorada [7], [30], [32], [33]. Além disso, aplicadas crescimento celular inibido E47 superexpressão de células T ALL [34]. Para revelar claramente o papel do E2A na proliferação de células do cancro do cólon, construímos uma E2A reprimidos de forma estável SW480 clone para investigar o seu efeito. Consistente com resultados anteriores encontrados na malignidade hematopoiética e CRC, observou-se que a regulação negativa de E2A aumentou significativamente a taxa de proliferação celular e de co-transfecção quer com E12 ou E47 plasmídeo poderia compensar este efeito, sugerindo o papel directo de E2A na regulação da proliferação celular. Por conseguinte, a análise do ciclo celular mostraram uma progressão da fase G1 /G0 para a fase S em E2A células reprimidos. Embora alguns estudos mostraram ciclo celular preso em fase G1 em células cancerosas deficientes E2A [17], [23], nossos resultados foram favoráveis ​​ao efeito pró-proliferação e de acordo com as conclusões da maioria dos estudos que mostraram progressão do ciclo celular acelerado depois E2A deficiência de [24], [35] – [39]. Tomados em conjunto, knockdown de E2A promovida a progressão do ciclo celular e isto resultou num aumento da proliferação celular. Estes resultados fornecem parcial, se não completa, insights sobre o papel supressor tumoral de E2A no CRC.

Como um fator de transcrição, E2A exerce suas funções por regulação da expressão gênica e estudos relataram seus alvos a jusante incluindo p21, Id1 , c-myc, etc [17], [24], [36]. Em nosso estudo, encontramos miR-320a era um alvo regulados por E2A na modulação do ciclo celular e proliferação celular. Humana miR-320a é localizada no cromossoma 8p21.3, um locus de susceptibilidade do fígado metastático [40], e tem sido relatada como sendo regulador da glicólise [41] e desregulado no cancro [42]. Estudos têm mostrado que o miR-320a inibe a tumorigénese e metástase em CRC [26], [43], [44]. Inesperadamente, identificou-se a E-box de miR-320a como um local de ligação de E2A com TESS (Transcrição Elemento de pesquisa System) e nós de fato demonstrou que E2A obrigado a miR-320a utilizando o ensaio ChIP. Expressão de miR-320a foi regulamentada pelo E2A diretamente e mais importante, a regulação positiva de miR-320a poderia reverter as alterações causadas por E2A knockdown, que sugeriu-lo ainda mais como um efetor a jusante da E2A. No entanto, ainda não está claro se o efeito de E2A no miR-320a é um efeito global. Tomados em conjunto, propomos que miR-320a é um dos alvos através do qual E2A regula a progressão do ciclo celular e proliferação celular.

Em resumo, apresentamos provas convincentes de que E2A é um fator de prognóstico para pacientes com CCR e peças de teatro um papel supressor de tumores em células de CRC. Através da ligação directa para miR-320a, E2A regula o crescimento celular a progressão do ciclo de células de cancro e os controlos. No entanto, o papel de E2A em tumores sólidos ainda não foi completamente compreendido e os nossos resultados revelam única parcialmente os objectivos e mecanismos de acção moleculares de E2A. Assim, futuros estudos são necessários para validar os nossos resultados e esclarecer completamente o papel de E2A no CRC.

Informações de Apoio

Figura S1.

(A) Esquerda: a expressão da proteína E2A de tipo selvagem SW480, SW480 controle, e as células SW480 knocked-down. Direita: Mudança de expressão de E2A em células SW480 após transfecção de shE2A, E12 ou E47: shE2A reduzida a expressão de E2A em SW480, enquanto E12 e E47 aumento da expressão de E2A em células SW480 /shE2A, relativamente aos controlos; (B) Transfecção de E12 ou E47 inibiu o crescimento celular SW480 /p; (C) E2A regula o crescimento celular em células NCM460; (D) A transfecção de E12 ou E47 aumentou G

0 /G

1 fase de células SW480 /WT e diminuiu a fase S; (E) E2A regula a progressão do ciclo celular em células NCM460; (F) Transfecção de E12 ou E47 regulada positivamente a expressão de miR-320a, em comparação com o controlo negativo.