Abstract

receptor de andrógeno (AR) é um membro da família de receptores nucleares de factores de transcrição. Após a ligação a androgénios, AR torna transcricionalmente activo para regular a expressão de genes alvo que abrigam elementos de resposta de androgénio (Ares) nos seus promotores e /ou potenciadores. AR é essencial para o crescimento e sobrevivência das células cancerosas da próstata e é, portanto, um alvo para a atual e próxima geração de modalidades terapêuticas contra o câncer de próstata. redes de interacção proteína-proteína envolvendo patofisiologicamente relevantes Ar são, no entanto, mal compreendida. Neste estudo, foi identificada a proteína fundida /translocados em lipossarcoma (FUS /TLS) na forma de uma proteína que interage com AR por co-imunoprecipitação de proteínas endógenas em células de cancro da próstata humano LNCaP. A resposta hormonal de expressão FUS em células LNCaP foi mostrado para se assemelhar ao de outros co-activadores AR. FUS exibida uma forte capacidade de transativação intrínseca em células de câncer de próstata quando conectado aos promotores basais que utilizam o sistema GAL4. Cromatina imunoprecipitação experimentos mostraram que FUS foi recrutado para ARE III da região do potenciador do

PSA

gene. Os dados de sobre-expressão ectópica e abordagens “knock-down” demonstraram que a atividade transcricional AR foi reforçada por FUS. Esgotamento de FUS reduziu a proliferação andrógeno-dependentes de células LNCaP. Assim, FUS é um romance co-ativador da AR em células de câncer de próstata

Citation:. Haile S, Lal A, Myung JK, Sadar MD (2011) FUS /TLS é um co-ativador de receptor de andrógeno em As células cancerosas da próstata. PLoS ONE 6 (9): e24197. doi: 10.1371 /journal.pone.0024197

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de julho de 2011; Aceito: 02 de agosto de 2011; Publicação: 01 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Haile et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institutes of Health Research conceder MOP-79308. www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

do receptor de androgénio (AR) é necessária para a sobrevivência e crescimento de células cancerosas da próstata. Assim, o cancro da próstata avançado, podem ser tratados com terapias de ablação de androgénios. Infelizmente, estas terapias falham e, eventualmente, a doença torna-se, o cancro da próstata letal resistente à castração (CRPC). O mecanismo mais amplamente apoiada subjacente CRPC envolve AR. É necessário o domínio amino-terminal (NTD) de AR tanto para a actividade de ligando-dependente e independente do ligando do receptor (para uma revisão ver [1]). Assim, os esforços actuais para desenvolver fármacos mais eficazes contra CRPC estão focados no bloqueio mais eficaz da síntese de androgénio, antiandrogénios que se ligam competitivamente a domínio de ligação ao ligando de AR (LBD) com muito maior afinidade [2], e inibidores da AR NTD [3 ]. esforços contínuos para desenvolver medicamentos se beneficiaria de uma melhor compreensão das redes de interação proteína-proteína que envolvem a AR. Para este fim, utilizamos uma abordagem proteômica e identificados novos parceiros de interação AR endógenos em células de câncer de próstata que incluem membros de um grupo de proteínas chamadas FET /TET. Esta família de proteínas inclui: fundida em Sarcoma (FUS) /translocados em lipossarcoma (TLS), proteína de Ewig Sarcoma (EWS), eo TATA ligação do Factor Proteína Associada, TAF15

proteínas FET exibir diversas funções, incluindo. modulação da transcrição, splicing, espalhando celular e reparo do DNA. proteínas FET têm domínios de activação da transcrição semelhantes (TADs) no seu motivo DTN e ARN reconhecimento (MRR) e repetições do RGG tripéptido no seu terminal carboxilo [4], [5]. O TAD de proteínas FET contém XYXXQ-rico motivo, o X é um aminoácido pequeno (Gly, Ala, Ser ou Pro) [6]. Este motivo também é compartilhada com o SYT proto-oncoproteína, o receptor nuclear humano co-activador SYT-interagindo activador de proteina /co-activador (SIP /CoAA), e SWI /SNF /BAF250 [6]. FET DTN, incluindo as TAD potentes, são fundidos com domínios de ligação de ADN (DBDS) de vários factores de transcrição, em uma subclasse de sarcomas e outros cancros [5], o que leva a hiperactivação de actividade de transcrição correspondente. Novas evidências sugerem que as proteínas FET, full-length nativa se ligar e ativar as funções de fatores de transcrição específicos, em parte, através do recrutamento de co-fatores como CBP /p300 [4] – [5].

Resultados

AR e FUS são encontrados no complexo mesma proteína

LNCaP [7] recapitula características importantes de cancro da próstata, incluindo a expressão de ambos antigénio específico da próstata (PSA) e AR, bem como a sensibilidade para androgénio. Para a tela inicial, utilizou-se lisados ​​nucleares a partir de células LNCaP que foram tratados com o androgénio sintético R1881 (10 nM) durante 3 horas. Os lisados ​​foram imunoprecipitados com anticorpo anti-AR e as amostras foram submetidas a multidimensional tecnologia de identificação de proteínas (mudpit) [8]. Análise por espectrometria de massa identificou FUS, que pertence à família FET de proteínas que interagem com AR (Figura 1 A, Figura S1, S2 Figura e Tabela 1). Co-imunoprecipitação experimentos (co-IP), seguido por análise de transferência de Western validado interacção entre a RA e FUS (Figura 1B). co-imunoprecipitada (co-IP) com FUS, enquanto imunoprecipitação com controle isotipo IgG não pull-down AR ou FUS AR. Inversa de co-IP com anti-AR seguido por análise de transferência de Western com anticorpo anti-FUS também mostrou que interagiram com AR FUS (Figura 1C). Consistente com relatórios anteriores, o tratamento com R1881 aumentar os níveis da proteína AR.

In vivo

associação de FUS com AR foi confirmada utilizando extratos de xenoenxertos de LNCaP que foram cultivadas em camundongos antes ou após a castração (Figura 1D). Juntos, estes dados confirmam que associado AR e FUS dentro do mesmo complexo em células de câncer de próstata.

(A) Identificação do FUS como uma proteína que interage com AR por co-immunopreciptation (Co-PI), seguido por espectrometria de massa ( SENHORA). Espectros MS /MS de m /z 1660,77 (a partir de 831,39, 2+) de FU e duas outras apresentadas de material suplementar foram inequivocamente atribuído a sequência identificada LKGEATVSFDDPPSAK, APKPDGPGGGPGGSHMGGNYGDDR, e TGQPMINLYTDR, respectivamente. (B) de validação da interacção AR-FUS utilizando Co-IP seguido por análise Western Blot. células de LNCaP em cultura foram induzidos com 10 nM de R1881 durante 6 horas e os lisados ​​foram utilizados para inteiros IP com anticorpo anti-FUS, seguido por análise Western blot anti-AR (WB). (C) IP reversa com anti-AR seguido por WB com anticorpo anti-FUS. (D) IP de complexos endógenos de AR e de xenoenxertos de LNCaP FUS subcutâneas. Os tumores foram colhidos de ratinhos intactos (I), 10 dias após a castração (C10) ou 30 dias após a castração (C30). Lisados ​​de estes tumores foram usados ​​individualmente para IP com anticorpo anti-AR seguido por WB com anticorpos indicados.

localização subcelular da FUS em células de câncer de próstata

proteínas FET pode divergente ser localizada no núcleo e /ou citoplasma [5], [9]. Microscopia de imunofluorescência utilizando anticorpos direcionados contra proteínas endógenas foi realizada em células LNCaP. FUS foi exclusivamente localizada no núcleo (Figura 2A). FUS parecia estar localizada em manchas distintas no interior do núcleo (Figura 2A, B). A heterogeneidade na distribuição sub-nuclear de FUS entre a população de células foi observado (Figura 2A, B). coloração dupla mostraram co-localização de AR com FUS (Figura 2B) em células LNCaP que foram tratadas com 10 nM de R1881 durante 3 horas. O coeficiente de Pearson abordado 0,8 em algumas células dentro de regiões específicas de núcleos.

(A) A localização nuclear de FUS em células LNCaP. As células foram tratadas com R1881 (10 nM) durante 3 horas. imunofluorescência confocal foi realizada utilizando um anticorpo anti-FUS (verde) e as células foram contrastadas com DAPI (azul). (B) co-localização de AR e FUS. coloração dupla mostra a co-localização de AR (vermelho) com FUS (verde) em células LNCaP tratadas com 10 nM de R1881 durante 3 horas. A inserção no painel direito representa a célula designada com (*) após gating limite para remover a mancha verde brilhante central.

FUS tem atividade de transativação intrínseca em células de câncer de próstata

A TAD de proteínas FET pode conferir transactivação transcricional robusta em alguns tumores [4] – [5], mas isto não tem sido explorado em células de cancro da próstata. Aqui, foi utilizado o ensaio de transactivação de GAL4 para explorar se a actividade de transactivação pode ser atribuída ao FUS em células de cancro da próstata. construções quiméricas portadoras de comprimento completo FUS (ou fragmentos das mesmas) fundidos com o Gal4-DBD foram usadas para este ensaio (Figura 3A). PC3 células de cancro da próstata, desprovidas de AR funcional, foram co-transfectadas com cada uma das construções de fusão Gal4, e um gene repórter que contém os sítios de ligação de Gal4 mínimas (P5 × Gal4UAS-TATA-luciferase). GAL4-DBD isoladamente foi utilizado como um controlo negativo e tinha uma actividade mínima (Figura 3B). Em contraste, Gal4-luciferase induzida FUS actividade significativamente (Figura 3B), que foi consistente com ele que tem actividade intrínseca de transactivação. Para começar a delinear qual domínio (s) conta para esta capacidade de transativação intrínseca, empregamos duas construções. A primeira construção tinha o domínio de transactivação NTD (FUS-N) e o outro continha a RRM carboxilo terminal e RGGs (FUS-C) (Figura 3A). Ambos os fragmentos exibida actividades que eram comparáveis ​​aos de comprimento completo FUS (Figura 3B). Para avaliar a dependência do promotor contexto destas actividades, foi empregado um repórter diferente contendo os sítios de ligação de GAL4 mínimas e um elemento TATA, que estão justapostas no promotor E1a. Similar, embora geralmente mais elevadas, foi observada capacidade transactivação no contexto deste promotor como no promotor mínimo (Figura 3C). capacidade de transactivação forte das fusões GAL4-FUS também foi demonstrada em células LNCaP (Figura 3D).

(A) construções quiméricas de FU de comprimento completo, N ou C-fragmentos de FUS fundidos com o DBD de Gal4 . TAD domain = transativação; motivo RRM = reconhecimento de ARN; RGG = repetições de arginina contendo um tripéptido e duas glicinas. (B) atividade de transativação de FUS em células de câncer de próstata PC3. PC-3 de células em placas de 6 poços foram co-transfectadas com 50-100 ng de Gal4 quimera, e 1 ug do gene repórter pFR-LUC que contém sítios de ligação de GAL4 e um elemento TATA. DBD GAL4 sozinho serviram como um controlo negativo. 2 ug de plasmídeo vazio PGL2 foi adicionado a todas as misturas de ADN. (C) Como em (B), mas o plasmídeo repórter contido sites e elemento TATA justapostos para promotor E1a Gal4 vinculativo. (D) como em (B), mas com LNCaP em vez de células PC-3. Colunas = média ± desvio padrão. * P 0,05, n = 3.

FUS promove a atividade transcricional AR em células de câncer de próstata

Tendo demonstrado uma capacidade de transativação de FUS que era independente do promotor em células de câncer de próstata como descrito acima, que seguinte avaliou o envolvimento de FUS especificamente na actividade transcricional de genes alvo na AR. Dois siRNAs diferentes visando regiões independentes do mRNA cognato foram empregados para esgotar os níveis de FUS. AR actividade foi medida em células LNCaP co-transfectadas utilizando o PSA (6,1 kb) -luciferase construção de gene repórter. Este repórter contém as regiões do promotor de PSA e potenciadoras abrigando vários AREs que conferem indução por androgénios [10] – [11] de uma forma dependente da AR [12] – [13]. Relativamente ao controlo, a indução da actividade da luciferase R1881 foi significativamente reduzida após esgotamento de FUS sem reduzir os níveis de AR (Figura 4A). Para corroborar estes resultados com uma abordagem sobre-expressão, nós co-transf vector de expressão de AR, o plasmídeo repórter ARR3-tk-LUC, e várias quantidades de um plasmídeo permitindo a expressão FUS marcada com His em células HEK293. O repórter ARR3-TK-LUC contém seis Ares e é altamente induzível por androgénios. A sobre-expressão de FUS aumento da actividade transcricional AR medido como a actividade de luciferase a partir de ARR3-TK-LUC em uma maneira dependente da dose (Figura 4B, painéis superior e médio). His-FUS não alterou significativamente a actividade de transcrição na pRL-TK-LUC, o qual contém exclusivamente a timidina cinase (TK) do promotor basal (Figura 4B, painel inferior).

(A) Depleção de correlatos FUS com a diminuição da actividade de AR. Níveis de FU foram diminuídas nas células LNCaP utilizando ARNsi de segmentação duas regiões diferentes dos respectivos mRNAs e subsequentemente transfectadas com 1 ug de plasmídeo para a PSA (6.1) -luciferase. 2 ug do plasmídeo p-LUC vazio foi adicionado a todas as misturas de ARNsi /ADN. Os valores são por poço numa placa de 6 poços. As células foram tratadas com 10 nM de R1881 durante 24 horas. A análise Western blot das amostras correspondentes mostram níveis de FU, AR, e actina. (B) A expressão ectópica de FUS aumenta a actividade de AR. 293FT células em uma placa de 48 foram transfectadas com 15 ng de plasmídeo de expressão de AR, 620 ng de plasmídeo repórter ARR3-tk-luciferase, 62 ng de plasmídeo de luciferase de Renilla e quantidades indicadas de His-FUS plasmídeo de expressão. as actividades da luciferase foram normalizados com os de luciferase de Renilla que contém o promotor TK mínima. Valores acima de cada barra preta representam fold-indução por R1881 após a normalização (painel superior). A análise Western blot das amostras correspondentes mostram níveis de FUS, AR, e actina (painel do meio). UT: células não transfectadas. a actividade da luciferase de Renilla a partir das mesmas amostras normalizadas para proteína total serviu como um controlo de especificidade (painel inferior). Colunas = média ± desvio padrão. * P 0,05, n = 3.

Para determinar se FUS aumenta a expressão de genes endógenos, os níveis de proteína e ARNm de genes regulados por andrógenos conhecidas foram medidos próxima.

PSA

ARNm e ARNm a partir de cinco outros genes de androgénio indutível foram significativamente reduzidos após a depleção de FUS (Figura 5A).

TMPRSS2

ARNm foi reduzida em apenas um dos siRNAs, e o gene reprimido-androgénio,

CAMK2N1

não foi afectado por qualquer um dos ARNic (dados não mostrados). Consistente com os níveis reduzidos de ARNm, os níveis de proteína de PSA foram reduzidas significativamente em células LNCaP sobre a depleção de FUS (Figura 5B). Para determinar se FUS foi recrutado para o DNA com a AR em resposta ao andrógeno, foi realizado ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP). A imunoprecipitação dos complexos de ADN-proteína de ligação cruzada utilizando um anticorpo para FUS seguido por amplificação de ARE III do

PSA

gene FUS revelou que foi recrutado para isso são (Figura 5C). Colectivamente, estes dados sugerem que FUS aumenta a actividade de AR, pelo menos em alguns genes alvo, consistente com a forte função de transactivação intrínseca atribuída a FUS (Fig. 3).

os níveis de (A) de ARNm de genes regulados de androgénio. ARNsi de depleção mediada FUS diminui o ARNm cognato para PSA e vários outros genes alvo AR. qRT-PCR foi utilizado para medir os níveis de ARNm. Os valores representam proporções de sinais GAPDH-normalizados para os derivados a partir de células LNCaP transfectadas por simulação. As células foram tratadas durante 24 horas após a transfecção siRNA. (B) os níveis de proteína de PSA. As células LNCaP foram tratados durante 8 horas com 10 nM R1881 ou veículo seguintes siRNA transfecção e Western blot foi realizada para medir os níveis de PSA. (C) FUS é recrutado para o potenciador SÃO III do

PSA

gene. As células LNCaP foram tratadas com 10 nM de R1881 durante 6 horas. Chip foi subsequentemente aplicada e o DNA alvo foi amplificada por qPCR. Os valores representam a relação de sinais de ChIP anti-FUS ao do controlo do isotipo IgG. Colunas = média ± desvio padrão. * P 0,05, n = 3.

A depleção de FUS reduz a proliferação das células LNCaP

AR é essencial para o crescimento de células LNCaP [14]. Para avaliar se a diminuição da actividade de AR sobre a depleção de FUS resultaria na proliferação diminuída, foi realizada a análise do ciclo celular por citometria de fluxo. Como esperado, R1881 (0,1 nM) aumentou a população de células em fase S (dados não mostrados), que foi reduzido em -30% após esgotamento de FUS (Figura 6A). Notável, os dados foram obtidos a partir de transfecção transitória de siRNA resultando em esgotamento relativamente ineficiente de FUS (Figura 6B). Estes dados implicam uma função pró-crescimento de FUS na proliferação dependente de androgénios, o que é consistente com o aumento da actividade de transcrição AR.

(a) Fluxo quantificação citométrica de células em fase S. células LNCaP transfectadas com ARNsi foram tratados com 0,1 nM de R1881 durante 48 horas. As células foram marcadas com BrdU, coradas com anticorpo anti-BrdU conjugado com FITC e DAPI, e submeteu-se a citometria de fluxo. O gráfico à direita representa quantificação de células em fase S como uma relação aos respectivos controles. * P 0,05, n = 3. (B) Os níveis de proteína FUS em células tratadas com siRNA FUS. A análise Western blot dos níveis de controlo de carga e FUS actina que correspondem às amostras cujas-ciclo celular perfil é representada em (A).

Hormone-responsividade de expressão FUS

Expressão de alguns co-activadores de AR, tais como receptores de esteróides co-activadores (SRCs) é modulada por androgénios e /ou AR [15] – [17] como parte do que parece ser uma rede de mecanismos de alimentação para a frente e de re-alimentação. expressão FUS, no mRNA (Figura 7A, painel superior) e os níveis de proteína (Figura 7A, painel do meio), foi reprimido

in vitro

em células LNCaP após o tratamento 48 horas com 10 nM R1881. O tratamento de células LNCaP com 0,1 nM R1881 por período equivalente de tempo (48 horas), no entanto, teve efeitos desprezáveis ​​sobre a expressão de expressão FUS (Figura 7A, painel inferior). A imuno-histoquímica foi empregada para avaliar a expressão do gene FUS em xenoenxertos de LNCaP. amostras de tumor foram preparadas a partir de ratos (não castrado) e castrados intactas (10 dias pós-castração). Consistente com os

In vitro

dados com 10 nM R1881, castração resultou num aumento da expressão de FUS (Figura 7B).

(A) os níveis de ARNm FUS em resposta ao tratamento de androgénio. Painel superior: FUS expressão foi medida por qRT-PCR em células LNCaP tratadas com 10 nM R1881 para os pontos de tempo indicados. Painel central: análise Western blot dos níveis de FU, PSA e proteínas actina nos pontos de tempo indicados. Painel inferior: análise Western blot dos níveis de proteína FUS em células LNCaP que foram tratados com 10 nm versus 0,1 nM durante 48 horas. As barras de erro = média ± desvio padrão. * P 0,05, n = 3. níveis (B) FUS em resposta ao estado hormonal

in vivo

. xenoenxertos de LNCaP colhidas de ratinhos (não castrado) e castrados intactas (10 dias pós-castração) foram coradas para proteínas FUS e AR. níveis (C) FUS no câncer de próstata clínico versus tecido benigno correspondente. Os níveis de mRNA FUS em amostras clínicas de carcinoma da próstata contra o tecido prostático normal foram re-analisados ​​a partir de conjuntos de dados previamente obtidos utilizando Oncomine. As barras pretas indicam estudos onde FUS foi significativamente sobre-expresso em cancro contra o tecido benigno. * P . 0,05

expressão FUS tende a ser maior no carcinoma da próstata contra o tecido benigno

Para determinar se a expressão de FUS é alterada no cancro relação ao tecido da próstata benigna, Oncomine análise de banco de dados foi realizada utilizando sete coortes clínicas diferentes. Expressão de FU foi elevada no carcinoma da próstata em relação ao tecido utilizando dados benignos de três estudos (Figura 7C). No entanto, nos quatro estudos adicionais de tamanho comparável, não houve diferença significativa entre os níveis de ARNm FUS no carcinoma da próstata em comparação com os níveis no tecido prostático benigno.

Discussão

AR é essencial para todas as fases de progressão do cancro da próstata incluindo a fase terminal de CRPC. Subjacente a este papel da AR é uma interação dinâmica com vários co-ativadores e co-repressores. O âmbito da interacção proteína-proteína envolvendo patofisiologicamente relevantes AR nas células de cancro da próstata é, no entanto, não é totalmente conhecido. Aqui, mostramos pela primeira vez que FUS interagiu com AR endogenamente em células de câncer de próstata e ainda revelou o seguinte: (1) FUS tinha capacidade de transativação intrínseca em células de câncer de próstata; (2) FUS reforçada transcrição AR-mediada; (3) a depleção de FUS reduziu os níveis de expressão de genes induzida por andrógeno; (4) FUS foi recrutado a Ares em resposta ao andrógeno; (5) redução dos níveis de proliferação limitada FUS induzida por andrógeno; (6) níveis de FUS foram alteradas pelo status de andrógeno

in vitro

e

in vivo

; e (7) os níveis de FUS foram elevados em amostras clínicas de câncer de próstata.

Os domínios de ligação de DNA (DBD) receptores de esteróides mostrar alta homologia de sequência (por exemplo AR DBD tem 77% e 57% de semelhança de sequências com os do receptor de glicocorticóide e o receptor de estrogénio, respectivamente), e pode interagir com muitas das mesmas coactivadores. Usando proteínas recombinantes, FUS foi mostrado para interagir com os DBDs de retinóide X, o estrogénio, da tiróide e receptores de glicocorticóides, mas a RA não foi examinado [18]. A ligação do FUS para DBDs de outros receptores hormonais não interferem com as atividades de ligação a DNA, embora o papel da FUS em suas atividades de transcrição não foi avaliada [18].

Aqui, demonstramos que FUS abriga domínios de transactivação fortes que eram funcionais em células de cancro da próstata. A região C-terminal contendo os motivos RRM e RGG de EWS pode suprimir a capacidade de transactivação do NTD em células RK-13 ​​derivadas de rim de coelho [19]. Em contraste, observou-se aqui nenhuma função supressora da região C-terminal quando comparando-FUS comprimento completo para o fragmento 1-273 FUS que carece do RRM C-terminal e RGG motivos. Além disso, FUS 274-526 que contém os motivos RRM e RGG, mas não o TAD, exibido uma forte capacidade de transativação. Similar dados relação estrutura-função envolvendo FUS foram previamente relatados pelo uso das células embrionárias humanas de rim 293 [20]. Assim, existem domínios de transactivação funcionais em FUS outros do que os encontrados na sua DTN, pelo menos no cancro da próstata e células 293. Discrepâncias na literatura entre os domínios de transactivação FUS e EWS pode ser específico de células ou refletir divergência de domínio (identidade de 45%; 64% de similaridade) [5] entre EWS (a 699 aa longa proteína) e FUS (a 526 aa longa proteína).

a expressão de vários co-reguladores da AR é sensível aos andrógenos talvez como parte de mecanismos de feedback [15] – [17]. Expressão de FUS é sensível ao estado hormonal nas células do câncer de próstata. Em níveis fisiológicos de androgénio, expressão FUS foi relatado para ser significativamente reduzida em células LNCaP tratadas durante 48-96 horas com mibolerona 10 nM de [21], como também mostrado aqui com 10 nM R1881 (fig. 7A). No entanto, uma menor concentração de andrógeno, 0,1 nM R1881, não alterou significativamente os níveis de FUS

in vitro

, e

in vivo

castração níveis de andrógeno foram associados com aumento dos níveis de FUS. Este perfil de expressão se assemelha ao de co-activadores AR previamente caracterizados que são reprimidos por androgénios modestamente [15] – [16]. Curiosamente, a repressão destes co-activadores por androgénios é com uma cinética mais lenta que assemelham-se que a expressão de androgénio-responsivo de FU. A análise dos níveis de ARNm FUS em várias linhas celulares de cancro da próstata e não da próstata não revelou diferenças sistemáticas (Fig S3). Consistente com isto, a mineração de dados Oncomine de micromatrizes de amostras clínicas de vários tipos de tumores sólidos não apresentaram níveis FUS down-regulation significativa para cima ou em tumores da próstata em relação a outros tipos de tumor (Fig S4). Em contraste, a comparação dos dados de ARNm a partir de tecidos benignos contra adenocarcinoma da próstata revelou-se regulação da FUS em três estudos independentes e não houve diferença significativa em quatro outros. Nenhum estudo mostrou diminuição significativa da expressão de FUS no adenocarcinoma de próstata contra o tecido benigno.

ar atividade transcricional é necessário para a manutenção e crescimento da próstata, que constitui o fundamento lógico para as terapias de ablação do andrógeno para o cancro da próstata. Consistente com FUS ser um coactivador de AR e sua depleção reduzir a actividade transcricional AR e do crescimento dependente de androgénios, como mostrado aqui, entre os fenótipos proeminentes em FUS – /- ratos é esterilidade masculina, e órgãos reprodutores masculinos menores com aparente involução de algumas destas estruturas [22]. Estes fenótipos são uma reminiscência de AR – /- ratos, ou específica tipo mais refinado domínio- e células

AR

perturbações genéticas [23] – [24]. Assim, é possível que a depleção de FUS diminui a actividade de transcrição AR nestes tecidos dependentes de androgénio clássicas de acordo com os dados aqui apresentados. Estes dados estão em contraste com um relatório anterior que FUS sobreexpressão em células LNCaP, utilizando um sistema de tetraciclina induzivel e o tratamento subsequente com mibolerona 10 nM durante quatro dias, leva ao aparecimento de células sub-G1 /apoptóticas [21]. Curiosamente, não há células apoptóticas sub-G1 /foram detectados na ausência de androgénio, com ou sem sobre-expressão FUS [21]. Assim, nesses estudos FUS superexpressão conduziu a um efeito de alterações e pró-apoptótica de androgénio induzível na expressão de proteínas do ciclo celular [21].

Em geral, enquanto são necessários mais estudos para resolver o papel de FUS na próstata progressão da doença câncer, este estudo revelou que: 1) FUS interage com AR; e 2) FUS aumenta a atividade transcricional do AR.

Materiais e Métodos

Os plasmídeos, cultura celular e transfecções

plasmídeos de expressão FUS [20], p5 × Gal4UAS-TATA -luciferase [12], e o vector de expressão de AR, ARO, [25] foram descritos anteriormente. PFR-LUC foi obtido a partir de Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA. AR plasmídeo repórter, PSA (6,1 kb) -luciferase contém as regiões do promotor /potenciador do gene de PSA e foi fornecida pelo Dr. J.-T. Hsieh (University of Southwestern Medical Center, Dallas, TX). ARR3-TK-LUC contém três cópias da região de resposta de androgénio do rato

probasina

gene fundido para a timidina-quinase basal (TK) [26].

células LNCaP, obtido do Dr. Leland WK Chung (Samuel Oschin Cancer Institute completas, CA, EUA), foram cultivadas em RPMI contendo 5% de Soro Fetal Bovino (FBS) e foram usadas na passagem 39-50. As células HEK293 foram mantidas em DMEM contendo 10% de FBS. A menos que indicado de outra forma, as células foram incubadas em meio isento de fenol,-vermelho livre de soro durante 24-48 horas antes do tratamento com concentrações indicadas de R1881. A transfecção de células LNCaP foi realizada utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) para a realização de experiências com ARNsi ou lipofectamina (Invitrogen) para todos os outros, conforme as instruções do fabricante a 0,2-0,4% e 0,5% (v /v), respectivamente. FUS (HSC.RNAI.N001170634.11.7; HSC.RNAI.N001170634.11.8) e ARNsi de controlo (Invitrogen) foram usados ​​em concentrações de 10-50 nM. As células HEK293 foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 a 0,4% v /v. As quantidades exactas de plasmídeos por transfecção estão indicados na Figura lendas.

RT-PCR quantitativo

O ARN total foi preparado utilizando o kit RNeasy mini (Invitrogen). O ARN total (0,5 mg) foi transcritos de modo inverso por meio de oligo-dT escorva usando o kit SuperScript III (Invitrogen). O PCR foi realizado utilizando os iniciadores específicos do gene na presença de SYBR Green Supermix (Invitrogen) usando o tempo real da máquina de PCR ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O protocolo de ciclos térmicos foi como se segue: a 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 seg e 55 ° C durante 30 seg. Os valores Ct (limiar de número de ciclos) foram convertidos para significar expressão valores relativos ao

GAPDH

níveis, de acordo com o método Pfaffl. iniciadores FUS [5] e todos os outros iniciadores foram previamente descritos [27] – [28]

Imunofluorescência

As células foram lavadas com PBS e fixadas em paraformaldeído a 1% em PBS durante 30 min. . As células foram permeabilizadas em 0,1% de Trition X-100 em PBS duas vezes durante 5 min. Após o bloqueio durante 30 minutos em BSA a 2% em PBS contendo 0,1% de Trition X-100, as amostras foram incubadas com os anticorpos indicados (1:50) em tampão de bloqueio durante 1 h. As células foram lavadas com tampão de bloqueio 4 vezes e incubadas com FITC ou rodamina conjugada com IgG secundário apropriado (1:100) em tampão de bloqueio durante 45 minutos. Após 4 lavagens com PBS contendo 0,1% de Trition X-100, foi adicionada solução de montagem contendo DAPI-. As lâminas foram visualizadas usando usando Fluoview microscópio confocal (Olympus, Markham, ON, Canadá).

Células LNCaP

Co-imunoprecipitação e cromatina ensaio de imunoprecipitação

(2-3 × 10

6) foram colocadas em placas em pratos de 15 cm com meio RPMI contendo 5% de FBS. Após 24 horas, o meio foi mudado para meio RPMI sérica e fenol livre de vermelho e as células foram incubadas durante mais 24 horas. As células foram subsequentemente tratadas com R1881 (10 nM) ou o seu veículo (etanol) durante 6 horas. As células foram lavadas com PBS antes da colheita e depois lisadas com 1 ml de tampão de lise (Tris-HCl 20 mM pH 7,8, NaCl 140 mM, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,5% de Nonidet P-40) na presença de um cocktail de inibidores de protease (Roche, Mississauga, ON, Canadá). Os lisados ​​foram passados ​​através de 27-L agulhas cinco vezes e foram subsequentemente pré-limpo com /G esferas de agarose de proteína A (5% v /v) e uma mistura de IgG de rato e de coelho (2 ug /ml cada) durante 1 hora. O sobrenadante resultante foi incubado com os anticorpos específicos indicados incluindo AR 441, AR C19, e FUS (Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, EUA) a uma concentração de 1-2 ug /ml durante 16-24 horas. /G esferas de agarose de proteína A (5% v /v) foram adicionados subsequentemente e a mistura foi incubada durante mais 3 horas. As esferas foram lavadas com 1 ml de tampão de lise a cinco vezes e, em seguida, ressuspensas em 40-80 ul de tampão de amostra de SDS padrão.

ensaio de imunoprecipitação da cromatina foi realizada como descrito [27]. Resumidamente, as células foram tratadas com R1881 (10 nM) ou veículo durante 6 horas e, subsequentemente, foram fixadas com formaldeído a ligação cruzada da cromatina. Após sonicação ao cisalhamento da cromatina /ADN, os lisados ​​foram preparados e imunoprecipitados com os anticorpos indicados. ADN alvo foi medida por PCR em tempo real utilizando a real-time PCR máquina ABI 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os valores foram normalizados contra sinal do respectivo controle IgG.

análises Western blot

As amostras foram carregados em 10% com base em glicina Tris /géis de SDS-poliacrilamida. As proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EUA) de acordo com protocolos padrão, utilizando tampão Tris /glicina transferência baseada no sistema submarino de Bio-Rad (Mississauga, ON, Canadá). As manchas foram sondadas com anticorpos seguintes: AR PG21 (1:1000) (Upstate Biotechnology, Waltham, MA, EUA); AR 441 (1:500), ou FUS 4H1 (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology Inc).

ensaio Proliferação

células LNCaP (5 × 10

5) em 10