PLOS ONE: P120-catenina isoformas 1 e 3 regulam a proliferação e ciclo celular de células do cancro do pulmão através de β-catenina e Kaiso Respectively

Abstract

Fundo

Os diferentes mecanismos envolvidos na p120- catenina (p120ctn) 1/3 regulação da progressão do ciclo celular ‘isoformas ainda não estão elucidados até à data.

métodos e resultados

Nós descobrimos que tanto a ciclina D1 e ciclina e poderia ser efetivamente restaurado por restituição de p120ctn-1A ou p120ctn-3A em p120ctn empobrecido células de câncer de pulmão. Quando a expressão da ciclina D1 foi bloqueada pela co-transfecção com D1 siRNA de ciclina em células p120ctn empobrecido restaurando p120ctn-1A ou 3A, a expressão da ciclina E foi ligeiramente diminuída, não aumentou, o que implica que as isoformas p120ctn 1 e 3 não pode up- regular a ciclina E diretamente, mas podem fazê-lo através de up-regulação da ciclina D1. Curiosamente, a sobre-expressão de p120ctn-1A aumentou β-catenina e expressão da ciclina D1, enquanto que o co-transfeco com siRNA alvejando β-catenina suprime o efeito de p120ctn-1a na sobre-regulação da ciclina D1, sugerindo um papel de β-catenina na mediação p120ctn-1A função reguladora do sobre a expressão da ciclina D1. Por outro lado, a sobre-expressão de 3A p120ctn isoforma reduzida localização nuclear Kaiso, diminuindo deste modo a ligação de Kaiso para KBS no promotor de ciclina D1 e aumentando, assim, a expressão do gene de ciclina D1, aliviando o efeito repressor de Kaiso. Uma vez que sobre-expressam NLS-p120ctn-3A (p120ctn-3A nucleares plasmídeos de localização alvo) ou inibir a exportação nuclear de p120ctn-3 por Leptomycin B (LMB) causada translocação de Kaiso para o núcleo, é plausível que a exportação nuclear de Kaiso é p120ctn- 3-dependente.

Conclusões

os nossos resultados sugerem que as isoformas p120ctn 1 e 3 sobre-regular a ciclina D1, ciclina e e, assim, o que resulta na promoção da proliferação celular e na progressão do ciclo celular de pulmão células cancerosas, provavelmente através de diferentes mediadores protéicos, nomeadamente, β-catenina para isoforma 1 e Kaiso, um fator de transcrição negativo da ciclina D1, para isoforma 3.

Citation: Jiang G, Wang Y, Dai S, Liu Y , Stoecker M, Wang E, et al. (2012) P120-catenina isoformas 1 e 3 regulam a proliferação e ciclo celular das células cancerosas do pulmão através de β-catenina e Kaiso respectivamente. PLoS ONE 7 (1): e30303. doi: 10.1371 /journal.pone.0030303

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de outubro de 2011; Aceite: 13 de dezembro de 2011; Publicação: 20 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (concede 81.071.905 para Enhua Wang, 30.901.475 de Yan Wang, 81.071.717 para Shundong Dai, e 30.900.562 de Yang Liu). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em células cancerosas, β-catenina, um factor-chave da via canônica de sinalização Wnt, acumula-se no citoplasma e, em seguida, transloca para o núcleo para formar um complexo com o fator de transcrição Lef /TCF (Lef, potenciador linfóide fator; TCF, proteína do factor de células T), o qual activa subsequentemente os genes Wnt-responsivas, incluindo ciclina D1 [1]. Anteriormente, relataram que uma das isoformas p120ctn, p120ctn-1, pode-se-regular a expressão β-catenina, ao passo que uma outra isoforma p120ctn, p120ctn-3, não podia [2] – [3]. Interessantemente, ambas as isoformas p120ctn 1 e 3 poderia afectar a proliferação celular e na progressão do ciclo celular, que são conhecidas por ser mediada por ciclina D1 [2] – [4]. É, portanto, razoável especular que p120ctn-1 regula a proliferação das células e ciclo celular através β-catenina induzida sobre-regulação da ciclina D1. No entanto, o mecanismo molecular subjacente pelo qual p120ctn-3 regula a proliferação celular ea progressão do ciclo celular ainda não está claro neste momento.

O nosso estudo anterior demonstrou que Kaiso, um nuclear BTB /POZ-ZF (BTB, Broad complexo, Tramtrack, Bric à brac; POZ, poxvírus eo dedo de zinco; ZF, dedo de zinco) fator de transcrição, pode ligar-se a p120ctn no tecido do cancro do pulmão e cancro do pulmão células [5]. Embora conhecido por ser um componente do complexo /p120ctn Kaiso, cada isoforma p120ctn indivíduo pode possuir uma afinidade de ligação diferente, enquanto a Kaiso [6]. De interesse, a região do promotor de ciclina D1 (contém sítios de ligação Kaiso-KBS), uma sequência de ADN de consenso que pode ser reconhecido por Kaiso [7] – [8]. Portanto, a ciclina D1 também pode ser um potencial alvo a jusante do gene de Kaiso [9] – [10]

Uma vez que o domínio de ligação de Kaiso com p120ctn é completamente sobreposto com a sequência de DNA específica do elemento KBS no ciclina. promotor D1 [9] – [11], os autores sugerem que p120ctn-3 poderia competir com KBS no gene de ciclina D1 para se ligar a Kaiso e revogar repressão Kaiso-mediada de ciclina D1, aumentando assim a expressão da ciclina D1, bem como a ciclina e , o que acabaria por promover a progressão do ciclo celular. Para testar a nossa hipótese, no presente estudo, foi reconstituído p120ctn-1A e 3A, respectivamente em células p120ctn esgotado e sobre-expressos ou derrubado Kaiso ou β-catenina para testar os efeitos na expressão de ciclina D1 e ciclina E. O objetivo foi investigar a mecanismos moleculares diferentes potenciais pelos quais p120ctn-1 e 3 regulam a proliferação celular e o ciclo celular em células de cancro do pulmão. Dois mutantes de deleção de p120ctn isoforma 1, que variam em suas estruturas N-terminais, foram construídos para estudar as diferentes funções do p120ctn-1 e 3.

Resultados

Ambos p120ctn 1A e 3A poderia sobre-regular a ciclina D1 e ciclina expressão de e, que afectam a proliferação celular e na progressão do ciclo celular em células do cancro do pulmão

Se p120ctn actua como um supressor de tumor ou um promotor de metástases depende em grande medida, se a expressão de e-caderina é baixo -regulated, completamente perdida a partir da junção célula-célula ou intactas [12]. Portanto, é crucial para determinar se a E-caderina está localizada na membrana das células de cancro do pulmão humano. Neste estudo, constatou-se que nenhuma localização membranoso visível de qualquer proteínas p120ctn-1/3 ou E-caderina em linhas de células A549 ou SPC (Figura S1). Eles não mostraram distribuição predominantemente citoplasmática. Após p120ctn foi derrubado em células A549, as expressões de ciclina D1 e ciclina E foram significativamente reduzidos em níveis de ambas as proteínas (Figura 1A) e transcrição (Figura S2A). Em conformidade, a proliferação celular foi suprimida de forma eficaz (

P

0,01, Figura 1B), indicado por mais G

1 células em fase e as células em fase S menos detectada (

p = 0,001

, Figura 1C). Além disso, a ciclina D1 e ciclina E poderia ser eficazmente restaurada pela restituição de p120ctn-1A ou p120ctn-3A em células A549 p120ctn empobrecido (Figura 2A e Figura S2B), e a proliferação de células e ciclo celular também pode ser restaurado, presumivelmente correspondentes ao plenitude da ciclina D1 e ciclina e (

p Art 0,05, Figura 2B e C). Resultados semelhantes foram obtidos em células SPC-K2 em que p120ctn expressão constitucionalmente foi empobrecido (Figura S3).

(a) Os resultados da análise de Western blot mostrou que as proteínas ciclina D1 (*,

p

= 0,001) e ciclina e (*,

p

= 0,004) foram significativamente reduzidas após p120ctn foi derrubado em células A549. (B e C) Os resultados de MTT e citometria de fluxo mostrou capacidade proliferativa celular suprimida, aumentou G

1 células de fase (*,

p

= 0,001) e células reduzidas de fase S (*,

p

= 0,001) foram detectados em células A549 com derrubado p120ctn. Todas as comparações foram feitas com os grupos de células A549 ou células transfectadas apenas com vector.

p120ctn-1A ou plasmídeos 3A (A) foram transfectadas em células A549 depletados de p120ctn (Si-P120 + 1A ou si-p120 + 3A), mostrando os níveis de proteína significativamente recuperado de ciclina D1 (*,

p Art 0,001, **,

p Art 0,001) e ciclina e (* ,

p Art 0,001, **,

p Art 0,01). (B e C) Os resultados de MTT e citometria de fluxo mostraram que a proliferação celular foi efetivamente restaurado (

p Art 0,01), G

1 células em fase foram significativamente menores (*,

p

= 0,001, **,

p

= 0,004) e células em fase S foram significativamente aumentados (*,

p = 0,004

, **,

p = 0,028

) depois que as células A549 p120ctn empobrecido foram transfectadas com p120ctn-1A ou 3A. Todas as comparações são feitas com os grupos de células A549 e as células transfectadas apenas com vector.

, em seguida, encontrado que a depleção de ciclina D1 por siRNA em células A549 também levou à diminuição da expressão de ciclina E ( A Figura 3A e Figura S4A), a supressão da proliferação de células (

P

0,01, Figura 3B), a elevação de células L 1

de fase e diminuição em células em fase S (

P

= 0,009, Figura 3C), o que foi comparável à interferência de p120ctn. Em contraste, não foi observada nenhuma alteração na expressão da ciclina D1 quando ciclina E foi esgotada por siARN (Figura 3A e Figura S4A), sugerindo uma relação reguladora unidireccional entre ciclina D1 e ciclina E. Curiosamente, quando siRNA de ciclina D1 foi co-transfectado com isoforma p120ctn 1 ou 3 em que as células desprovidas de p120ctn, a expressão da ciclina e não foi aumentada, mas diminuiu ligeiramente (Figura 3D e Figura S4B), e foi observado um fenómeno semelhante ao da ciclina D1 foi bloqueada por incubação do anticorpo monoclonal (100 ng /mL, 48 h) em células p120ctn reconstituído (Figura S5). Esta descoberta implica que p120ctn isoformas 1 e 3 não pode regular positivamente ciclina E diretamente, mas pode fazê-lo através up-regulação da ciclina D1. Todos estes resultados sugerem que p120ctn promove a progressão do ciclo celular por cima de regulação da ciclina D1, que aumenta subsequentemente a expressão de ciclina E.

(A) a depleção de ciclina D1 por siRNA em células A549 levou a uma redução da expressão de ciclina E, mas, inversamente, a expressão da ciclina D1 foi não significativamente alterada (

P

= 0,944) em células com derrubado ciclina e por ARNsi, sugerindo uma relação reguladora unidireccional entre ciclina D1 e ciclina E. (B e C) proliferação celular esgotamento suprimida ciclina D1 (

p Art 0,01),

1 células em fase elevados G (

p

= 0,016) e diminuição das células em fase S (

p

= 0,009). (D) após a co-transfecção de siRNA-D1 ciclina com p120ctn isoforma 1 ou 3, em que as células desprovidas de p120ctn durante 48 horas, a expressão da ciclina e não foi aumentada, mas foi ligeiramente diminuída. Todos estes resultados sugerem que p120ctn promove a progressão do ciclo celular por cima de regulação da ciclina D1, que aumenta subsequentemente expressão de ciclina E. A comparação é feita com o grupo de controlo de células transfectadas com ARNsi não-alvo ou vector sozinho.

p120ctn isoforma 1 poderia up-regular a expressão da ciclina D1 através de β-catenina

uma vez que temos confirmado que tanto p120ctn-1A e p120ctn-3A pode regular positivamente ciclina D1, foi levantada a questão se o mecanismos moleculares subjacentes foram os mesmos entre as duas isoformas. Para responder a esta pergunta, p120ctn-1A e p120ctn-3A foram respectivamente transfectado em p120ctn derrubado células SPC, os quais foram designados como SPC-K2. A sobre-expressão de p120ctn-1A poderia aumentar a expressão β-catenina (* p = 0,001, Figura 4A), mas a sobre-expressão de p120ctn-3A tinha essencialmente qualquer efeito sobre a proteína β-catenina (** p = 0,769, Figura 4A). De interesse, nem p120ctn-1 nem 3 pareceu ter efeito sobre a transcrição de β-catenina (* p = 0,463, ** p = 0,401, Figura 4B).

células SPC-K2 foram transfectadas com p120ctn -1A ou 3A, respectivamente, e a expressão de β-catenina e kaiso foi medida por western blot (a) e RT-PCR (B). A expressão da proteína de β-catenina foi significativamente aumentada (*,

P

= 0,001) nas células transfectadas com ADNc de p120ctn-1A, mas não mostrou nenhuma mudança significativa (**,

P

= 0,769) em p120ctn-3A superexpressando SPC-K2. Nem p120ctn-1 nem 3 pode afetar a transcrição da

β-catenina

(*

p

= 0,463, **

p

= 0,401) ou a expressão de Kaiso. Todas as comparações são feitas com o grupo de células transfectadas com vector sozinho.

Como se mostra na Figura 5, a sub-regulação de β-catenina por siARN (Si-β-CAT) resultou em ciclina reduzida expressão D1 no A549, e p120ctn bater-down (si-p120) resultou em redução β-catenina ativa e ciclina D1. Além disso, β-catenina e ciclina D1 níveis activos pode ser restaurada através da transfecção p120ctn-1A (Si-P120 + 1A). No entanto, a expressão da ciclina D1 não foi restaurada por co-transfecção de p120ctn-1A e siRNA -β-catenina (Si-P120 + 1A + SI-β-gato), sugerindo que p120ctn-1A regulada para cima ciclina D1 através β-catenina. Transfecção de p120ctn-3A nas células desprovidas de p120ctn (si-p120 + 3A) não poderia up-regular os níveis de β-catenina ativos, mas ainda pode restaurar significativamente a expressão da ciclina D1, o que implica que p120ctn-3 up-regula a expressão da ciclina D1 independente de β-catenina. Além disso, quando p120ctn-3A foi co-transfectado em células A549 depletados de ambos p120ctn e β-catenina (Si-P120 + 3A + SI-β-CAT), a expressão da ciclina D1 foi significativamente aumentada em comparação com o grupo empobrecido de p120ctn e β-catenina sem restituindo p120ctn-3A (SI-P120 + SI-β-cAT); ao passo que, sem alterações no nível β-catenina activo foi observada em p120ctn e β-catenina de células esgotadas dupla, apesar da sua aparente restituição de p120ctn-3A (SI-P120 3A + + SI-β-gato). Foram obtidos resultados semelhantes em experiências realizadas em células SPC (Figura 5). Dois resultados interessantes foram observadas em nosso estudo. 1). O efeito da p120ctn-1A na expressão de ciclina D1 parece ser mais proeminente do que a de p120ctn-3A, uma vez que a expressão da ciclina D1 induzida pela restituição de p120ctn-3A foi sempre menor do que a induzida pela restituição de p120ctn-1A ou ainda menor do que as células não tratadas; 2). A restauração da ciclina D1 induzida pela restituição de p120ctn-3A em células desprovidas de ambos p120ctn e β-catenina (Si-p120ctn + 3A + SI-β-gato) parecia estar incompleta quando comparada com as células desprovidas de p120ctn sozinho ( si-p120 + 3A). A diferença entre estes dois grupos pode ser explicada pela β-catenina endógena no segundo, que foi suprimida de forma sinérgica por siRNA-β-catenina no ex.

A expressão de β-catenina activo e ciclina D1 foram significativamente reduzida em células A549 (β-catenina, +

p Art 0,001, ++

p Art 0,001, ciclina D1, +

p = 0,003

, + +

p

= 0,004), quando β-catenina ou p120ctn foi interferido (si-β-gato ou si-p120). A expressão de β-catenina activo (*

p

= 0,001) e ciclina D1 (*

p Art 0,001) recuperou quando a expressão-1A p120ctn foi reconstituído por cDNA p120ctn-1A transfecção ( si-p120 + 1A). Co-transfecção de p120ctn-1A eo siRNA alvo β-catenina (si-p120 + 1A + si-β-gato) não mostrou nenhuma mudança da ciclina D1 (

Δ

p

= 0,248) expressão, sugerindo que p120ctn-1A-se regula-ciclina D1 através β-catenina. Restauração de p120ctn-3A (si-p120 + 3A) não aumentou a expressão de β-catenina ativa (**

p

= 0,891), mas ainda poderia restaurar a expressão da ciclina D1 (**

p

= 0,001), o que implica que p120ctn-se 3-regula a expressão de ciclina D1 independente de β-catenina. A co-transfecção de p120ctn-3A e os siRNAs segmentação p120ctn /β-catenina (Si-P120 + 3A + SI-β-CAT) pode aumentar significativamente a expressão de ciclina D1 na linha celular A549, em comparação com o grupo de p120ctn /β-catenina siRNA transfecção sozinho (si-p120 + si-β-gato,

ΔΔ

p Art 0,01), ao passo que, co-transfecção de p120ctn-3A parece não ter impacto sobre os níveis de β ativa -catenina. Resultados semelhantes foram obtidos em células de CCP. Note-se, embora a expressão da ciclina D1 é restaurada pela restituição de qualquer p120ctn 1A ou 3A p120ctn, o efeito de resgate é mais visível, por p120ctn 1A do que pela 3A p120ctn. A diferença entre o grupo Si-P120 + 3A e o grupo Si-P120 3A + + SI-β-gato pode ser explicado por um efeito residual de endógena β-catenina no ex. Este efeito residual endógena β-catenina também pode ser visto na diferença entre Si-Si-P120 e P120 + SI-β-gato, em ambas as linhas celulares. Um efeito sinérgico resultando em diminuição adicional em ambos β-catenina e ciclina D1 pode ser visto no último grupo.

β-catenina foi observada distribuição em células A549 e SPC em ambos núcleo e citoplasma sob confocal microscopia de laser. O seu sinal se tornou significativamente mais fraco em zonas subcelulares correspondente quando p120ctn foi esgotado. A sobre-expressão de p120ctn-1A resultou num sinal β-catenina mais forte. Em contraste, p120ctn-3A tem nenhum efeito apreciável sobre a expressão de β-catenina (Figura S6).

Para testar adicionalmente a função destas duas isoformas, que transfectadas dois mutantes de deleção de p120ctn-1, M1 e M2 , na p120ctn depleção de células A549 (Figura 6). Os resultados mostraram que M1 pode sobre-regular β-catenina M2 mas não poderia, o que implica que os resíduos N-56-101 aminoácidos de p120ctn-1 são essenciais para a regulação para cima-β-catenina. Por isso, pode ser devido a supressão de N-56-101 resíduos de aminoácidos para p120ctn-3 a falhar para regular o nível de proteína β-catenina.

Dois mutantes de deleção de p120ctn-1, M1 e M2 foram transfectadas em células A549 p120ctn empobrecido. Os resultados mostraram que M1 pode regular positivamente β-catenina (***

p Art 0,001), enquanto que M2 não podia (****

p

= 0,175). M1 pode up-regular a expressão de ciclina D1 (***

p Art 0,001), mas não podia M2 (****

p

= 0,906). Portanto, pode ser devido a deleção dos resíduos de aminoácidos N-56-101 para p120ctn-3 a falhar para regular β-catenina. Todas as comparações são feitas para o grupo de células co-transfectadas apenas com vector.

p120ctn isoforma 3 poderia up-regular a expressão da ciclina D1, regulando a /shuttle citoplasmática nuclear de Kaiso

Para testar se Kaiso tem um papel na regulação da expressão de ciclina D1, que transitoriamente transfectadas Kaiso em células A549, que expressam apenas uma quantidade menor de Kaiso. Kaiso superexpressão levou a uma redução da ciclina D1 e expressão da ciclina E (Figura 7A e Figura S7A). Do mesmo modo, quando Kaiso foi derrubado por siRNA, foi reforçada ciclina D1 e expressão da ciclina E em células SPC, que expressam níveis relativamente altos de Kaiso (Figura 7B e Figura S7B).

análises de Western blot (A) mostrar a expressão aumentada de Kaiso em células A549 transf ectadas com ADNc de Kaiso. Kaiso superexpressão notavelmente regulada negativamente a expressão de ciclina D1 (p = 0,000) e a ciclina E (p = 0,003). (B) Western blot análises mostram reduzida expressão de Kaiso em células SPC transfectadas com Kaiso siRNA. interferência kaiso aumentou significativamente a expressão da ciclina D1 (p = 0,001) e a ciclina E (p = 0,012). Constatações gerais sugerem que Kaiso poderia regular a expressão de ciclina D1 e ciclina E. (C) Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP) ensaio confirmou que o anticorpo monoclonal Kaiso pode precipitar o fragmento de promotor de gene de ciclina D1 contendo KBS. Kaiso poderia vincular a KBS de promotor da ciclina D1. Todas as comparações são feitas para o grupo de células transfectadas apenas com vector

Usando BLAST para encontrar a sequência do promotor da ciclina D1. (GenBank: AY439218.1), identificou-se a sequência de ligação ao Kaiso específico (KBS , TCCTGCNA), que se situa na região de -1059 pb a -1.066 pb. O chip foi então ensaio realizado e mostrou que Kaiso foi associada com KBS sobre o promotor de ciclina D1 em ambas as A549 e células de CCP (Figura 7C).

Co-imunoprecipitação foi realizada seguindo o fraccionamento de células. Os ensaios revelaram que o anticorpo monoclonal pode p120ctn eficazmente precipitar a proteína Kaiso em ambos citoplasma e núcleo, enquanto o p120ctn-1, 2 anticorpos monoclonais (6H11) não pode fazê-lo (Figura 8A e B) específico. Quando se repetiu o co-imunoprecipitação após sobre-expressão de isoformas p120ctn 1 e 3, respectivamente, foi mostrado que a sobre-expressão de p120ctn-3A levou a mais proteína Kaiso precipitado pelo anticorpo monoclonal p120ctn, mas não houve nenhuma alteração depois de sobre-expressão de p120ctn-1A em comparação com o controlo. Quando o p120ctn-1 específico, 2 anticorpos monoclonais (6H11) foram utilizados, Kaiso não podia ainda ser precipitado após p120ctn-1A foi significativamente aumentada (Figura 8C). Uma vez que existem principalmente isoforma p120ctn 1 e 3 em ambas as linhas de células de cancro do pulmão, pensamos que Kaiso pode ligar-se a isoforma p120ctn 3, mas não para p120ctn isoforma 1 in vivo em função dos resultados acima mencionados.

(A e ensaios B) Co-imunoprecipitação mostrou que o anticorpo monoclonal p120ctn (o painel inferior da coluna da esquerda na Figura 8A), mas não 1,2-p120ctn anticorpo monoclonal específico (6H11) (painel inferior da coluna da direita na Figura 8A), pode eficazmente precipitar a proteína Kaiso tanto no núcleo e no citoplasma (Figura 8B). No entanto, o anticorpo monoclonal Kaiso não pode efectivamente precipitar p120ctn (o painel superior da coluna do meio na Figura 8A). (C) Co-imunoprecipitação com o mAb p120ctn suficiente após a sobre-expressão de p120ctn-1 ou 3 isoforma mostrou que a sobre-expressão de p120ctn-3 conduziu a mais proteína Kaiso precipitado em células A549. Nenhuma mudança foi detectado quando p120ctn isoforma 1 foi sobre-expresso, em comparação com o controlo. p120ctn-1 específico, 2 anticorpos monoclonais (6H11) não pode precipitar Kaiso quando p120ctn isoforma 1 foi significativamente aumentada. Observe a presença de p120ctn após coprecipitação com 6H11, mas ausência de kaiso no precipitado, sugerindo que não há interação significativa entre p120 isoforma 1, 2 e kaiso. Uma vez que existem isoformas principalmente p120ctn 1 e 3 em ambas as linhas celulares de cancro do pulmão, pensamos que Kaiso pode ligar-se a p120ctn isoforma 3, mas não p120ctn isoforma 1 in vivo.

Kaiso está principalmente localizada no citoplasma de células de CCP, que expressam níveis relativamente elevados de p120ctn. Por outro lado, quase todas as proteínas Kaiso estão presentes com distribuição nuclear em células SPC-K2, que p120ctn esgotado. Foram examinados os efeitos diferentes de duas isoformas p120ctn em Kaiso localização subcelular seguinte restituição de duas isoformas, respectivamente em células SPC-K2. Restauração da isoforma 3 p120ctn por transfecção de p120ctn-3A induzida distribuição citoplasmática de Kaiso, enquanto Kaiso permaneceu essencialmente em núcleos de células SPC-K2 quando p120ctn isoforma 1 foi restaurada por transfecção de p120ctn-1A (Figura S8A). Da mesma forma, Kaiso foi localizada predominantemente nos núcleos de células A549, que expressam apenas uma quantidade menor de p120ctn. A sobre-expressão de p120ctn-1A não alterou significativamente a distribuição de Kaiso, enquanto que a sobre-expressão de p120ctn-3A resultou em Kaiso exportação do núcleo (Figura S8B). Estes resultados sugerem que um alto nível de p120ctn-3A pode ser capaz de promover a exportação nuclear de Kaiso, mas p120ctn-1A não parece ter essa função.

Além disso, quando as células A549 transfectadas com p120ctn-3A foram incubadas com LMB para bloquear a exportação nuclear de p120ctn isoforma 3, Kaiso foi anotado para ser confinado no núcleo juntamente com p120ctn isoforma 3. Correspondentemente, a sobre-expressão de p120ctn-3A por transfecção de NLS-p120ctn-3A, alvo nuclear um p120ctn-3A plasmídeo de localização, em células SPC-K2 resultou numa distribuição de Kaiso predominantemente no núcleo (Figura S8B).

confirmou ainda mais a distribuição citoplásmica e nuclear de p120ctn Kaiso e por transferência de Western após fraccionamento celular (Figura 9A ). Os resultados foram consistentes com os observados nos ensaios de imunofluorescência descrito acima.

(A) transfecção de p120ctn-3A em células A549 aumentou significativamente Kaiso no citoplasma (CYTO, *, p = 0,000) e reduzida em Kaiso o núcleo (NE, *, p = 0,000). No entanto, não houve diferença significativa de localização subcelular de Kaiso entre as células superexpressão p120ctn-1A e células de controlo (CYTO, **, p = 0,135, NE, **, p = 0,774). Estes resultados sugerem que um elevado nível de p120ctn-3A pode ser capaz de promover a exportação nuclear de Kaiso, mas não p120ctn-1A não parecem ter esta função. As células transfectadas com p120ctn-3A com LMB ou transfecção de incubação NLS-p120ctn-3A em células A549 aumento p120ctn-3A nuclear (*, p = 0,000, ou +, P = 0,000) e Kaiso nucleares (NE, +, P = 0,000 ou ++ p 0,001), mas reduziu citoplasmática Kaiso (CYTO, +, P = 0,000 ou ++, p = 0,002) em comparação com as células somente com sobre-expresso p120ctn-3A, implicando que a exportação nuclear de Kaiso é provável que seja p120ctn-3-dependente. (B) p120ctn-1A superexpressão não alterou a ligação de Kaiso para KBS sobre o promotor de ciclina D1, enquanto que a sobre-expressão p120ctn-3A reduziu significativamente a ligação de Kaiso para KBS no promotor de ciclina D1.

alguns resultados interessantes foram observadas em ensaios de ChIP subsequentes. Superexpressão de p120ctn-3A reduzido significativamente a ligação de Kaiso a KBS, enquanto a superexpressão de p120ctn-1A não alterou a ligação (Figura 9B).

Em resumo, os resultados acima sugerem que p120ctn-3A provável para cima regular a ciclina D1, facilitando a exportação nuclear de kaiso e, portanto, abolir o efeito negativo da Kaiso na expressão do gene ciclina D1.

Discussão

Nós demonstramos que a depleção de p120ctn em células A549 e SPC, que não mostram nenhuma localização p120ctn membranosa, resultou num aumento das células em fase G1 e as células em fase S, bem como a proliferação celular reduzida diminuiu, sugerindo p120ctn pode afectar a progressão do ciclo celular e a proliferação celular. Uma vez que a expressão reduzida de ciclina D1 e ciclina E foi observada nas células p120ctn empobrecido, pensava-se que p120ctn pode regular a progressão do ciclo celular e a proliferação das células, alterando a expressão de ciclina D1 e ciclina E, os moduladores essenciais da fase G0 /G1-S checkpoint [13]. Nicolas T. et ai. relataram que p120ctn isoforma 3 poderia afectar ciclo celular e a proliferação celular através da estabilização de ciclina E [4]. Em contraste, os nossos dados sugerem um mecanismo diferente pelo facto de que o aumento da expressão da ciclina E correspondeu a sobre-regulação da ciclina D1 nas células esgotadas de p120ctn mas repletos de qualquer p120ctn-1A ou 3A. Além disso, quando derrubado ciclina D1 por ARNsi nas células esgotadas de p120ctn, a expressão da ciclina E não foi aumentada, mas diminuiu ligeiramente, embora isoforma p120ctn 1 ou 3 foi aparentemente restaurada por co-transfecção de qualquer um dos plasmídeos de ADN isoforma. Um fenómeno semelhante foi observado quando da ciclina D1 foi bloqueada pelo anticorpo monoclonal de incubação (100 ng /mL, 48 h), em células p120ctn reconstituído, implicando um papel central da ciclina D1 na regulação da expressão da ciclina E por qualquer isoforma p120ctn uma isoforma ou 3. Além disso , quando a tradução de ciclina D1 mRNA em A549 foi interrompida por ARNsi, ambos os níveis de transcrição e proteínas de ciclina e foram correspondentemente regulada para baixo, o que sugere p120ctn pode não só estabilizar proteína e ciclina como relatado anteriormente, mas também promover a transcrição de ciclina e, presumivelmente através uma maior expressão da ciclina D1.

os dados do presente estudo demonstrou tanto p120ctn isoforma 1 e 3 pode up-regular a expressão da ciclina D1, embora não tenha sido totalmente elucidado como as diferentes isoformas p120ctn, particularmente isoforma 3 , alcançar esta função. O nosso estudo mostrou que a isoforma p120ctn 1 pode regular positivamente a expressão de β-catenina, especialmente aumentando a forma activa de β-catenina, enquanto isoforma 3 poderia interagir com Kaiso. Embora isoforma p120ctn 1 foi sobre-expresso em células A549 transf ectadas com p120ctn-1A, o /complexo p120ctn-1 Kaiso permaneceu sem ser detectado, o que implica um baixo nível de p120ctn isoforma 1 em A549 não é a causa deste complexo proteína indetectável. Desse modo, são levantadas questões a respeito de porque isoforma 1 não poderia interagir com Kaiso e por isoforma 3 não poderia regular positivamente β-catenina. Colocámos a hipótese de que a diferença funcional pode ser devido às variações estruturais destas duas isoformas na extremidade N-terminal. O gene humano CTNND1 compreende 21 exões e codifica potencialmente até 48 isoformas de proteínas devido a vários eventos de splicing inter- e intra-exónicos alternativos [14]. isoformas humanos, designados 1 a 4, diferem uns dos outros no codão de iniciação usado. Vários domínios foram identificados em p120ctn, incluindo o domínio espiral enrolada encontrado somente em isoforma 1. Na verdade, p120ctn isoforma 1 é maior do que a isoforma p120ctn 3 por 101 resíduos de aminoácidos no terminal N [14] – [15]. Para responder as duas questões apresentadas acima, construímos dois mutantes de p120ctn isoforma 1 com sequências de péptido truncado no terminal N (M1, M2).

Nossos dados sugerem que, em primeiro lugar, a supressão da N-terminal de 56-101 (N-56-101) resíduos de aminoácidos na isoforma p120ctn 3 poderia explicar a falta de efeito regulador sobre β-catenina, enquanto isoforma p120ctn 1, que tem um domínio N-terminal intacta, mostrou uma positiva efeito regulador (Figura 6); Em segundo lugar, a existência de N-1-55 resíduos de aminoácidos, que formam um domínio de serpentina enrolada, na isoforma p120ctn 1 pode dominantemente impedi-lo de se ligar a Kaiso (Figura S9), embora os resíduos N-56-101 aminoácidos podem desempenhar um papel menor na sua interação.

no presente estudo, demonstramos um aumento da forma ativa da β-catenina sem alterações no nível de transcrição nas células com superexpressão de p120ctn isoforma 1A. O resultado é consistente com o que foi anteriormente descrito na literatura. Tem sido relatado que, em condições in vivo, p120ctn isoforma 1 directamente ou indirectamente interactua com algumas das proteínas chave conhecida para regular a estabilidade β-catenina, como Axin e GSK-3, em adição, que partilha com os mesmos mecanismos de regulação-catenina p da estabilidade metabólica [16]. Superexpressão de p120ctn isoforma 1 pode ocupar locais mais vinculativas sobre a destruição-complexos que contêm Axin e GSK-3β e, como resultado, causar uma degradação reduzida dos β-catenina, substituindo-o da destruição-complexos. Os locais de ligação de p120ctn com GSK-3β e CK1α está localizada no domínio N-terminal de p120ctn, e, assim, a proteína p120ctn isoforma 1, que tem o domínio N-terminal completo, seria submetido a regulação pelo destruição- complexo de [16]. Os resultados deste estudo sugerem que o domínio mais específico, precisamente os resíduos de aminoácidos N-56-101, pode estar envolvido na degradação da isoforma p120ctn 1. Além disso, uma p120ctn-M1, construído neste estudo é estruturalmente o mesmo que p120ctn isoforma 2 e também mostrou aumento da regulação do β-catenina (Figura 6), sugerindo que a isoforma p120ctn 2 pode também combinar com a GSK-3β e CK1α e ser regulada pela destruição do complexo.

o domínio em dupla espiral

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