Sumário

amplificação do genoma do 19q12 ocorre em vários tipos de cancro, incluindo o cancro do ovário, onde ele é associado com a falha do tratamento primário. Nós sistematicamente atenuou a expressão de genes dentro da região 19q12 minimamente definido em linhas celulares de ovário usando RNAs curtos interferente (siRNA) para identificar oncogene (s) condutor no interior do fragmento amplificado. Knockdown de

CCNE1

resultou em /paragem da fase S, a viabilidade celular reduzida G1 e apoptose apenas em células de transporte de amplificação. Embora

CCNE1

knockdown aumento da resistência a cisplatina em ensaios de curto prazo, a sobrevivência clonogênica foi inibida após o tratamento. Ganho de 20q11 foi altamente correlacionada com 19q12 amplificação e durou uma região de 2,5 Mb, incluindo

TPX2

, uma proteína centromérica necessário para a função do fuso mitótico. Expressão de

TPX2

foi altamente correlacionada com a amplificação do gene e com

expressão CCNE1

em tumores primários. inibição siRNA de

TPX2

viabilidade celular reduzida, mas este efeito não foi amplicon-dependente. Estes resultados demonstram que

CCNE1

é um fator-chave na 19q12 amplicon necessária para a sobrevivência e clonogenicidade em células com amplificação lócus. Co-amplificação de 19q12 e 20q11 implica a presença de uma rede cooperativa mutacional. Estas observações têm implicações para a aplicação de terapias específicas em

CCNE1

cancros do ovário dependentes

Citation:. Etemadmoghadam D, George J, Colin PA, Cullinane C, Kansara M, Australian Cancer Study Group ovário , et ai. (2010) Amplicon-Dependent

CCNE1

expressão é crítica para clonogênica sobrevida após Cisplatina Tratamento e está correlacionada com 20q11 Ganho de cancro do ovário. PLoS ONE 5 (11): e15498. doi: 10.1371 /journal.pone.0015498

editor: Nathalie Wong, da Universidade Chinesa de Hong Kong, China

Recebido: 31 de agosto de 2010; Aceito: 17 de outubro de 2010; Publicação: 12 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Etemadmoghadam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado por uma Health and Medical Conselho Nacional de Pesquisa (NHMRC) projeto de subsídio 628.779 (www.nhmrc.gov.au). O australiano Estudo do cancro do ovário é apoiado pelo Medical Research e Materiel Comando do Exército dos EUA sob DAMD17-01-1-0729, The Cancer Council Victoria, Cancer Fund Queensland, The Cancer Council de Nova Gales do Sul, o Conselho Câncer Austrália do Sul, a Fundação do Câncer da Austrália Ocidental, o cancro da Tasmânia Conselho e à NHMRC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

estágio avançado tumores serosos são responsáveis ​​pela maioria dos cancros do ovário invasivos e apesar de um geralmente boa resposta inicial à cirurgia cytoreductive e quimioterapia à base de platina, a maioria das mulheres enfrentam um alto risco de recorrência e sobrevivência a longo prazo pobre [1 ]. Os agentes à base de platina, tais como cisplatina e carboplatina, são tóxicos para as células em divisão, devido à formação de aductos de ADN que resultam em quebras de cadeia dupla, activando sinais apoptóticos ADN danos mediados por [2]. Resposta à quimioterapia é, no entanto, difíceis de prever e atualmente não há biomarcadores preditivos de câncer de ovário seroso em uso clínico. Temos anteriormente mapeados uma região de 19q12 amplificação associado com tumores de ovário seroso resistentes ao tratamento através da realização de uma pesquisa de todo o genoma da mudança do número de cópias [3]. Estes resultados foram consistentes com relatos anteriores de amplificação que está sendo associado à sobrevida global pobres [4], [5]. Da mesma forma, a amplificação de 19q12 recorrente tem sido relatada numa variedade de cancros incluindo esofágica [6], gástrico [7], do pulmão [8] e tumores do endométrio [9].

A amplificação de 19q12 é um alto-nível amplificação focal que tem como alvo um grupo de apenas alguns genes no cromossomo 19.

CCNE1

(ciclina E) já havia sido sugerida como alvo de amplificação no cancro do ovário [4], [10], [11], no entanto uma análise sistemática dos genes conhecidos dentro do amplicon não foi executada. Além disso, enquanto

CCNE1

amplificação provável fornece um estímulo de activação oncogénica através do ciclo celular, não é evidente como isso pode contribuir para a resistência à quimioterapia primária. Por exemplo, a sobre-expressão de

CCNE1 in vitro

torna as células de cancro do ovário mais sensível a agentes de platina, presumivelmente devido a um aumento da proliferação [12]. É possível que a consequência biológica da 19q12 amplificação não está limitado a sobre-expressão de

CCNE1

, e que outros genes no amplicão contribuir para o crescimento do tumor ou progressão. Além disso, outro co-existente eventos mutacionais em outras partes do genoma do câncer pode cooperar ou aumentar o efeito oncogênico de

CCNE1

sobre-expressão.

Foi realizada uma tela siRNA knockdown de todos os genes anotados dentro e imediatamente flanqueando o amplicão 19q12 em linhas celulares de cancro do ovário com ou sem amplificação regional. Encontrámos

CCNE1

ser o único gene alvo dentro do fragmento amplificado que reduziu a viabilidade celular na linha de células contendo o fragmento amplificado OVCAR-3 após siRNA knockdown.

CCNE1

knockdown induzida paragem do ciclo celular e apoptose, ao mesmo tempo, prejudicando a sobrevivência clonogênica após tratamento com cisplatina, apesar do aumento da

in vitro

resistência aos medicamentos em um ensaio de citotoxicidade de curto prazo. Numa configuração da doença, estes resultados sugerem que a falha do tratamento em

CCNE1

tumores amplificados podem dizer respeito à rápida repovoamento do tumor após a quimioterapia e resistência a drogas não especificamente celular. Encontramos também

TPX2

amplificação e sobre-expressão a ser significativamente correlacionada com

CCNE1

status de número de cópias que implica a presença de uma rede mutacional cooperativo entre esses genes.

Resultados

amplificação focal de 19q12 é comum a vários tipos de tumores

em primeiro lugar, procurou comparar a região mínima de ganho cromossômico em 19q12 em vários tipos de tumor. Obtivemos os dados de estudos no número de cópias de alta resolução baseados em SNP, incluindo 15 tipos de tumores [9], [13] Para uma comparação com os nossos resultados [3] (Figura 1A). regiões-alvo mínimas de amplificação foram definidos por GISTIC, uma ferramenta de análise que avalia a significância estatística de eventos no número de cópias com base na frequência e amplitude [14]. ampliação significativa de 19q12 estava presente em um terço dos tipos de câncer analisados. Dos tipos de tumores com amplificação de 19q12, aproximadamente 25% das amostras individuais apresentaram ganho de cópia número, excepto para os tumores do endométrio, onde foi observada uma frequência mais alta (-45%) [9]. amplicon limites mínimos foram encontrados como alvo uma região menos do que 2 MB, centrada a aproximadamente a 35,0 Mb no cromossoma 19. Em ambos os conjuntos de dados do tumor dos ovários analisados ​​[3], [13], a região mapeada mínimo de ganho incorporados os mesmos cinco genes (

POP4

,

PLEKHF1

,

C19orf12, CCNE1 e C19orf2

), com as regiões sobrepostas semelhantes detectados em tumores do endométrio e de mama. Em contraste, a região mínima mapeada em tumores de pulmão não pequenas células incorporados somente

CCNE1

enquanto uma ampla região foi mapeada em tumores de esôfago (~9.5 Mb), abrangendo 110 genes anotados. número de cópias mudança do 19q12 lócus mostrou um grau de especificidade do tumor, em que a amplificação não foi visto em 10 outros tipos de tumores para os quais os dados substancial estava disponível, incluindo células pequenas do pulmão, hepatocelular, colo-rectal e o cancro da próstata (dados não mostrados). Observamos também que a amplificação de 19q12 foi identificado por análise de cDNA array CGH de tumores gástricos [15], [16], no entanto, este tipo de tumor não foi incluído como nossa análise limitou-se a dados do número de cópia SNP de alta resolução.

regiões de pico (a) da amplificação entre 30-46 Mb no cromossomo 19 em

1non-pequenas células [8], [13], [40], [41], [42];

2ovarian [3],

3 [13];

4endometrial [9];

5breast [13], [43], [44]; e

tumores 6esophageal [42]. Frequência de ocorrência e genes presentes dentro dos limites máximos indicados. (B) 6.0 Affymetrix SNP mapeamento do número de cópias de microarranjos do cromossoma 19 em linhas celulares de tumor ovariano e (C) entre 34-36 Mb de OVCAR-3 e linhas de células SK-OV-3. Copiar número mostrado é a média janela móvel de 20 marcadores mapeados para março Humano 2006 (hg18) montagem do genoma (fonte: Sanger Cancer Genome Projeto Arquivo). (D) A expressão genética determinada por qPCR em células OVCAR-3 em relação ao SK-OV-3.

Para identificar linhas celulares que eram representativas de tumores primários para estudos funcionais analisados ​​cópia SNP de alta resolução dados de números de 22 linhas de células de câncer de ovário em cromossomo 19q12 (Sanger cancer Genome Projeto Arquivo) e identificou sete linhas celulares (OVCAR-3, OVCAR-4, Kuramochi, RMG-I, Caov-4, EFO-21, OVCAR-8) que tinha amplificação sobreposição em 19q12 (Figura 1B e Figura S1). Dos sete linhas celulares, OVCAR-3 continha uma amplificação focal, de alto nível, que melhor se dados a partir de tumores primários do ovário (Figura 1C) recapitulado. Quantitativa-PCR (qPCR) demonstrou que os cinco genes dentro da região de amplificação de alto nível em OVCAR-3 (

POP4

,

PLEKHF1

,

C19orf12

,

CCNE1 e C19orf2

), mas não flanqueando genes (

UQCRFS1

e

ZNF536

), foram sobre-expressos em relação à linha celular de controlo SK-OV-3 falta 19q12 amplificação ( Figura 1D). Dos cinco genes,

PLEKHF1

e

CCNE1

apresentou a maior expressão. A 19q12 fragmento amplificado pode, portanto, ser mapeado para uma região que abrange 34,4-35,4 do cromossoma 19 e que envolve 5 genes anotados, cada um dos quais é sobre-expresso em OVCAR-3.

linhas celulares com amplificação em 19q12 são sensíveis especificamente

CCNE1

knockdown

Curto ARN interferente (siRNA) foram usadas para knockdown da expressão dos sete genes no e adjacente ao fragmento amplificado de alto nível em 19q12 OVCAR-3 e SK-OV- 3 mais

controles não silenciamento (NS) GAPDH Comprar e. Um esquema do modelo experimental utilizado para a estratégia de knockdown siRNA combinadas e subsequente protocolo de tratamento de droga é mostrado na Figura 2A. níveis de transcrição de todos os genes alvo foram eficientemente e especificamente reduzidos até 96 horas após a transfecção siRNA, com a excepção de

ZNF536

, que flanqueavam a região de amplificação (Figura 2B). Por interrogar os dados obtidos de um estudo anterior [17] encontramos

ZNF536

expressão a ser baixa ou ausente em tumores de ovário serosas primárias, o que pode explicar uma redução observável na expressão de genes (dados não mostrados). A expressão de genes, também foi monitorizada na presença de cisplatina, em preparação para experiências funcionais.

PLEKHF1

,

CCNE1

,

C19orf2

e

ZNF536

foram ligeiramente up-regulada por tratamento com cisplatina em linhas de um ou ambos os celulares no entanto siRNA knockdown ainda estava eficaz (Figura 2B).

(a) esquema Experimental para a transfecção e tratamento de siARN combinado de drogas. (B) qPCR heatmap mostrando log

rácio expressão dois genes para não transfectada OVCAR-3 (em cima) e células SK-OV-3 (em baixo) para cada ARNsi (colunas) em genes alvos (filas) com ou sem tratamento com cisplatina 72 horas após a transfecção. viabilidade (C) celular normalizado para células de controlo não siARN após a transfecção com cada ARNsi. A significância estatística (teste-t) calculada em comparação com não-silenciamento (NS) siRNA na mesma linha celular utilizando os dados de três ensaios independentes realizados MTS com poços em triplicado por condição. absorvância média normalizada a 490 nm e representada graficamente SEM (n = 3), ** p-valor 0,01. (D) Proporção de células em apoptose avaliada por coloração TUNEL em nenhuma célula de controle siRNA ou após transfecção com NS ou

CCNE1

alvo siRNA. Os dados apresentados a partir de três experimentos independentes com poços duplicados analisados ​​por condição. percentagem de células apoptóticas e SEM representada graficamente (n = 3). *** Valor p 0,0001 (Chi quadrado) calculado pela comparação das contagens de células totais entre OVCAR-3 células tratadas com um

CCNE1

siRNA e todas as outras condições. a expressão da proteína (E) CCNE1 por western blot para confirmar

CCNE1

knockdown mediado por siRNA no ponto final experimental. (F) A viabilidade celular em linhas celulares adicionais após transfecção com

CCNE1

ou não silenciar siRNAs normalizado para cada linha de células sem siRNA acrescentou. A significância estatística (teste-t) calculada por comparação com NS siRNA na mesma linha celular. absorvância média normalizada de ensaio MTS e SEM representada graficamente (n = 3); * Valor de p 0,05, ** Valor de p . 0,01

Dos genes testadas, apenas

CCNE1

knockdown mostrou uma redução significativa na viabilidade celular em OVCAR- 3 (para aproximadamente 60% das células de controlo NS; p 0,01; Figura 2C).

CCNE1

knockdown não teve nenhum efeito sobre as células SK-OV-3. Dado o seu papel na transição G1 /S, espera-se que a depleção de proteínas ciclina E1 iria induzir a paragem em G1 (ver abaixo) e resultar em um aumento de células apoptóticas. TUNEL coloração de células não tratadas foi comparável (SK-OV-3, 0,1%; OVCAR-3, 0,2%) (Figura 2D), enquanto

CCNE1

knockdown resultou num aumento significativo na apoptose apenas em OVCAR-3 (p 0,0001). Redução na abundância de proteína também foi validado em ambas as linhas celulares após silenciamento de genes (Figura 2E).

Tendo identificado sensibilidade específica de OVCAR-3 a

CCNE1

knockdown, que teve por objetivo validar essa descoberta em linhas de células independentes e determinar se o efeito observado foi dependente amplicon. Por isso, ampliou a análise para incluir um três linhas celulares adicionais de amplificação em 19q12 (OVCAR-4, Kuramochi e OVCAR-8) e de uma linha adicional sem amplificação (IGROV-1). A correlação estatisticamente significativa entre o número de cópias e expressão gênica de

CCNE1

foi encontrado em todas as linhas. No entanto, OVCAR-8 não mostram aumento da

CCNE1

expressão relativa a amplificação do gene (Figura S2 A).

CCNE1

expressão e os níveis de proteína ciclina E1 foram eficientemente reduzida, em cada linha em relação a base de referência para a expressão por knockdown siRNA-mediada (S2 Figura B e C). Como observado em OVCAR-3,

CCNE1

knockdown especificamente reduzida viabilidade nas linhas adicionais com 19q12 amplificação, e só marginalmente na linha unamplified IGROV-1 (Figura 2F). Assim, as células do tumor dos ovários com a amplificação em 19q12 são especificamente sensíveis à depleção de ciclina E1, em comparação com linhas sem amplificação.

CCNE1

knockdown reduz a sensibilidade aguda à cisplatina

Dada a associação de 19q12 amplificação com falha primária de tratamento [3] e mau prognóstico [4] [5], que procurou explorar o efeito de silenciamento de genes na sensibilidade à droga. Apesar de nossa análise identificou uma dependência específica sobre

CCNE1

em linhas amplificadas, primeiro reavaliados todos os sete genes associados ao amplicon para o impacto sobre a resposta quimioterapia em OVCAR-3 e SK-OV-3 usando um 72- ensaio de citotoxicidade horas. As células foram tratadas a um nível ligeiramente acima de um valor CI50 pré-determinado (ver Métodos S1) e a viabilidade medida. Knockdown de genes dentro do amplicon não impactou significativamente na sensibilidade cisplatina de qualquer linha celular. Inesperadamente, a citotoxicidade induzida por cisplatina em OVCAR-3 células tratadas foi atenuada por

CCNE1

inibição (Figura 3A). Foi realizada uma análise dose-resposta para caracterizar melhor o efeito do tratamento com cisplatina depois

CCNE1

knockdown. Um desvio estatisticamente significativo na curva de dose-resposta foi observada em OVCAR-3 (p 0,05; Figura 3B), mas não SK-OV-3 demonstrando ainda mais a resistência de OVCAR-3 para a cisplatina sobre

CCNE1

inibição. Consistente com esta constatação, a cisplatina tinha qualquer efeito diferencial na viabilidade das células em

CCNE1

knockdown células, em comparação com controlos de ARNip em duas das três linhas adicionais 19q12 amplificados (Kuramochi e OVCAR-4) (Figura 3C). Em contraste, silenciamento de genes aumentou o efeito da cisplatina na viabilidade celular em ambas as linhas de células com baixo da linha de base

CCNE1

expressão (OVCAR-8 e da linha de controlo não amplificado 19q12 IGROV-1).

( a) viabilidade celular após a transfecção com siRNAs individuais e tratamento com cisplatina normalizados para células de controlo tratadas com cisplatina sem siARN. dose de cisplatina de 3 uM ou 6 uM foi usada para OVCAR-3 e células SK-OV-3, respectivamente. absorvância média normalizada (490 nm) a partir de três ensaios independentes MTS (poços em triplicado por condição) e SEM representada graficamente (n = 3). resposta à dose (B) A cisplatina após transfecção com

CCNE1

ou não-silenciamento de ARNsi de OVCAR-3 e SK-OV-3 linhas de células. A seta indica a dose de tratamento droga usada na tela inicial; p-valor indica significado da diferença entre as curvas de embutidos. Médio normalizado de ensaio MTS absorvância a células sem tratamento com cisplatina, e SEM de quatro parâmetros equipado Colina inclinação representados graficamente (n = 3 para cada concentração de fármaco). (D) A viabilidade das células após a transfecção com

CCNE1

ou NS siRNAs e tratamento com cisplatina normalizados para células de controlo não tratadas com cisplatina siRNA para cada linha celular. A significância estatística calculada por comparação com o NS de siRNA, as células tratadas com cisplatina na mesma linha celular. absorvância média normalizada de ensaio MTS e SEM representada graficamente (n = 3). Veja a Tabela S4 para doses tratamento com cisplatina.

Para investigar o fenótipo de resistência a cisplatina observada em OVCAR-3 células com

CCNE1

knockdown, utilizamos citometria de fluxo para analisar a distribuição do ciclo celular após cisplatina tratamento. o tratamento com cisplatina de OVCAR-3 resultou numa fase S prolongado (Figura 4A) enquanto que as células SK-OV-3 presos predominantemente na fase G2 do ciclo celular (Figura 4B). Consistente com a exigência de ciclina E1 na transição G1 /S [18],

CCNE1

induzida siRNA knockdown paragem em G1 em OVCAR-3, mais evidente na presença de cisplatina (Figura 4A). Por outro lado, a distribuição do ciclo celular de SK-OV-3 foi inalterada pela inibição de

expressão CCNE1

com ou sem cisplatina (Figura 4B). Estas observações foram consistentes em

CCNE1

amplificado Kuramochi e OVCAR-4 células (Figura S3). prisão G1 parcial também foi observada em 19q12 células não amplificados IGROV-1 após o

CCNE1

knockdown, porém apenas em resposta ao tratamento com cisplatina. Como observado no ensaio de viabilidade, o

CCNE1

amplificado mas as células de baixa expressar OVCAR-8 se comportou de forma semelhante para controlar linhas. Concluímos, portanto, que a dependência de OVCAR-3, Kuramochi, e OVCAR-4 em alta

CCNE1

expressão resultou numa paragem do ciclo celular após o silenciamento de genes, incluindo na presença de cisplatina, provavelmente representando a aparente resistência à cisplatina observado em ensaios de viabilidade a curto prazo.

(a) OVCAR-3 células e (B), SK-OV-3 perfil de ciclo celular (esquerda) e da proporção de células em G1, S ou fase G2 ( direita) para células coradas PI analisadas por citometria de fluxo de 72 horas após a transfecção com

CCNE1

ou NS siARN com ou sem tratamento com cisplatina (3 uM ou 6 uM para OVCAR-3 e SK-OV-3 de células, respectivamente).

Para compreender o impacto de longo prazo de

CCNE1

esgotamento sobre a sobrevivência celular após tratamento com cisplatina nós ensaiada do clonogenicidade de linhas com e sem amplificação do 19q12 loco (ver esquema Figura 5A ).

CCNE1

knockdown reduziu profundamente a capacidade clonogénico de OVCAR-3, mas não SK-OV-3 na ausência da droga (Figura 5B e 5C). Em contraste com o aumento da resistência à cisplatina em ensaios de citotoxicidade a curto prazo,

CCNE1

atenuação reduziu a sobrevivência clonogénica de células OVCAR-3 após o tratamento com cisplatina (Figura 5B). Nós não explorar o

in vivo

efeitos da

CCNE1

knockdown em linhas de tumor de ovário com 19q12 amplificação, como não fomos capazes de gerar linhas viáveis ​​com integração lentivírus estável de RNA curto hairpin (shRNA) dirigida a

CCNE1

(dados não mostrados).

(a) Experimental tempo-curso para o ensaio de sobrevivência clonogénica após a transfecção siRNA e tratamento com cisplatina. violeta de cristal representativas coradas (B) SK-OV-3, e (C) OVCAR-3 colónias (topo) e proporção média de colónias discretas formadas (parte inferior) em comparação com células de controlo sem siARN ou tratamento com cisplatina uma hora (3? M ou 6 uM para OVCAR-3 e SK-OV-3 de células, respectivamente). As barras de erro indicam SEM (n = 3), ** Valor de p . 0.001

CCNE1

amplificação é preditivo de mau prognóstico em tumores primários

CCNE1

número de cópias foi medida em 43 tumores ovarianos primários de pacientes com estágio avançado, a doença invasiva serosa. Além disso, foram incluídos dados de 52 tumores da nossa análise genômica anterior de platina resistência no cancro do ovário [3] e obteve correspondentes dados de expressão gênica para todas as amostras [17]. Todos os pacientes foram submetidos a cirurgia primária seguida por quimioterapia à base de platina. As informações clínicas usado para correlacionar

CCNE1

status com a sobrevivência tinha mais de dois anos de paciente acumulada dados adicionais de acompanhamento (em junho de 2010) a partir de nossos estudos anteriores.

Os pacientes foram estratificados com base em

CCNE1

status de número de cópias conforme avaliado por qPCR (ver Materiais e Métodos). Nenhuma diferença foi observada entre as características clínicas de cada grupo para além da idade, com pacientes mais jovens sobre-representados no

CCNE1

grupo sem amplificação (Tabela 1 e Figura 6A).

CCNE1

expressão gênica mostrou uma forte correlação com o número de cópias (Figura 6B) e ambos foram correlacionados com a sobrevivência livre de progressão (PFS) (Figura 6C D).

CCNE1

número de cópias, mas não a expressão do gene, também foi associado com global-sobrevivência (OS) (Figura 6E F). A correlação mais significativa observada foi de grau de

CCNE1

ganho e PFS (Figura 6C), de tal forma que todos os casos com amplificação de alto nível mostrou doença progressiva no prazo de aproximadamente 12 meses desde o diagnóstico (média PFS de 10,7 meses; Tabela 1 ).

(A) distribuição etária do paciente estratificada por

CCNE1

estado de amplificação. Kruskal-Wallis p-valor relatado, barras indicam a média e SEM. (B) Correlação entre o

CCNE1

número de cópias pelo sinal qPCR e expressão gênica por microarray. (C) Análise de Kaplan-Meier de

CCNE1

unamplified (n = 68), ganhou (n = 21) e amplificado (n = 6) pacientes com câncer de ovário e (D)

CCNE1

baixo (n = 31), média (n = 28) e alta (n = 36) para as amostras que expressam sobrevivência livre de progressão e (e F) a sobrevivência global. p-valores de teste de log rank relatado. Estratificação por

CCNE1

copiar número ou expressão de status descrito em Materiais e Métodos.

A amplificação de 19q12 está correlacionada com o ganho na 20q11

Tendo identificado

CCNE1

como um factor crítico na 19q12 amplicon no câncer de ovário, que argumentou que outras mutações em outras partes do genoma pode interagir com ciclina E1 ou estar associada a resistência aos medicamentos. Por exemplo, as mutações que melhoram o efeito de tumores ou permitem tolerar

CCNE1

sobre-expressão podem co-ocorrer com 19q12 ganho. Obtivemos tanto no número de cópias e expressão gênica de dados baseados em SNP em 157 tumores invasivos seroso de alto grau de O Projeto Genoma Atlas Câncer (TCGA) para análise. Em primeiro lugar, examinamos a expressão génica de genes cujos produtos de proteína são necessárias para o processamento de ciclina E1 a formas activas de baixo peso molecular (peso

ELA2

e

CAPN2

) [19], [20] ou o seu degradação (

FBXW7

) [18]. No entanto, nenhuma correlação positiva estatisticamente significativa entre a expressão do gene candidato e

foi observada CCNE1

de estado (dados não mostrados). Nós então correlacionados 19q12 ganho com todos os outros ganhos e perdas de 0,1 segmentos Mb do genoma (ver Métodos S1). As três principais regiões correlacionadas da mudança do número de cópias estavam em 20q11, 1p36 e 6q27 (Figura 7A). O ganho associado mais significativa foi localizada uma região 2.5Mb no cromossoma 20 (Figura 7B) e foi validado em uma análise isenta de correlações separado do genoma de ganho e a perda de tumores ovarianos [21]

.

(a) enredo Circos mostrando regiões de cópia alteração de número significativamente correlacionados com

CCNE1

amplificação (p 1 × 10

-5) (B) Importância da correlação do número de cópias para

CCNE1

amplificação através cromossomo 20. limiar de significância utilizado para definir limites máximos de correlação indicados pela linha pontilhada. (C)

TPX2

correlação de expressão com número de cópias local e

CCNE1

expressão (fonte: TCGA). (D) Correlação de

CCNE1

e

TPX2

expressão de genes em um conjunto de dados independente (Tothill et al., 2009).

A fim de estreitar gene candidatos dentro das três regiões com maior probabilidade de interagir com

CCNE1

, nós próxima correlacionada a expressão de genes no interior de cada região com

CCNE1

expressão (Tabela 2). Expressão de

TPX2

foi mais significativamente associada a

CCNE1

expressão, e também foi correlacionada com o seu próprio estado de amplificação (Figura 7C). A relação entre o

CCNE1

e

TPX2

expressão do gene foi ainda validado em um segundo conjunto de dados independente (Figura 7D). A forte associação entre

TPX2

e

CCNE1

amplificação e expressão foi intrigante dado que TPX2 é uma proteína centromérica necessário para a função do fuso mitótico durante a divisão celular [22].

20q11 amplificação torna as células resistentes a TPX2 knockdown

para testar se havia uma dependência funcional em

TPX2

em linhas de células com amplificação do 20q11 lugar e se interage com

CCNE1

, avaliou

TPX2

estado linhas utilizadas para os nossos experimentos knockdown.

TPX2

foi amplificado (Figura 8A) e sobre-expresso (Figura 8B) em todos os três

CCNE1

amplificado e sobre-expressando linhas celulares (OVCAR-3, OVCAR-4 e Kuramochi) comparado para a linha de controle, SK-OV-3. Além disso, foram identificados mais OAW-28 como tendo alto nível 20q11 amplificação (Figura 8A, os dados do Sanger Cancer Genome Projeto Archive) eo mais alto nível de expressão do gene através das linhas de células testadas (Figura 8B).

(a) Affymetrix SNP 6,0 mapeamento do número de cópias microarray do cromossomo 20 em linhas celulares de tumores ovarianos indicação da localização de

TPX2

. (B) Correlação entre o

TPX2

número de cópias e expressão gênica por qPCR em linhas celulares. viabilidade (C) celular descrito como absorvância normalizada MTS (490 nm) a partir de três ensaios independentes para células tratadas sem siARN em siRNA experiências dupla knockdown. absorvância média normalizada de ensaio MTS e SEM representada graficamente (n = 3). a expressão da proteína TPX2 (E) por western blot para confirmar knockdown mediado por siRNA no ponto final experimental para linhas celulares e CCNE1 em células OAW-28.

Em contraste com a estreita relação entre

CCNE1

amplificação e sensibilidade celular à silenciamento de genes, foi observada uma relação inversa entre

TPX2

número de cópias e os efeitos do

TPX2

siRNA (Figura 8C). Por exemplo, SK-OV-3 células com a expressão do gene baixa (Figura 8B) e mínima de proteína TPX2 detectável (Figura 8D), eram altamente sensíveis ao silenciamento de genes, enquanto que as células OAW-28 eram essencialmente resistentes. RT-PCR (Figura S4) e Western blot (Figura 8D) análises demonstraram knockdown eficiente de

TPX2

, no entanto proteína foi ainda detectado em algumas linhas celulares que inicialmente tinham altos níveis de proteína TPX2. Observamos também que knockdown de

CCNE1

resultou em

TPX2

expressão diminuída gene em 19q12 linhas amplificados (Figura S4 A) sugestiva de que

TPX2

expressão é afetada a jusante da ciclina E1 .

Dada a correlação entre a

CCNE1

e

TPX2

amplificação, nós também examinou se knockdown simultânea de ambos os genes iria diminuir ainda mais a viabilidade em linhas de células que contêm ambas as amplificações (Figura 8C ). Depois que permitiu um efeito competitivo de combinar siRNAs (ver Métodos) não se observou interacção óbvio com knockdown simultânea de

TPX2

e

CCNE1

. Knockdown de

CCNE1

teve efeito mínimo sobre a viabilidade celular OAW-28, apesar da redução de proteína eficiente em experimentos knockdown duplos (Figura 8D). Este resultado é consistente com nossos resultados iniciais, como células OAW-28 não tem 19q12 amplificação (veja a Figura S1 para OAW-28 número de cópias neste locus).

Discussão

Realizamos a primeiro knockdown siRNA sistemática de todos os genes dentro do 19q12 amplicon minimamente definido em mostrar o cancro do ovário que

CCNE1

é o alvo oncogênico chave. Dado funções conhecidas da ciclina E1 no cancro, incluindo a desregulação do ciclo celular e promovem a instabilidade genómica, foi o provável condutor do locus de 19q12, no entanto outros genes não tinha sido excluído. Por exemplo,

C19orf2

, que é imediatamente adjacente ao

CCNE1

, foi recentemente anotado para codificar URI, uma proteína prefoldin não convencional. Estudos do

C. elegans

URI homólogo sugerem um envolvimento na remodelação da cromatina, prevenção e /ou reparação de danos no DNA genotóxico endógeno e manutenção da integridade do genoma [23]. Mais recentemente, URI tem sido identificada como um inibidor chave da proteína fosfatase 1γ (PP1γ) e ​​está envolvido na regulação da via de sobrevivência de mTOR /S6K1 com base na disponibilidade de nutrientes e de factor de crescimento [24]. Apesar destas associações biológicas intrigantes, não encontramos nenhuma evidência de URI como um motorista do 19q12 lócus.

Redução da viabilidade celular após o

CCNE1

knockdown era específico para linhas celulares com 19q12 amplificação, com limitada ou nenhum efeito em linhas não-amplificados, indicando um “vício” [25] para

CCNE1

desregulamentação. Nossas descobertas confirmam um relatório recente mostrando sensibilidade específica-amplificação para

CCNE1

atenuação em OVCAR-3 e células Iosé-29 [26]. linhas sem amplificação apareceu para ignorar /S prisão checkpoint siRNA G1 mediada e apoptose, possivelmente refletindo

CCNE1

mecanismos independentes de ciclo celular de-regulação e processos oncogênicos distintas. Curiosamente, a expressão aumentada de CCNE1 foi recentemente mostrado na carcinoma intraepitelial tubária serosa (STIC), um precursor proposto para o carcinoma seroso de alto grau [27]. Este achado reforça a importância do

CCNE1

de-regulação no cancro do ovário e sugere que é um requisito inicial da evolução do tumor.

19q12 amplificação é fortemente associada com a falha do tratamento primário em tumores ovarianos [3 ] e é, portanto, tanto um potencial marcador de prognóstico e alvo terapêutico. Tendo identificado

CCNE1

como o motorista de 19q12 amplificação buscamos compreender como ele contribui para o insucesso do tratamento primário. Em ensaios de citotoxicidade a curto prazo, a sobre-expressão de ciclina E1 aumenta a sensibilidade ao cisplatino [12].