Abstract

Actualmente na clínica, as pessoas usam hematoxilina e eosina (H E mancha) e de imunohistoquímica métodos para identificar a geração e gênero cancros para amostras patológicas humanas. Uma vez que estes métodos são imprecisos e demorado, o desenvolvimento de um método rápido e preciso para detectar o cancro é urgentemente exigido. Em nosso estudo, os péptidos de ligação para o cancro do pulmão linha de células A549 foram identificados por meio de bactérias de superfície método de exibição. Com esses peptídeos de ligação para células A549 na superfície, as bactérias fluorescentes (

Escherichia coli

com estavelmente expressa a proteína fluorescente verde) foram servidos como reagentes de detecção específicos para o diagnóstico de câncer. A actividade de ligação do complexo de péptido-bactérias fluorescente foi confirmada por células cancerosas isoladas, as células cancerosas em anexo e amostras de tumor de xenoenxerto de ratos. Um método de fixação único foi desenvolvido para o complexo de péptido-bactérias, a fim de tornar este complexo mais viável para a utilização clínica. Esta bactéria complexo de péptido-fluorescente tem um grande potencial para se tornar uma nova ferramenta de diagnóstico para a aplicação clínica

Citation:. Dong B, Wang A, Yuan L, Chen L, Pu K, Duan W, et al. (2013) Bactérias Peptide-fluorescentes complexo como luminescentes Reagentes para Diagnóstico do Câncer. PLoS ONE 8 (1): e54467. doi: 10.1371 /journal.pone.0054467

editor: Shi Yu Yang, da Universidade College London, Reino Unido

Recebido: 09 de outubro de 2012; Aceito: 11 de dezembro de 2012; Publicação: 18 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Dong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No.30870683 e 81.171.451). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Com o desenvolvimento de novas técnicas para diagnóstico e tratamento de cânceres, a taxa de mortalidade de pacientes com câncer tem diminuído nas últimas décadas. No entanto, o objetivo de curar cancros ainda está longe de alcançar. Atualmente, os pontos-chave para aumentar a taxa de cura e qualidade de vida de pacientes com câncer são mais cedo e diagnóstico preciso e tratamento eficaz para essas doenças malignas. A aplicação de reagentes luminescentes sensíveis e moléculas alvo para as células cancerosas fornece ferramentas úteis para diagnóstico preciso e tratamento eficaz para o câncer. materiais luminescentes inéditas, como pontos quânticos [1], os nanomateriais conversão ascendente [2] e nanobubbles [3] têm sido tentadas a aplicar aos sistemas de imagem câncer. Várias moléculas, tais como anticorpos [4], péptidos [5], [6] e aptâmeros [7] têm sido utilizados como moléculas de direccionamento para o diagnóstico e terapia do cancro. Embora haja algum progresso para o desenvolvimento de materiais luminescentes e moléculas segmentação, sistemas eficazes de diagnóstico e terapia do câncer não foram totalmente estabelecidas. métodos de diagnóstico mais precisos, combinando moléculas alvo com moléculas de imagem robustos mais cedo e atrair o interesse cada vez mais os investigadores [8]. Nosso estudo pretende estabelecer um novo sistema que inclui peptídeos alvo e bactérias fluorescentes para o diagnóstico preciso de cânceres. peptídeos de direccionamento podem ser rastreados e identificados pelo método de bactérias superfície expositora desenvolvido nos anos 1990 [9], [10]. Usando o separador de células activadas por fluorescência (FACS), diversos péptidos com actividade de ligação específica foram obtidos de uma forma com elevado rendimento bactérias método de [11], [12] exibir. Actualmente, com este método, os péptidos alvo para células de cancro da mama [13] e péptidos substrato para a proteinase [14] foram identificados. No nosso estudo, com a identificação dos péptidos de ligação específicos para as células de cancro do pulmão A549, seria estabelecida uma nova técnica para a detecção de células de cancro de pulmão utilizando o sistema de bactérias péptido fluorescente. Além disso, o sistema de bactérias péptido-fluorescente pode ser usado como o reagente de diagnóstico na aplicação clínica de pacientes com cancro no futuro.

Materiais e Métodos

1. Cultura de Células e Materiais

linhas celulares de carcinoma do pulmão humano (células A549 e células H460), linha celular de adenocarcinoma da mama humano (HepG-2), linha celular de carcinoma (MCF-7), linha celular de carcinoma hepatocelular humano do colo do útero humano (HeLa) e linha celular de carcinoma da laringe humano (Hep-2) foram utilizados neste estudo. Estas linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Hyclone Corp., EUA) e as células de fibroblasto do pulmão humano (HLF) foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (Hyclone Corp., EUA) numa co 5%

2 incubadora humidificada a 37 ° C. O meio foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Hyclone Corp., EUA) e 1% de penicilina /estreptomicina (China National Medicina Corp., China). A549, células H460 e HLF estavam presentes amáveis ​​do Dr. Biliang Zhang [15], [16] (Guangzhou institutos de biomedicina e saúde, CAS, China). As células MCF-7, HepG-2, HeLa e Hep-2 foram presentes amáveis ​​do Dr. Haiyan Liu [17], [18] (O Cyrus Tang Hematologia Center, Universidade Soochow, China). Os outros agentes químicos neste estudo foram adquiridos a partir da Medicina China National Corporation.

2. Triagem de Encadernação monoclonais Bactérias Peptide-fluorescentes com células A549

A biblioteca de péptidos bacteriana do

E. coli

utilizada neste estudo foi um presente de Patrick S. Daugherty no Departamento de Engenharia Química, Universidade da Califórnia, Santa Barbara. Nesta biblioteca peptídica bacteriana, cada

E. coli

superfície apresentada péptido 13-mer (X2CX7CX2) fundir na segunda ansa extracelular da proteína de membrana exterior circularmente permutada OmpX (CPX) [13], em que expressa péptidos e proteína fluorescente verde (GFP), foram estimuladas pela adição de L – (+) – arabinose (0,02% w /v) de uma cultura de fase log [13], [19]

aliquotas congeladas de 1 × 10

9 bactérias foram descongeladas e cultivadas. durante a noite em caldo de super óptima (SOB) a 37 ° C e suplementado com 34 ug /ml de cloranfenicol (cm) e 0,2% (w /v) de D – (+) – glucose. No dia seguinte, as bactérias foram subcultivadas a 1:50 em caldo de Lisogenia (LB) suplementado com 34 ug /ml de CM, durante 2 h a 37 ° C e induzida por 0,02% (w /v) de L – (+) – arabinose para 1 h à temperatura ambiente para garantir a GFP e péptidos expressos em bactérias. Depois de células (48 horas pós-semeadura) A549 e HLF em cultura foram colhidas por tripsinização e ressuspenderam-se em tubos. 10

7 HLF células foram co-incubadas com 100 vezes o excesso de células bacterianas durante 45 min num agitador de inversão a 4 ° C. As suspensões de células foram centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C e o sobrenadante foi recolhido. Este procedimento pode ser repetido para outra vez devido ao aumento dos acontecimentos de ligação não específicos para células ocorreram HLF. O sobrenadante foi co-incubado com 10

7 células A549, durante 45 minutos num agitador de inversão a 4 ° C e suspensões de células foram centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C e depois lavou-se três vezes com PBS. O sedimento foi ressuspenso com PBS 5 ml fria e imediatamente analisadas por FACS (BD FACS Aria II, BD Corp. EUA). O portão de triagem no ensaio FACS foi definida com base nos sinais de fluorescência de amostras de controlo negativo. Uma vez que as configurações de fluorescência foi otimizado para o controle negativo, uma porta de ordenação adequado foi elaborado para ordenar a biblioteca com base em fluorescência. Um portão tipo foi elaborado para excluir o máximo de controle negativo quanto possível, enquanto ainda captar eventos positivos na biblioteca [13] .As células fluorescentes verdes foram fechado para a triagem porque se peptídeos que estavam na superfície de bactérias fluorescentes verdes poderia ligar com as células A549 e os sinais fluorescentes verdes de células aumentará. Pelo menos 10

5 eventos foram gravadas e as células tumorais com maiores sinais fluorescentes verdes e caiu na porta laranja foram coletadas com FACS. As células recolhidas foram cultivadas durante a noite em SOB contendo 0,2% de D – (+) – glucose e 34 ug /ml de CM. Bactérias de ligação com células cancerosas especificamente foram amplificadas para a próxima rodada de triagem. A partir da próxima rodada, 10

6 células foram suficientes para análise FACS e classificação. Até o sinal fluorescente de células tumorais parar de aumentar sequencialmente em duas rodadas, o procedimento de rastreio de péptidos de ligação foi terminada. bactérias seleccionadas com péptidos de ligação foram cultivadas na placa de meio LB contendo 1% de agar e 34 ug /ml de CM. Depois de cultivado durante 24 h a 37 ° C, as bactérias péptido fluorescente monoclonais foram repicadas e cultivadas em 5 ml de SOB contendo 0,2% (m /v) de D – (+) – glucose e 34 ug /ml cm a 37 ° C durante a noite. No dia seguinte, a actividade de ligação dos clones individuais foi examinado através da medição dos sinais fluorescentes GFP de células após as células A549 incubadas com as bactérias de péptido fluorescente monoclonais. As sequências de péptidos de ligação na superfície de bactérias peptídeo fluorescente monoclonais foram obtidos através do envio de essas bactérias para Sangon Biotech Co., Ltd. Xangai, China para a sequenciação.

3. Caracterização da Especificidade de ligação ea eficiência entre bactérias e células Peptide-fluorescentes

Os experimentos foram realizados em ambas as células unidas e isoladas. O experimento microscopia de fluorescência foi primeiramente realizado para examinar a especificidade de ligação de bactérias péptido fluorescente monoclonais com células ligadas. As células A549, células HLF, células H460, células MCF-7, células HEp-2, células HepG-2 e células HeLa (3 × 10

5) foram plaqueadas em placas de cultura celular de 12 poços um dia antes da experiência. Após a indução, a 100 ul de suspensão de bactérias (≈8 × 10

7) em 1 ml de PBS foram incubados com todos os tipos de células à temperatura ambiente, que foi provada para assegurar proteínas na superfície de células expressa normalmente durante a incubação [13] durante 45 minutos e foram lavadas três vezes por PBS. As células foram fotografadas com microscopia de fluorescência (Nikon Ti, Nikon Corp. Japão) para confirmar a actividade de ligação de bactérias péptido fluorescente monoclonais com células. A actividade de ligação entre as bactérias péptido fluorescente monoclonais com células isoladas foi examinado por citometria de fluxo. O procedimento da análise da actividade de ligação de bactérias péptido fluorescente é semelhante ao do rastreio dos péptidos de ligação com células.

4. Tentativa de bactérias Manutenção de ligação Atividade com vários métodos de fixação

A fixação foi feito com diferentes reagentes de fixação (etanol [20], o metanol [21], acetona, [22] e paraformaldeído a 4% [23]). Depois centrifugou-se a 5000 rpm durante 5 min, o sobrenadante foi removido e as bactérias foram fixados nos reagentes de fixação durante 20 minutos a temperatura ambiente. Os reagentes em excesso foram removidos de fixação e as bactérias foram suspensas fixos por PBS e armazenadas a 4 ° C.

citometria de fluxo e microscopia de fluorescência experimentos foram realizados como indicado anteriormente para examinar a actividade de ligação de bactérias com células fixas. Em comparação com as bactérias de péptido fluorescente monoclonais fresco, a proporção de bactérias fixadas às células variou de 100:1 500:1 para obter óbvia e detectados sinais fluorescentes nas células. Normalmente, depois as bactérias foram fixo, os sinais fluorescentes verdes de bactérias diminuiu em certa medida. Para examinar se a actividade de ligação de bactérias fixos com células foi dependia de tempo, microscopia de fluorescência e análises FACS foram realizados repetidamente no dia 1, dia 7 e no dia 30 após a fixação.

5. Exame da actividade de ligação do Sistema de bactérias Peptide fluorescente com tecido do tumor de ratos Xenoenxerto

experiência de ligação foi realizado em tecido embebido em parafina. ratos A549 amostras de xenotransplante tumoral em lâminas de parafina foram presentes amáveis ​​de Dr Laura Cerchia e Dr Vittorio De Franciscis (Istituto di Endocrinologia ed Oncologia Sperimentale, CNR, Nápoles, Itália). O documento relacionado com a preparação de amostras já foi publicado na revista PLoS One [24]. O procedimento dewaxing para as amostras de parafina foi feito seguindo o procedimento aceite [25]. 1 × 10

6 (em 100 uL) Fresco peptídicos-bactérias e 5 × 10

6 peptídicos-bactérias fixadas foram incubadas separadamente com secções de parafina de tumor durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS três vezes, secções de tumor foram observados sob uma Nikon A1R varredura a laser confocal do microscópio (Nikon Corp. Japão).

Resultados

1. Enriquecimento de ligação específica com Peptides Biblioteca de células A549

Para isolar ligantes de ligação específicos de células para um determinado fenótipo de células tumorais que decidiu criar um sistema modelo incluindo normal (não-tumor) linha de células (HLF) e A linha de células do carcinoma do pulmão (A549). células HLF trabalhou para counterselection no processo de triagem. Uma biblioteca de 13-mer com os péptidos de cisteína contido foi utilizado para a selecção de péptidos de ligação contra células intactas (Figura 1A). Em cada rodada da etapa A549 células selecção foram realizados um ou dois passos counterselection contra células HLF. Durante o processo de seleção, que aumentou progressivamente a pressão seletiva, alterando a condição de incubação, a condição de lavar roupa e área do portão em FACS. Durante rodada 6 e 7, a proporção de células fluorescentes verdes para células completas permaneceram inalteradas, sugerindo que a população tinha parado a evoluir sob a pressão de selecção. Com efeito, a piscina na 6 rodada foi enriquecida para péptidos apresentados na superfície de bactérias que se ligam preferencialmente a células A549 (Figura 1B). Sessenta clones individuais de bactérias a partir deste grupo foram escolhidos e cultivados para o próximo passo de análise.

(A) Representação esquemática de péptidos de rastreio e selecção com a biblioteca de exibição bacteriana. 1. Construído a biblioteca, transformando plasmídeos em

E.coli

MC1061; 2. rejeitado as bactérias de ligação com células normais após pré-incubação; 3. Incubou-se a mistura de células cancerosas e bactérias residuais; 4. analisou o efeito vinculante das células cancerosas com bactérias usando FACS; 5. Ordenado as bactérias ligação às células cancerosas por citometria de fluxo e cultivaram as bactérias de ligação em meio; 6. Realizada a próxima ligação de bactérias triagem round; 7. Isolado as bactérias ligação a células cancerosas e sequenciaram os péptidos apresentados na superfície das bactérias. (B) O progresso do enriquecimento de bactérias de ligação com células cancerosas por FACS em 6 rodadas de triagem.

2. Identificação de anticorpos monoclonais Bactérias Péptido-fluorescentes com elevada ligação Eficiência

As bactérias péptido fluorescente monoclonais com elevada eficiência de ligação foram identificados a partir de 60 clones para mais experiências. Antes de os clones foram enviados para a sequenciação, utilizou-se por FACS para comparar a eficiência de ligação das bactérias às células HLF e A549. Após incubação com bactérias péptido fluorescente monoclonais induzidos, a percentagem de células fluorescentes para as células inteiras representada a taxa de ligação dos péptidos na superfície de bactérias com células clonais. Os resultados indicaram que a taxa de ligação de todas as bactérias provenientes destes 60 clones foi de cerca de 10% -80% para as células A549, enquanto que era inferior a 5% para células HLF (dados não mostrados). Comparando com aqueles com taxa de ligação, bactérias 20% peptídeos fluorescentes com taxa de ligação de 80% pode ter maior afinidade para as células. A taxa de ligação das bactérias péptido fluorescente monoclonais (clone 4), com a mais elevada eficiência de ligação foi de 80% para as células A549 e 0,4% para as células HLF (figura 2). Os resultados de sequenciação mostrou que sete sequências de clones originais foram obtidos a partir de 60 clones (Tabela 1). Não houve sequência conservada observada por todos esses clones.

A fração de ligação de células A549 com bactérias (show na porta laranja) foi de 80% e que de células HLF foi de 0,4%.

3. Avaliação da especificidade de ligação das bactérias Monoclonal Peptide-fluorescentes

A identificação de um pequeno conjunto de bactérias peptídeo-fluorescente que pode distinguir as células A549 a partir das células HLF levanta uma questão de saber se estas bactérias peptídeo-fluorescente pode ligam-se bem com outros tipos de células. Para este objectivo foram determinados para examinar o potencial de ligação relativa de todas as bactérias peptídicos fluorescentes para várias linhas de células. Em primeiro lugar, determinou-se a especificidade tipo célula pela medição da actividade de ligação de todas as bactérias péptido fluorescente sobre um painel de linhas de células independentes. Encontrámos que qualquer um dos sete bactérias péptido fluorescente não se ligam a outros tipos de células de carcinoma humanas, incluindo fígado (HepG-2), da laringe (Hep-2), do colo do útero (HeLa) e da mama (MCF-7), as células de carcinoma. Os resultados da observação de microscópio de fluorescência e citometria de fluxo em células fixadas e em separado verificou-se a especificidade de ligação das bactérias péptido fluorescente. Figura 3 mostram os resultados típicos das bactérias péptido fluorescente que tinha a mais elevada eficiência de ligação a células A549 (clone 4). Além disso, as bactérias com apenas a proteína andaime CPX não pôde ligar com células A549, o que significava que apresentam péptidos na superfície das bactérias mediada por o evento de ligação entre as bactérias e as células A549. Mais atenção deve ser dada a outras células de carcinoma de pulmão, por exemplo, H460. Nossos resultados ilustraram que as bactérias peptídeo fluorescente monoclonais não poderia reconhecer H460 células -outro linha celular também pertencentes à categoria de cancro do pulmão de não-pequenas células, o que implicava que as bactérias peptídeo fluorescente monoclonais têm a possibilidade de reconhecer diferentes gêneros de células de câncer de pulmão.

(A) imagens de microscopia de fluorescência de bactérias clones incubadas com células. A549

△ foi incubada com CPX apenas bactérias e outras células foram incubadas com as bactérias de péptido fluorescente monoclonais seleccionados, a barra de escala foi de 20 uM. Resultados (B) FACS de células de ligação com várias bactérias péptido fluorescente monoclonais em relação 1:100. (C) Percentagem de fracção de bactérias péptido fluorescente monoclonais que se ligam com várias células de dados de FACS. Os dados eram média ± S.D. de pelo menos três experiências independentes.

4. Manutenção de Encadernação capacidade das bactérias Peptide-fluorescentes com células tumorais para aplicação clínica

era necessário um método de fixação para manter a especificidade de ligação e eficiência de bactérias às células para aplicações mais amplas. Através de comparação do efeito de ligação de bactérias com as células após as bactérias foram fixados por etanol, metanol, acetona e 4% de paraformaldeído, nós escolhemos paraformaldeído como o reagente de fixação para um estudo mais aprofundado. Embora as bactérias fixos ainda mantida a capacidade de se ligar a células, a eficiência de ligação de bactérias fixas era menor do que a das bactérias frescos. Para a obtenção de um efeito vinculativo comparável para as bactérias fixos, que aumentou a proporção de bactérias para as células de 100:1 para 500:1. Os resultados mostrados na Figura 4A e S1 indicou que as bactérias fixos ainda mantida a especificidade de ligação. Além disso, após comparação com as células de controlo negativo, a linha celular de não tumor, (HLF) com algumas linhas celulares tumorais (H460 e Hep-2), a especificidade de ligação de bactérias fixadas era melhor do que a das bactérias frescos. Subsequentemente, foi examinada a mudança na eficiência de ligação de bactérias fixos na sequência do lapso de tempo. Neste experimento, os objetivos que escolhemos foram as bactérias frescas, bactérias recém-fixas (dia 1) e bactérias fixas armazenadas por 7 dias e 30 dias. Os resultados (Figura 4B, 4C e 4D) mostrou que as bactérias fixos ainda mantida uma eficiência de ligação mais elevada com as células, mesmo depois de ter sido armazenada durante 30 dias, o que indica que as bactérias fluorescentes fixos poderiam ser utilizados para detectar células A549, mesmo depois de ser armazenado durante bastante um longo tempo.

(a) Percentagem de fração de fresco e bactérias peptídeo fluorescente monoclonais fixos de ligação com várias células a partir de dados de FACS. Células de ligação às bactérias frescas (preto) em relação 1:100 e ligação às bactérias fixas (cinza) em relação 1:500. (B) As imagens de microscopia de fluorescência de células A549 incubação com bactérias frescas e bactérias fixas em relação 1:500, no dia 1, dia 7 e no dia 30 após a fixação e a barra de escala foi de 20 mm. (C) Resultados FACS de células A549 de ligação com bactérias péptido fluorescente monoclonais frescos e fixado em relação 1:500 em diferentes pontos de tempo. (D) Percentagem de fracção de bactérias péptido fluorescente monoclonais frescos e fixos de ligação com células A549 a partir de células de dados de ligação FACS com bactérias frescas e bactérias fixos em relação 1:500 em diferentes pontos de tempo. Os dados eram média ± S.D. de pelo menos três experiências independentes.

5. Detecção de Tumores A549 a partir dos ratinhos com xenoenxerto Bactérias Péptido-fluorescentes

Depois de tecido tumoral incubadas no xenoenxerto A549 ratinhos com bactérias péptido fluorescente monoclonais induzidos (clone 4 e CPX apenas), a secção do tumor no xenoenxerto emitida fluorescência verde por causa péptidos na superfície de bactérias fluorescentes pode reconhecer as células tumorais. No entanto, a secção de tecido adjacente ao tumor parte incubadas com o clone 4 de péptido-bactérias e a secção do tumor incubadas com CPX somente as bactérias não emitem sinais de fluorescência (Figura 5). Estes resultados poderiam ser reproduzido com bactérias fixas de péptido fluorescente (dados não mostrados).

A barra de escala foi de 20 uM. Os dados foram representativos de pelo menos três experiências independentes.

Discussão

Em nosso estudo, os péptidos de ligação específicos para células de câncer de pulmão foram identificados com bactérias método de exibição de superfície. Não houve sequências conservadas para os péptidos que indicou que esses péptidos pode interagir com diferentes proteínas na superfície de células tumorais. Embora esses peptídeos pode ser usado como moléculas alvo para diagnóstico e tratamento de cânceres, neste estudo, procurou-se explorar o potencial de fluorescência

E. coli MC1061

, que tinha péptidos específicos na superfície, trabalhou directamente como reagentes de diagnóstico. Os resultados do

In vitro

experiência indicou que as bactérias seleccionadas com os péptidos sobre a superfície pode ligar-se especificamente com células A549 com elevada afinidade, independentemente se as células foram montado ou desmontado. A capacidade das bactérias péptido fluorescente para reconhecer certas células de tumor foi confirmada por experiências de xenoenxerto de murganhos de tumor. Com os resultados do

In vitro

experiências, um novo método foi desenvolvido pela primeira vez para detectar células cancerosas de pulmão directamente com bactérias fluorescentes. Considerando o tempo de prateleira e segurança de bactérias, manipulação de bactérias vivas era necessário para a sua posterior aplicação. Através de comparação do efeito de diferentes reagentes de fixação (etanol, metanol, acetona e 4% de paraformaldeído), paraformaldeído a 4% foi seleccionado como o melhor reagente de fixação. As bactérias fixadas com este reagente pode manter uma eficiência de ligação elevada e especificidade para as células durante pelo menos um mês.

Na prática clínica e banco de trabalho, a maior parte do tempo, a tecnologia de imagem foi usada para o diagnóstico de cancro do pulmão. Muitas moléculas de imagem já ter uso clínico e sub-clínica, por exemplos, as moléculas radioactivas funcionais de imagem PET [26], novos materiais magnéticos para IRM imagiologia [27], novos materiais para imagiologia ultra-sónica [28] e imagiologia de PET /MRI [29 ]. Mesmo já existem relatos sobre a bactéria como um reagente de imagiologia bioluminescente no diagnóstico [30], mas a sua aplicação foi limitada devido à escassez da precisão, sensibilidade e força luminescente deste reagente de imagem. Nosso novo sistema pode ajudar-nos não só para discriminar células de câncer de pulmão a partir de outras células, mas também para determinar o gênero das células de câncer de pulmão, o que torna este método mais preciso para o diagnóstico. Actualmente, os métodos que são utilizados clinicamente para determinar o género de células incluem hematoxilina e eosina (H mancha E) [31] e imuno-histoquímica [32], mas estes dois métodos são mais complicadas, dispendiosas e subjectiva em comparação com o nosso novo método . Com baixo investimento (apenas um microscópio de fluorescência necessário) e tempo de preparação curto de amostras, o nosso método fornece uma nova maneira complementar para a tomada de decisões rápidas e precisas sobre se os tumores são benignos ou malignos, onde está à beira da seção de tumor e até mesmo o gênero de tumor o paciente tem durante as operações cirúrgicas [33], [34].

o nosso estudo apresentou um novo método para detectar células do cancro do pulmão diretamente com bactérias peptídeo fluorescente como reagentes luminescentes

in vitro

. Este método tem as vantagens do baixo custo, facilidade de aquisição, facilidade de desempenho, a preparação de tempo curto e objetividade. No entanto, atualmente não poderíamos elucidar o mecanismo molecular detalhadas sobre o evento de ligação entre peptídeos e células. Além disso, ainda precisamos de mais amostras clínicas para confirmar a validade do nosso sistema. Mesmo que, a partir dos presentes resultados experimentais, acreditamos que este método tem um enorme potencial como um novo meio de diagnóstico clínico. Em futuros estudos, o apoio de dados experimentais de massa é necessária para promover a tradução deste método da bancada para a clínica.

Informações de Apoio

Figura S1. resultados

FACS de várias células de ligação com bactérias peptídeo fluorescente monoclonais fixado em relação 1:500.

doi: 10.1371 /journal.pone.0054467.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Dr Vittorio De Franciscis e Laura Cerchia para a prestação de ratos A549 amostras de xenotransplante tumoral em lâminas de parafina. Agradecemos Dr Biliang Zhang Haiyan e Liu para fornecer linhas celulares.