Abstract
Fundo
Foram avaliados os efeitos terapêuticos do PXD101 inibidor da histona deacetilase sozinho e em combinação com convencional quimioterapia no tratamento de câncer de tireóide.
Metodologia /Principais achados
Foram estudados oito linhas de células de quatro tipos de cancro da tiróide (papilar, folicular, medular anaplásico e). A citotoxicidade do sozinho e em combinação com três agentes quimioterapêuticos convencionais (doxorrubicina, paclitaxel e docetaxel) PXD101 foi medida utilizando um ensaio de LDH. expressão blot avaliada ocidental de acetilação da histona H3, H4 histonas e tubulina, proteínas associadas com a apoptose, RAS /RAF /ERK e PI3K /AKT /mTOR vias de sinalização, danos e reparação do ADN. Apoptose e espécies de oxigénio reactivas (ROS intracelulares) foram medidos por citometria de fluxo. Os ratinhos portadores de flanco cancros da tiróide anaplásico (ATC) foram tratados diariamente com injeção intraperitoneal de PXD101 durante 5 dias por semana. PXD101 inibiu eficazmente a proliferação de células do cancro da tiróide de uma forma dependente da dose. PXD101 induzida acumulação de ROS e inibiu RAS /RAF /ERK e PI3K /mTOR em células sensíveis. danos no ADN de cadeia dupla e a apoptose foi induzida por PXD101 em ambas as linhas de células sensíveis e resistentes. PXD101 crescimento retardado de tumores xenoenxerto 8505c ATC com a segurança promissor. terapia de combinação de PXD101with doxorubicina e paclitaxel demonstrou efeitos sinérgicos contra quatro linhas ATC
em
vitro
.
Conclusões
PXD101 reprime a proliferação de cancro da tiróide e tem sinérgica efeitos em combinação com doxorubicina e paclitaxel no tratamento de ATC. Estes resultados suportam ensaios clínicos utilizando PXD101 para os pacientes com esta doença dismal
Citation:. Lin SF, Lin JD, Chou TC, Huang YY, Wong RJ (2013) Utilidade de um desacetilase de histona Inhibitor (PXD101) para Thyroid Tratamento do câncer. PLoS ONE 8 (10): e77684. doi: 10.1371 /journal.pone.0077684
editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Itália |
Recebido: 16 de junho de 2013; Aceito: 03 de setembro de 2013; Publicação: 14 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Shu-Fu Lin. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Chang Gung Memorial Hospital e Chang Gung University (CMRPG3A0161, CMRPG3A0162, CMRPG3A0163, CMRPG370581, CMRPG370582 e CMRPG370583) (https://www.cgmh.org.tw/. https://www.cgu.edu.tw/bin /home.php). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
A incidência de câncer de tireóide tem aumentado ao longo das últimas três décadas em todo o mundo [1]. Aumento da detecção de pequenos tumores (≤ 1 cm) é responsável por metade do aumento, embora outras etiologias para este aumento continuam a ser determinado [2,3]. Os tipos patológicos mais comuns de cancro da tiróide são originários de folicular (papilar, folicular, cancro pouco diferenciado e anaplásico) e células da tireóide parafoliculares (câncer medular). Os doentes com cancro bem diferenciado da tiróide (papilar e carcinoma folicular) geralmente têm prognóstico favorável. No entanto, existe um tratamento limitado para pacientes que desenvolvem câncer de tireóide metastático e radioiodine refratário, que é muitas vezes incurável [4]. ATC é um tumor maligno raro e geralmente fatal, com uma sobrevida média de apenas seis meses. cancro medular da tiróide (MTC) é responsável por cerca de 4% das neoplasias malignas da tiróide nos EUA em 2012. Embora os dois quinase inibidores vandetanib e CABOZANTINIB melhorar a sobrevida livre de progressão da MTC e foram aprovados pelo FDA recentemente, não há terapias curáveis estão disponíveis para MTC metastático [ ,,,0],5]. No geral, a mortalidade por câncer de tireóide foi ligeiramente aumentando anualmente desde 1992 [1]. Os novos tratamentos são necessários para melhorar os resultados dos pacientes com câncer de tireóide refratário.
histona desacetilases (HDACs) Remova grupos acetil de resíduos de lisina em substratos de histonas e não-histonas, incluindo fatores de transcrição e proteínas que controlam ciclo celular, proliferação e apoptose. As HDAC 4 são divididos em classes de acordo com a sua homologia com os seus ortólogos de levedura e como parecem ser alvos promissores para a terapia do cancro [6-8]. A inibição de HDAC utilizando pequenas moléculas induz vários efeitos biológicos, incluindo a acumulação de ROS, a paragem do ciclo celular, apoptose e dano do ADN que pode levar a efeitos citotóxicos. As células malignas são considerados para ser mais propenso a inibidores de HDAC que células benignas [6]. FDA aprovou dois inibidores de HDAC suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) e depsipéptido no tratamento de linfoma de células T cutâneas.
amostras da tiróide, ATC tem a maior proporção de HDAC1 e 2 superexpressão (80% e 92%), seguido por carcinoma papilífero (61% e 53%) e tecido tireoidiano normal (0% para ambos), sugerindo HADC1 e 2 contribuir para tumorigênese e desdiferenciação cancro da tiróide [9]. De acordo com estes resultados, Na
+ /I
– expressão symporter e acumulação de iodo pode ser induzida por inibidores de HDAC em câncer de tireóide pouco diferenciado e indiferenciado [10,11]. Além de promover a célula re-diferenciação, inibidores de HDAC é capaz de induzir a apoptose em carcinoma da tiróide [12-14]. Estes resultados sugerem que os inibidores de HDAC tem o potencial para tratar cancro da tiróide através de indução de células cancerosas re-diferenciação e apoptose. Além disso, a terapia de combinação de inibidor de HDAC com quimioterapia pode melhorar a eficácia terapêutica contra ATC [14-16]. Assim, os inibidores de HDAC são potenciais agentes no tratamento de pacientes com cancro da tiróide refractário.
PXD101 (belinostat) é um inibidor da pan-HDAC com efeitos citotóxicos potentes contra uma variedade de tipos de cancro, através da indução de apoptose, independentemente da herdeiro resistência de quimioterapia [17,18]. A combinação de PXD101 com docetaxel mostrou efeitos benéficos no tratamento de células cancerosas do ovário e da próstata [19,20]. Clinicamente tratamento, combinado de PXD101, paclitaxel e carboplatina resultou numa resposta parcial em pacientes com tumores sólidos em um estudo de fase I [21]. PXD101 em combinação com a doxorrubicina, também tem resultados favoráveis no tratamento de sarcoma dos tecidos moles em uma fase I /II de ensaios [22]. Estes dados nos levou a explorar a eficácia terapêutica do PXD101 no cancro da tiróide. Nós também avaliou os efeitos da combinação de PXD101 e quimioterapia no tratamento de ATC, o tipo mais agressivo de câncer de tireóide.
Resultados
citotoxicidade e acetilação das histonas H3, H4 histonas e tubulina por PXD101
PXD101 inibiu a proliferação de células em oito linhas de cancro da tiróide de uma forma dependente da dose (Figura 1A). Estas linhas celulares incluiu uma papilar (BHP7-13), uma folicular (WRO82-1), um indiferenciado folicular (FRO81-2), quatro anaplásico (8305C, 8505c, KAT18, KAT4C) e um medular (TT) cancro da tiróide humana. PXD101 a 1,25 umol /L reprimido pelo menos 45% do crescimento celular em 7 de 8 linhas de células no dia 4. PXD101 a 10 nmol /L inibiu o crescimento celular mais do que 70% em linhas de cancro da tiróide originárias de células foliculares e 95% em parafolicular câncer medular (TT). Calculou-se a dose de efeito médio (Dm) do PXD101 no dia 4 para cada linha celular (Figura 1B). Entre as células originárias foliculares cancro da tiróide, quatro linhas ATC foram mais sensíveis ao PXD101 que folicular câncer indiferenciado e câncer bem diferenciado (Dm; 8305C = 0,59 mmol /L, 8505c = 0,93 mmol /L, KAT18 = 0,87 mmol /L, KAT4C = 1,13 umol /L, FRO81-2 = 1,71 umol /L, WRO82-1 = 1,33 umol /L, BHP7-13 = 1,49 umol /L). A Dm da MTC linha de câncer de TT foi de 0,33 mmol /L. Nós exploramos os efeitos de PXD101 em três linhas de cancro da tiróide derivados de células foliculares nos seguintes estudos
A, as curvas de dose-resposta foram obtidas no dia 4 a partir de células tratadas com uma série de seis: 1. 1 de diluições PXD101. B, Dm de PXD101 no dia 4 foi calculada utilizando software CompuSyn para cada linha de células. Entre sete linhas de cancro da tiróide derivados de células foliculares, as linhas celulares ATC (8305C, 8505c, KAT18 e KAT4C) teve o menor Dm, seguido por folicular bem diferenciado (WRO82-1) e papilar câncer (BHP7-13) e folicular indiferenciado cancro da tiróide (FRO81-2). células de câncer medular da tiróide (TT) também teve baixa Dm. C, PXD101 induzida acetilação de histonas H3 e H4 de histona de um modo dependente da dose. PXD101 também aumentou a acetilação da tubulina em BHP7-13, WRO82-1 e 8505c.
histona H3, H4 histonas e tubulina pode ser acetilado pela inibição de HDAC. Os efeitos de PXD101 para induzir acetilação destas proteínas foram avaliadas às 48 horas em 3 linhas de células que representam papilar (BHP7-13), folicular (WRO82-1) e anaplásico (8505c) cancro da tiróide (Figura 1C). PXD101 ≥ 0,625 umol /L induziu significativamente a acetilação de histona H4 e tubulina em todas as linhas celulares. PXD101 ≥ 1,25 umol /L aumentou a acetilação de histona H3 em WRO82-1 e 8505c. Em BHP7-13, histona H3 acetilada apareceu quando foi aplicada uma dose maior de PXD101 (2,5 umol /L). Estes dados sugerem PXD101 é capaz de reprimir HDACs.
Efeitos de PXD101 na apoptose
BHP7-13, WRO82-1 e 8505c foram expostos a PXD101 para 48 e 72 horas e as células sub-G1 foram avaliadas (Figura 2A). Em comparação com o controlo, PXD101 a 1,25 e 2,5 nmol /L significativamente a apoptose induzida, tal como determinado pela proporção de células sub-G1 às 48 e 72 horas em todas as linhas celulares.
A, a apoptose foi analisada por meio de medições de DNA conteúdo usando citometria de fluxo às 48 e 72 horas. Doses crescentes de PXD101 induziu maior proporção de células sub-G1, em todas as linhas celulares. B, imunotransferência mostrou PXD101 degradada verdugo da caspase-3 em três linhas de células.
Para confirmar o efeito apoptótico, a caspase-3 foi avaliada por transferência de Western, após 48 horas de tratamento (Figura 2B). doses mais elevadas de PXD101 causou mais degradação da apoptose carrasco caspase-3 em BHP7-13 e 8505c. Degradação da caspase-3 foi também observada em WRO82-1 quando tratados com PXD101 de 2,5 umol /L. Estas descobertas suporta apoptose é o mecanismo para a citotoxicidade de PXD101 em células de cancro da tiróide.
Efeitos de PXD101 em ROS acumulação
A acumulação de ROS por inibidores de HDAC é considerada um dos mecanismos responde por citotoxicidade (6). Foram avaliados o efeito usando 2 ‘, 7’-ensaios Dichlorofluorescin diacetato (DCFH-DA) para detectar intracelular ROS nas células expostas a PXD101 durante 16 horas (Figura 3a). Em comparação com o controlo, PXD101 a 0,625 umol /L aumentou significativamente DCFH-DA fluorescência em WRO82-1 (163,1 ± 0,8 e 124,3 ± 2,4, P 0,001) e 8505c (135,6 ± 0,9 e 117,1 ± 0,5, P 0,001). Doses mais elevadas de PXD101 induziu maior acumulação de ROS nestas células. No entanto, este efeito não foi observado em BHP7-13 que é menos sensível a PXD101. Uma exposição mais longa de PXD101 ainda não conseguiu induzir acumulação de ROS em BHP7-13 (24 e 48 horas, dados não mostrados). Duas linhas de células representativas demonstraram a capacidade de induzir a acumulação PXD101 a ROS (Figura 3B). Estes achados sugerem acumulação de ROS não pode dar conta citotoxicidade de PXD101 na linha de células de cancro da tiróide resistente.
A, DCFH-DA fluorescência foi utilizado para medir ROS por citometria de fluxo em células de câncer de tireóide tratadas com PXD101 por 16 horas . Doses crescentes de PXD101 produziu mais ROS em WRO82-1 e 8505c, mas este efeito não foi observado em BHP7-13. B, duas linhas celulares representam a capacidade de PXD101 para acumular ROS. C, imunotransferência mostra PXD101 reprimido P-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46) e da proteína ribossómica de p-S6 (Ser235 /236) em 8505c. Os efeitos inibitórios não foram observados quando uma dose baixa de PXD101 (0,625 umol /L) aplicado em BHP7-13 e WRO82-1. D, doses crescentes de PXD101 reforçada degradação do Ku70, Ku80 e RAD51, e maior expressão da p-H2AX (Ser139), RAD52 e ERCC1 em BHP7-13, WRO82-1 e 8505c.
Modulation de proteína associada a RAS /RAF /ERK e PI3K /AKT /mTOR vias de sinalização por PXD101
RAS /RAF /ERK e PI3K /AKT /mTOR transdução de sinalização são importantes para o crescimento e sobrevivência de câncer de tireóide (4 ). Um relatório prévio mostra que um inibidor de HDAC podem inibir estas vias em células de leucemia [23]. Nós exploramos os efeitos de PXD101 sobre estas vias em BHP7-13, WRO82-1 e 8505c (Figura 3C). PXD101 consistentemente reprimido P-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46) e da proteína ribossómica de p-S6 (Ser235 /236) em 8505c, que é a célula sensível linha. PXD101 teve efeitos mínimos sobre a p-AKT em BHP7-13 e WRO82-1. Inesperadamente, baixo PXD101 dose (0,625 μmmol /L) activado p-ERK1 /2 e proteína ribossômica p-S6 em BHP7-13 e WRO82-1. p-4E-BP1 foi também aumentado em WRO82-1. Portanto, PXD101 inibe RAS /RAF /ERK e PI3K /AKT /mTOR cascatas de sinalização em uma linha de células sensíveis.
Efeitos de PXD101 em danos no DNA e reparar
inibidores de HDAC são capazes de promover dupla breaks -cordas DNA (LAP) e levar à apoptose [24,25]. Este mecanismo pode contribuir para a citotoxicidade de PXD101 no cancro da tiróide. Foi avaliada a expressão de proteínas associadas com danos no DNA e reparação em células tratadas com PXD101 durante 48 horas (Figura 3D). p-H2AX (Ser139), um marcador de LAP tradicionais foi significativamente reforçada com um modo dependente da dose em todas as linhas celulares, apoiar PXD101 pode induzir DSB em células de cancro da tiróide. relatórios anteriores mostra inibidores HDAC pode reprimir proteínas de reparo do DNA que contribuem para LAP [24-26]. Estudamos essa possibilidade e encontrou PXD101 diminuiu consideravelmente a final não homóloga juntar (NHEJ) proteína de reparo do DNA Ku70 em todas as linhas de células (Figura 3D). Outra Ku80 NHEJ proteína também foi reprimida em certa medida. Degradação de qualquer Ku70 ou Ku80 pode levar ao comprometimento do reparo NHEJ. reparação de recombinação homóloga (HR) é outra via LAP reparação importante. Procedeu-se a estudar a expressão de uma proteína RAD51 reparação HR central e encontrou RAD51, nomeadamente, foi reprimida pela PXD101 em todas as linhas de células (Figura 3D). Estes dados sugerem que PXD101 pode inibir a reparação do HR. Quando o pivô máquinas LAP reparo NHEJ e HR foi comprometida, o DNA de recozimento de cadeia simples (SSA) via pode ser um mecanismo alternativo para reparação de LAP [27]. Esta possibilidade foi examinada neste estudo, bem como, e as proteínas SSA RAD52 e ERCC1 aumentou com a exposição à exposição PXD101 em todas as linhas de células (Figura 3D).
Interação de PXD101 e quimioterapia em células ATC
foi avaliado o efeito da combinação de PXD101 com diferentes agentes quimioterápicos contra células ATC. Três agentes quimioterapêuticos relevantes clínicos (doxorrubicina, paclitaxel e docetaxel) foram utilizados para este estudo [28]. O Dm desses agentes em cada linha celular ATC foi relatado anteriormente [29]. Foram avaliadas as interacções entre o PXD101 e doxorrubicina, paclitaxel e docetaxel. A combinação de PXD101 e cada agente quimioterápico demonstrado efeito terapêutico favorável em todas as linhas de câncer ATC (Figura S1).
As interações entre PXD101 e agentes quimioterápicos foram avaliados por meio do cálculo do índice de combinação (CI) pela equação Chou-Talalay ( Figura 4A), onde IC 1 indica sinergismo, CI = 1 mostra um efeito viciante, e CI 1 indica antagonismo [30,31]. Os efeitos sinérgicos foram reconhecidos para a combinação de PXD101 com doxorrubicina e PXD101 com paclitaxel em todas as linhas de ATC (CI; 8305C = 0,52-0,98 e 0,68-0,91, 8505c = 0,32-0,39 e 0,03-0,58, KAT18 = 0,61-,76 e 0.18- 0,94, KAT4C = 0,51-0,69 e 0,68-0,71, respectivamente). A combinação de PXD101 com docetaxel foram sinérgica no 8305C, 8505c e KAT4C (CI; 8305C = ,83-,84, 8505c = 0,04-0,42, KAT4C = 0,42-0,76). A combinação de PXD101 com docetaxel variou de sinérgica de antagonista em KAT18 (CI; 0,1-1,2). Estes resultados demonstram que a combinação de PXD101 com doxorubicina e paclitaxel tem efeitos sinérgicos contra todas as linhas de controlo do tráfego aéreo, e a combinação de PXD101 com docetaxel é sinérgica em três linhas de quatro. Foi calculado o índice de redução da dose (DRI) de cada agente quimioterápico; o DRI indica a dobra de uma redução da dose da droga na presença de PXD101 (Figura 4B). Sob exposição a PXD101, as doses de doxorrubicina, paclitaxel e docetaxel pode ser reduzida (todos DRI 1,0).
A, IC de PXD101 uns com os agentes quimioterapêuticos foi calculada utilizando o software CompuSyn para cada linha de células de ATC. PXD101 mais doxorubicina e paclitaxel demonstrou efeitos sinérgicos em todas as linhas celulares, com CI 0,8 na maioria das condições. PXD101 mais docetaxel foi sinérgica no 8305C, 8505c e KAT4C e sinérgica para antagônica em KAT18. As linhas tracejadas horizontais na CI = 1 foram retiradas. B, as gamas típicas de valores de DRI para quimioterapia em combinação com PXD101. Com a presença de PXD101, doxorrubicina, paclitaxel e docetaxel todos tinham DRI favorável. A menor DRI de doxorrubicina, paclitaxel e docetaxel em todos apareceu KAT18 (1.8, 1.5 e 1.6, respectivamente). As linhas tracejadas horizontais na DRI = 1 foram retiradas.
terapia PXD101 de tumores do flanco murino
Os efeitos terapêuticos e segurança de PXD101
in vivo
foram avaliados em ratinhos atímicos nus portadores 8505c flanco ATC e xenotransplantes TT. Os ratinhos com tumores do flanco estabelecidos foram tratados com PXD101 intraperitoneal (40 mg /kg) ou veículo diariamente durante 5 doses por semana até aos 14 dias (Figura 5A). PXD101 significativamente reprimido o crescimento do tumor 8505c, em comparação com o grupo de controlo no dia 7 (1,7 ± 0,1 vezes e 3,4 ± 0,5 vezes, P = 0,004) e no dia 14 (3,6 ± 0,3 vezes e 6,6 ± 1,0 vezes, P = 0,014). PXD101 não teve efeitos significativos para mudar o peso corporal durante o período de estudo (Figura 5B). Nós não observamos morbidade nestes animais.
A, injecção intraperitoneal diária de PXD101 durante 5 dias por semana reprimido o crescimento do tumor 8505c. As diferenças de aumento do volume tumoral entre o grupo de controlo PXD101 e atingiram significância estatística nos dias 7 e 14. B, PXD101 não causou perda de peso significativo em ratos (p 0,05). C, no prazo de 3 horas, PXD101 aumento da fosforilação de H2AX e acetilação de histonas H3 e H4, e reprimidos p-AKT, RAD51, caspase-3 e PCNA. As alterações destas proteínas diminuído por 6-16 horas.
As proteínas que podem ser afectados por PXD101 foram avaliados nestes tumores animais (Figura 5C). Uma única injecção intraperitoneal de PXD101 (40 mg /kg), aumento da p-H2AX (Ser139) e acetilação da histona H3 e H4 por 3 horas e os efeitos diminuídos por 6 horas. RAD51 foi reprimida por 3 horas e reapareceu em 6 a 24 horas (Figura 5C, Figura S2). p-AKT (Ser473) foi gradualmente reprimido a 3 e 6 horas e este efeito inibitório estava ausente por 16 horas. O antígeno nuclear de célula marcador de proliferação proliferar (PCNA) foi ligeiramente reduzida de 3 a 6 horas. PXD101 degradado significativamente caspase-3 em 3 a 6 horas. Estes dados revelam que PXD101 teve efeitos robustos, mas transitórios em xenoenxertos ATC, e sugerem que a administração mais frequente de PXD101 pode aumentar a eficácia terapêutica.
Discussão
PXD101 proliferação efetivamente inibiu de linhas celulares de cancro da tiróide oito proveniente de quatro principais tipos histológicos. Entre sete linhas de câncer de tireóide, ATC foi mais sensível do que os cânceres foliculares e bem diferenciadas. Estes achados sugerem que ATC provavelmente depende HDACs mais do que os outros tipos de câncer. TT também tem uma Dm baixa, HDACs implicando são importantes para as células de cancro da tiróide parafoliculares. PXD101 inibe um amplo espectro de HDACs, incluindo classe I, II-A e II-B que impede a concluir que HDAC é mais importante na sobrevivência dos cancros da tiróide.
Um mecanismo terapêutico dos inibidores de HDAC no tratamento de neoplasia maligna é através da indução da apoptose. PXD101 causou efeitos apoptóticos em uma dose e forma dependente do tempo em BHP7-13, WRO82-1 e 8505c, sugerindo que este mecanismo é responsável para a eficácia terapêutica de PXD101.
relatórios anteriores mostram inibidores de HDAC reduzir a atividade tioredoxina, acumular ROS e levar à apoptose em células transformadas, mas não em células normais [6,32]. Por conseguinte, a acumulação de ROS nas células malignas pode ser um mecanismo de citotoxicidade cancro da especificidade dos inibidores da HDAC. Neste estudo, PXD101 acumulada ROS de uma forma dependente da dose na WRO82-1 e 8505c, mas não na linha celular resistente BHP7-13. Estas observações são consistentes com este mecanismo de susceptibilidade aos inibidores de HDAC.
RAS /RAF /ERK e PI3K /AKT /mTOR vias de sinalização são importantes na tumorigênese cancro da tiróide, progressão e sobrevivência [4,33]. A interrupção dessas vias de sinalização é uma estratégia para tratar a doença maligna da tiróide [29,34]. Neste estudo, PXD101 inibido estas vias na linha celular sensível 8505c, mas não em WRO82-1 e BHP7-13. Os dados implicam que a capacidade de inibir a PXD101 RAS /RAF /ERK e PI3K /AKT /mTOR vias podem conferir sensibilidade.
p-H2AX é um marcador clássico de LAP, uma grave tipo de lesões do ADN [35 ]. PXD101 induzida significativamente p-H2AX em linhas celulares de cancro da tiróide três, apoiando LAP como um mecanismo de contabilidade para a citotoxicidade de PXD101. Mostramos que PXD101 diminui proteínas de reparo LAP na NHEJ (Ku70 e Ku80) e de RH vias (RAD51). Para NHEJ, o heterodímero Ku70-Ku80 reconhece LAP, e recruta um complexo de proteínas DNA quinase. A expressão diminuída de Ku70 ou Ku80 pode prejudicar a via de reparação do NHEJ [27,36]. Por RH, RAD51 liga-se ao final ressecado de ADN de cadeia simples (ADNcs RAD51-nucleoproteína do filamento), permitindo para o recozimento strand-dependente de síntese para reparar DSB [37]. A análise da extensão da contribuição de proteínas individuais de RH a reparação do ADN e verificou que a depleção de RAD51 induz o defeito mais importante RH [37,38]. A via SSA é um mecanismo alternativo para reparação de LAP quando NHEJ e HR estão com defeito [27,39]. PXD101 aumento RAD52 e ERCC1, sugerindo que a via de SSA foi activado. No entanto, quando p-H2AX é aumentada, a activação de SSA parece insuficiente para DSB de reparação [40]. Além PXD101, outros inibidores de HDAC são capazes de reprimir as proteínas de reparação de DSB [41-43]. Alguns HDACs são responsáveis pela reparação do ADN; HDAC1 e 2 promover NHEJ e HDAC 9 e 10 são necessários para o HR [44,45].
tratamento PXD101 significativamente reprimido o crescimento do tumor 8505c durante o período do estudo. PXD101 transitoriamente aumento da acetilação das histonas H4 que é consistente com o relatório anterior [17]. Aumento de p-H2AX sugere PXD101 LAP induzidos em xenoenxertos 8505c. O efeito anti-tumoral de PXD101 pode ser através de apoptose e inibição da proliferação, desde a caspase-3 e PCNA estavam diminuídas. Não há perda de peso significativa ou toxicidade observada no presente estudo, sugerindo um perfil de segurança favorável. Também examinamos os efeitos terapêuticos da PXD101 em camundongos com tumores TT. injecção intraperitoneal diária de PXD101 (40 mg /kg) durante 5 doses por semana não conseguiram reprimir o crescimento de xenoenxertos de TT (dados não mostrados). É possível que um regime de tratamento mais intensivo PXD101 pode afetar o crescimento de xenoenxertos TT.
ATC é o cancro da tiróide mais agressivo e normalmente é fatal, com uma taxa de sobrevivência de 1 ano de apenas 20% [28] . Os novos tratamentos são necessários para melhorar os resultados desanimadores. Descobrimos que a combinação de PXD101 PXD101 com doxorrubicina e com paclitaxel tinham efeitos sinérgicos contra quatro linhas de células de ATC. relatório prévio mostra a heterogeneidade das células cancerosas aparece mesmo em um único tumor [46]. Portanto, o regime de associação com efeitos sinérgicos contra várias linhas de células ATC que têm antecedentes genéticos variada pode ser de relevância clínica. Doxorrubicina inibe a topoisomerase II e provoca quebras no ADN genómico [47]. PXD101 inibida máquinas de reparação do ADN de cadeia dupla que pode aumentar a citotoxicidade da doxorrubicina. O paclitaxel mostrou uma taxa de resposta de 53% contra a ATC em um ensaio clínico de fase II [48]. Os efeitos combinação favorável de PXD101 com a consideração o apoio paclitaxel de uso desta terapia em pacientes com ATC.
Recentemente, Chan et al. também relataram que PXD101 retarda o crescimento de tumores de xenoenxerto de PTC [49]. portanto, PXD101 tem uma capacidade de inibir o crescimento de ambos cancro da tiróide bem diferenciado e não diferenciado
in vivo
. Estes dados reforçar a possibilidade de que PXD101 pode ser utilizado para tratar pacientes com esta doença fatal. Em contraste com nossos achados, PXD101 consistentemente reprimida p-AKT (Ser473) e p-ERK no estudo anterior. Uma possível explicação desta divergência entre dois estudos é a alta dose de PXD101 (≥ 20 vezes) que foi aplicado no estudo anterior, em comparação com o nosso estudo. Tais doses elevadas de PXD101 são mais propensos a reprimir p-AKT e p-ERK. Nosso estudo demonstra que, adicionalmente, vários eventos moleculares induzidos por PXD101 pode causar citotoxicidade, e mostra a eficácia da terapia de combinação com PXD101 com quimioterapia convencional atualmente em uso para cancro da tiróide anaplásico. É importante salientar, que demonstram efeitos sinérgicos de combinação PXD101 com doxorrubicina e paclitaxel, sugerindo significado clínico provável no tratamento de pacientes com ATC.
Em conclusão, PXD101 imposta citotoxicidade significativa nos quatro principais tipos histológicos de câncer de tireóide. ratinhos nus portadores de tumores de xenoenxerto 8505c demonstrou a eficácia ea segurança perfis terapêuticos de PXD101. Importante, PXD101 melhora sinergicamente o efeito terapêutico de doxorubicina e paclitaxel contra quatro linhas de células de ATC. Estes dados favoráveis apoiar a concepção de futuros ensaios clínicos que estudam a utilidade de PXD101 como um agente para o tratamento de pacientes com câncer de tireóide avançado
Materiais e Métodos
As linhas celulares
Oito. linhas celulares de cancro da tiróide bem estabelecidas foram estudados, incluindo um papilar (BHP7-13), uma folicular (WRO82-1), um indiferenciado folicular (FRO81-2), quatro anaplásico (8305C, 8505c, KAT18, KAT4C) e um medular (TT) cancro da tiróide humana [29,50-52]. Todas as linhas de células, exceto KAT4C foram autenticadas usando DNA (curtas repetições em tandem) de perfil e armazenado em azoto líquido antes da utilização [29,53]. BHP7-13, WRO82-1, FR081-2, KAT4C KAT18 e foram mantidas em RPMI 1640 com bicarbonato de sódio (2,0 g /L). 8505c e 8305C foram mantidas em MEM com piruvato de sódio (1 mmol /L) e bicarbonato de sódio (2,2 g /L). TT foi mantida em F12K. Todos os meios continham 10% de FCS, 100.000 unidades /L de penicilina e 100 mg /L de estreptomicina. Todas as células foram mantidas numa atmosfera de 5% de CO2, incubadora humidificada a 37 ° C.
Os agentes farmacológicos
PXD101 é uma panela de HDAC-inibidor descrito anteriormente [17], e foi obtido a partir de Selleck Chemicals. PXD101 foi dissolvido em DMSO (10 mmol /L para
In vitro
e 100 mg /ml para
In vivo
estudos; Sigma) e armazenadas a -30 ° C até os experimentos. Para
In vivo
estudos, PXD101 foi ainda diluído com PBS a uma concentração final de 8,6 mg /ml. A doxorrubicina, paclitaxel e docetaxel foram obtidos da Sigma Chemical Co. A doxorrubicina (5 mmol /L) foi dissolvido em PBS, o paclitaxel (320 umol /L) e o docetaxel (640 umol /L) foram dissolvidos em DMSO e armazenado a -30 ° C até o uso.
Anticorpos
Os anticorpos segmentação acetil. Histonas H3 e H4 de histona foram da Merck Millipore. Acetilo. anticorpos de tubulina e α-tubulina foram da Sigma. A caspase-3, P-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46), da proteína ribossómica de p-S6 (Ser235 /236), p-H2AX (Ser139) , anticorpos Ku70, Ku80, RAD52, ERCC1 e PCNA eram de sinalização celular. RAD51 anticorpo foi de Invitrogen.
Os ensaios de citotoxicidade
As células foram plaqueadas a 2 x 10
3 a 2 x 10
4 culas por po em placas de 24 poços em 1 ml meios de comunicação. Após incubação durante a noite, PXD101 ou veículo foram adicionadas, na concentração indicada. Seis em série 1: 1 de diluições PXD101 foram testados a partir de 10 mmol /L ao longo de um curso de tratamento de 4 dias. A citotoxicidade foi determinada no dia 4. As células foram lavadas com PBS e lisadas com Triton X-100 (1,35%, Sigma) para libertar intracelular lactato-desidrogenase (LDH), a qual foi quantificada com um estojo Cytotox 96 (Progmega) a 490 nm por espectrofotometria (BT-MQX200R, Bio-Tek Instruments). Cada experiência foi efectuada em triplicado e os resultados são apresentados como a percentagem de células determinada por comparação da LDH de cada amostra em relação a amostras de controlo que são considerados 100% viável sobreviver. Dm no dia 4 foram calculados para cada linha celular usando o software CompuSyn [30,31].
Para as experiências de terapia de combinação, as células foram tratadas com ATC PXD101 e uma droga quimioterapêutica (doxorrubicina, paclitaxel ou docetaxel), a uma fixo a dose de razão. As células foram incubadas com veículo, PXD101, agente quimioterapêutico, ou os dois em simultâneo para um curso de 4 dias e a citotoxicidade foi medida. Seis a sete série 1: 1 diluições foram examinados nas doses a seguir a partir de 8305C, 8505c, KAT18 e KAT4C: PXD101 em 2,4, 3,6, 3,6 e 4,4 nmol /L, doxorrubicina em 0,64, 0,16, 0,22, 0,27? Mol /L, paclitaxel a 50,8, 22,4, 17,6 e 13,2 nmol /L, o docetaxel a 34,4, 6,8, 5,2 e 7,6 nmol /L, respectivamente. As doses escolhidas foram baseados no Dm determinada neste e em estudos anteriores [29].
Western blots
As células foram plaqueadas a 1 x 10
6 células em 10 cm placas de Petri em 10 ml de meio durante a noite e tratados com PXD101 ou veículo durante 48 horas. As pelotas de células foram dissolvidas em tampão de ensaio de radio-imunoprecipitação e cocktail de inibidores de protease, vórtex e clarificada por centrifugação. A proteína total (20-50 ug) foi submetido a electroforese em geles de 10-12% de Tris-HCl, transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno, bloqueado, e expostos a anticorpos primários seguido de um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. Os sinais foram desenvolvidos utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (Bionovas Biotechnology). α-tubulina serviu como controlo de carga.
A apoptose e ROS avaliação
As células foram plaqueadas a 1 x 10
5 células por poço em placas de 6 poços em 2 ml de meio durante a noite e tratada com placebo ou PXD101 em doses indicadas para 48 e 72 horas. células de flutuação e tripsinizadas células aderentes foram recolhidas, lavadas com PBS, fixadas com etanol frio a 70% e incubou-se com RNase A (100 ug /mL; Sigma) e iodeto de propídio (5 ug /mL; Sigma) a 37 ° C durante 15 min . Apoptóticas de células sub-G1 foram detectados pelo conteúdo em ADN utilizando citometria de fluxo (BD citómetro de fluxo FACSCalibur, BD Biosciences).
As células foram plaqueadas a 1 x 10
5 células por poço em placas de 6 poços em 2 ml de meio durante 24 horas e tratado com placebo ou PXD101 em doses indicadas, durante 16 horas. tripsinizadas células aderentes foram recolhidas e incubadas com 10 nmol /L de DCFH-DA (Sigma) a 37 ° C no escuro durante 30 minutos. 0,05.