Abstract
ETK é uma tirosina-quinase não receptora, que fornece um sinal de sobrevivência forte em células cancerosas humanas da próstata. Src, outra tirosina-quinase que activa cruzada com ETK, tem sido demonstrado que desempenham um papel importante na metástase do cancro da próstata. Aqui, nós descobrimos uma nova classe de inibidores ETK. Dentro destes inibidores, CTA095 foi identificado como sendo um potente e ETK Src inibidor dual. CTA095 foi encontrada para induzir autofagia, bem como a apoptose em células de cancro da próstata humanos. Além disso, CTA095 inibiu a formação de tubo HUVEC de células e “a cicatrização de feridas” de células de cancro da próstata humanas, o que implica o seu papel na inibição da angiogénese e metástases de cancro da próstata humano. Mais interessante, CTA095 poderia superar a resistência inibidor de Src em células de câncer de próstata. Ela induz a apoptose em células de cancro da próstata resistentes a inibidores de Src, provavelmente através de um mecanismo de regulação para baixo de Myc e BCL2. Essa descoberta indica que a segmentação simultaneamente ETK e Src poderia ser uma abordagem promissora para superar a resistência de droga no cancro da próstata
Citation:. Guo W, Liu R, Bhardwaj G, Ma AH, Changou C, Yang JC, et al . (2013) CTA095, um ETK Novel e Src inibidor duplo, induz a apoptose em células cancerosas da próstata e Resistência Supera a Src inibidores. PLoS ONE 8 (8): e70910. doi: 10.1371 /journal.pone.0070910
editor: Qiming Jane Wang, da Universidade de Pittsburgh School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de março de 2013; Aceito: 25 de junho de 2013; Publicação: 15 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi em parte suportado pelo C-Tag Bioscience Inc (bolsa de pesquisa para RL); NIH concede DK52659 CA150197 (para HJK) e CA098116 (a KSL); e Prêmio DOD Pós-Doutorado Formação PC080859 e Auburn Endowment Fund Cancer Comunidade (para WG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. C-Tag Inc é um financiador comercial para este trabalho, e ambos KSL e HJK são conselheiros científicos para C-TAG Inc. Isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS ONE sobre partilha de dados e materiais.
Introdução
o câncer de próstata é o cancro mais frequentemente diagnosticado e a segunda principal causa de mortes por câncer de homens em os EUA [1]. Embora o câncer de próstata fase inicial (PAC) pode efetivamente ser controlado por terapia hormonal, CaP metastático permanece incurável. Os inibidores de tirosina cinase (TKI) estão entre as terapias orientadas mais promissoras; ainda seu potencial como próstata cancro terapêutica não foram plenamente realizados e, até à data, os resultados de ensaios clínicos utilizando TKI como agentes únicos têm sido geralmente modesta, provavelmente devido à redundância na ligação ao receptor e sinalização de mediadores intracelulares [2]. A maior parte dos inibidores da tirosina quinase que têm sido desenvolvidos são dirigidos contra a tirosina-quinases receptoras. ETK é uma tirosina-quinase não receptora, que é sobre-expresso em amostras de cancro da próstata humano e fornece funções de sobrevivência fortes em células de cancro da próstata [3], [4]. Etk medeia a activação crítica de STAT3 em Cap sugerindo que a perturbação funcional do etk pode atenuar múltiplos sinais principais envolvidos no crescimento PAC e sobrevivência [5]. ETK também regula a sobrevivência [6], metástase [7], a resistência aos medicamentos [3], [8], angiogénese [9], e a apoptose [10]. Superexpressão de ETK induz próstata neoplasia intra-epitelial em um rato [11]. Relatórios recentes indicam que ETK desempenha um papel importante na auto-renovação e potencial tumorigénico de células de glioblastoma estaminais através da activação de Stat3 [12]. Portanto, a inibição sistémica da ETK podem oferecer efeitos anti-tumor sinérgicas. Até agora, não há nenhum inibidor eficaz desta cinase.
Src, ETK, e FAK associado com e activar cruzada uns aos outros. A inibição de uma frequência diminui a actividade dos outros. Estes três quinases têm demonstrado desempenhar um papel importante na angiogénese e metástases de células cancerosas da próstata. O inibidor de Src, AZD0530, tem sido relatado para inibir o cancro da próstata metástase óssea em modelos animais. No entanto, este inibidor não possui a actividade para induzir apoptose de células cancerosas da próstata. inibição dupla de ETK e Src pode não só superar a desvantagem de inibidores de Src, mas também pode aumentar a eficácia na inibição da metástase de células cancerosas da próstata.
A autofagia é um processo catabólico que envolve a degradação dos próprios componentes de uma célula através da lisossômico máquinas [13]. É um processo altamente regulado, que ajuda a manter um equilíbrio entre a síntese, a degradação, e subsequente reciclagem dos produtos celulares [14]. Autophagy pode contribuir tanto para a sobrevivência celular e morte celular de um modo dependente do contexto. moduladores autofagia, agora surgem sensibilizadores ou modificadores de terapia-alvo como importantes [15], [16].
A seguir, relata a identificação de um romance ETK e Src inibidor duplo, CTA095, o que induz a autofagia e apoptose, como bem como efeitos sinérgicos com moduladores autofagia em células cancerosas da próstata. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório de um ETK e Src inibidor duplo com uma aplicação como um agente anti-cancro.
Materiais e Métodos
Reagentes
Purificada ETK , Btk, Mertk, Yes e Src quinases foram obtidos de Millipore Inc. (Dundee, UK). Iodeto de propídio (PI),
N
,
N
diisopropiletilamina (DIEA),
N
,
N
-dimethylformimide (DMF), etanol, acetonitrilo (ACN), 1- (3-aminopropil) piperidina, ácido trifluoroacético (TFA), Pd /C, formato de amónio e sul f óxido de dimetilo (DMSO) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). L-fenilglicina cloridrato de éster de metilo foi adquirido a Chem-Impex International Inc (Wood Dale, IL). Dibenzofuran-2-carboxaldeído foi comprado de Oakwood Products, Inc. (West Columbia, SC). O kit de detecção de apoptose FITC anexina V-Abcam foi obtido a partir de (Cambridge, MA). A cromatografia de fase inversa de alto desempenho líquida (RP-HPLC) a partir da Waters Corporation (Milford, MA) foi utilizado para a análise e purificação de CTA095. LNCAP, CWR22Rv1, RWPE1, 293 e células HUVEC foram obtidas de ATCC (Manassas, VA).
síntese de um pote de CTA095
A abordagem sintética de CTA095, 2-(dibenzo[
b
,
d
]furan-2-yl)-7-phenyl-1-(3-(piperidin-1-yl)propyl)-1
H
-imidazo[4,5-
g
]quinoxalin-6(5
H
)-one, é semelhante à abordagem já relatado anteriormente [17]. Em resumo, uma solução de L-fenilglicina cloridrato do éster de metilo (201,7 mg, 1,0 mmol) e DIEA (383,2 ul, 2,2 mmol) em DMF (1,5 ml) foi adicionado gota a gota sob agitação vigorosa a uma solução de 1,5-difluoro 2,4-dinitrobenzeno (204,0 mg, 1,0 mmol) em DMF (0,5 ml). A solução de reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 45 min. Isto foi seguido pela adição de uma solução de 1- (3-aminopropil) piperidina (159 uL, 1,0 mmol) e DIEA (174,2 ul, 1,0 mmol) em DMF (1 ml). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Etanol (20 mL), Pd /C (10%, 200 mg), e formato de amónio (1,50 g, 23,8 mmol) foram adicionados à solução. A solução foi aquecida a refluxo durante 3 h e depois arrefecida até à temperatura ambiente. O Pd /C foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado com evaporador rotativo. Dibenzofuran-2-carboxaldeído (196,2 mg, 1,0 mmol) em DMF foi adicionada à solução. A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 dia. A solução de DMF foi deitada em 40 ml de gelo. O precipitado foi recolhido por filtração e lavado com água, seguido de purificação por RP-HPLC. A fracção foi recolhida e liofilizada para dar um pó amarelo como o produto final (Figura S1). A homogeneidade do composto foi verificada por RP-HPLC analítica. A pureza foi determinada como sendo 95% puro. A identidade dos compostos foi confirmada por dessorção /ionização por laser em tempo assistida por matriz de espectrometria de massa de voo. Encontrado: 554,26 Dalton (calculado: 554,26 Dalton para MH
+)
Modelagem Molecular
estudos de docking molecular foram realizados para entender a ligação do CTA095 para ETK.. estrutura otimizada de energia de CTA095 foi calculada utilizando Merck Molecular Field Force (MMFF) [18], como implementado no Marvin Suíte v 5,11 (https://www.chemaxon.com/products/marvin). A estrutura tridimensional de ETK humana (resíduos 275-675) sequência (NCBI GI: 42544182) foi previsto usando uma abordagem baseada em modelação de homologia tal como implementada na HHPred [19], [20]. Para definir um sítio de ligação putativo para CTA095 na estrutura da proteína ETK, primeiro usou uma abordagem cega encaixe implementado no webservice SwissDock (https://swissdock.vital-it.ch) [21], [22]. Entre os agrupamentos gerados por SwissDock, a conformação de menor energia livre de ligação foi selecionado. A fim de compreender ainda mais a estabilidade ea dinâmica do complexo ligando-quinase, foi realizada uma simulação de dinâmica molecular 20 ns (MD), começando com a estrutura mais ancorado previsto por SwissDock. Estas simulações foram realizadas utilizando NAMD v 2.7b2 [23]. campos de força CHARMM27 foram utilizados para calcular os potenciais de ETK, enquanto CHARMM22 (como implementado em SwissParam (https://swissparam.ch) [24] campos de força foram utilizados para calcular os potenciais de CTA095. O complexo quinase-ligando foi solvatado em uma caixa de água, com as condições de contorno periódicas. as dimensões da caixa de água foram seleccionado para ser, pelo menos, 10 angstrom maior do que o soluto em cada direcção. o sistema inteiro foi neutralizada com 0,15 M de NaCl. um passo de minimização inicial foi realizada para 6000 etapas, seguido de 20 ns de relaxamento. trajetórias dessas simulações foram visualizadas utilizando VMD v 1.9 [25], e das interações entre quinase e o ligante foram plotados usando PyMOL e ligplot + v 1.4
ensaio de inibição [26]. kinase
de inibição da cinase foi medida utilizando em camada fina-cromatografia (TLC). quinases Resumidamente, purificado (20 nM), o substrato correspondente (500 uM, TSFYGRH para ETK, YIYGSFK para as outras cinases), e CTA095 (0 -10 uM) foram incubados numa reacção de quinase (HEPES 100 mM, pH 7,4, 10 mM MnCl
2, 10 mM MgCl
2, DTT 1 mM) durante 5 min, e a reacção foi iniciada pela adição de 5 uCi
33P-ATP marcado. A reacção (10 ul) foi incubada à temperatura ambiente durante 1 h e foi parada por adição de 10 uL H
3PO
4. A radioactividade do substrato péptido foi analisada por CCF como previamente descrito [27].
ETK ensaio de autofosforilação
actividade autofosforilação ETK foi medida por um ensaio de cinase in vitro. Resumidamente, purificada ETK (100 ng) foi misturada com CTA095 no tampão de ensaio de cinase (Hepes 20 mM pH 7,55, MgCl 10 mM
2, MnCl 10 mM
2, 1 mM de DTT, 500 ^ M de Na
3VO
4). O ATP frio (5 uM) e R- quente
33P-ATP (5 uCi) foram adicionados à mistura e a reacção da cinase foi realizada a 30 ° C durante 30 min. As reacções foram terminadas com um tampão de amostra de SDS-PAGE 4X, e, em seguida, aplicado num gel de 8% de SDS-poliacrilamida para electroforese. O gel foi seco sob vácuo e a actividade de auto-quinase ETK foi analisada com um phosphorimager (Biorad).
cultura celular
LNCAP, PC3, células CWR22Rv1, e RWPE1 foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 10% e 1% de penicilina /estreptomicina /glutamina.
Western blotting
transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [28]. As proteínas foram detectadas utilizando os seguintes anticorpos: β-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ETK (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA), pEtk; Src, pSrc; Stat3, pStat3. Para fosfo-ETK, as células foram pré-tratadas com pervanadato 100 uM durante 15 min antes da colheita.
Ensaio MTT
As células foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas durante a noite, seguido por tratamento com 0,1% de DMSO, como veículo de controlo, e CTA095, nas concentrações indicadas, durante 72 h. A inibição do crescimento foi medida usando um (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) 3- (Roche Diagnostic, Mannheim, Alemanha).
A citometria de fluxo
células PC3 foram tratadas com 0,1% de DMSO (controlo) e CTA095 nas concentrações indicadas, durante 24 h. a paragem do ciclo celular foi determinada pela incorporação de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich) em células permeabilizadas. As células que sofrem apoptose foram identificados utilizando um kit de anexina V-FITC (Abcam), seguindo as instruções do fabricante. As células foram analisadas usando um fluxo Coulter Epics XL citômetro (Beckman Coulter, Miami, FL).
Análise da caspase-3/7 e caspase 9 atividades
Para caspase 3/7 actividades, células PC3 foram semeadas a 5000 células /poço em placas de 96 poços durante a noite. Em seguida, as células foram tratadas com 0-10 uM CTA095 durante 24 h. actividades de caspase-3/7 foram medidas usando o Caspase-3/7 kit Apo-ONE Homogeneous Assay (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. Para a caspase 9, actividade, as células PC3 foram semeadas em 10 mM de placa de cultura de tecido e cresceu a 50% de confluência. As células foram então tratadas com 0-10 uM CTA095 durante 24 h. As células foram colhidas e a caspase 9, a actividade foi medida utilizando um Western blot com um anticorpo anti-caspase 9 anticorpo.
Autophagy ensaio
células PC3 foram estavelmente transfectadas com GFP-LC3 [16]. As células foram cultivadas numa placa de 6 poços a 50% de confluência e tratadas com 5 uM CTA095 durante 24 h. Autofagia foi visualizada por GFP-LC3 “puncta” e immunoblot de isoformas endógena LC3.
HUVEC tubo de ensaio de formação de células
células HUVEC foram semeadas em mitrogel e tratada com CTA095 (0 e 5 M) durante 6 h. formação de tubo vascular foi visualizado utilizando um microscópio.
células PC3 “A cicatrização de feridas” de ensaio
células PC3 foram cultivadas em placa de 6 poços a 60% de confluência. Em seguida, as feridas foram feitas utilizando uma ponta e tratou-se com CTA095 (0 e 5 ^ M). A migração celular (cicatrização de feridas) foi visualizado sob o microscópio nos horários indicados.
A inibição do crescimento do tumor xenoenxerto PC3 por CTA095nano (CAT095 formulada em nano-micelas)
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis (número de protocolo: 16697). Resumidamente, 2 × 10
6 células PC3 foram injectados por via subcutânea com os flancos de ratinhos nus do sexo masculino 5 semanas de idade. O volume do tumor foi medido por um compasso de calibre e calculada usando a fórmula V = (L x W
2) 1/2. Os tumores cresceram até o tamanho indicado e os ratinhos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (8 murganhos /grupo). O grupo controle foi tratado com veículo. O grupo de tratamento foi tratada com CTA095nano a 10 mg /kg duas vezes por semana, através de i.v. injecção. O tamanho do tumor e o peso corporal foram medidos uma vez por semana. O experimento foi encerrado quando o tamanho do tumor do grupo de controlo atingiu endpoints humanas pelo IACUC. Curvas de volumes tumorais versos duração foram plotados para ambos os grupos.
CTA095 supera resistência aos inibidores da Src em células de câncer de próstata
PC3 e PC3-AZD20 (células PC3 resistentes a 20 fiM AZD0530, que é de AstraZeneca através do MTA com as células Dr. Chris Evans) foram semeadas a 2000 células /poço em placas de 96 poços durante a noite. As células foram tratadas com AZD0530 ou CTA095 nas concentrações indicadas. A viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio MTT após 72 h.
CTA095 induz a apoptose em células de cancro da próstata resistentes inibidor através da inibição de Src Myc e BCL2
células PC3-AZD20 foram semeadas a 10
6 células /poço em placas de 6 poços durante a noite. As células foram tratadas com AZD0530 ou CTA095 a 10 uM. A apoptose foi analisada utilizando o kit de detecção de apoptose FITC anexina-V. Os níveis de ARNm de BCL2 e Myc foram medidas utilizando PCR em tempo real. pEtk, ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, Myc e níveis BCL2 foram medidos utilizando os anticorpos correspondentes através de um Western blot.
Estatísticas
A one-way ANOVA foi utilizada em combinação com um teste de Tukey para o par de comparação sábio. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados significativos.
Resultados
CTA095 como um inibidor duplo contra ETK e Src tirosina quinases
Através do rastreio de uma 9.600-diversidade pequena molécula fase de solução combinatória biblioteca, bateu compostos com atividades inibitórias contra ETK foram descobertos. Subsequentes estudos de actividade-estrutura de relacionamento levou à identificação de CTA095 (Figura 1A). Em comparação com outros compostos de TC com uma estrutura de núcleo de três anéis fundido idêntico ao CTA095, CTA095 mostrou inibição significativa ETK (Figura 1B). Curiosamente, havia uma forte correlação entre a inibição e inibição do crescimento ETK PC3 (Figura 1C). Estes dados sugerem que ETK pode ser o alvo responsável pela inibição do crescimento observada para células PC3.
estrutura química de CTA095 (A), a identificação de CTA095 como um potente inibidor ETK (B) e a sua citotoxicidade para as células PC3 (C). Para a inibição ETK, purificada ETK (20 nM), os compostos correspondentes (1 uM), e o substrato péptido (YIYGSFK) foram incubadas com
33P-ATP numa reacção de quinase. O produto resultante foi analisado numa placa de TLC. Para a inibição de crescimento, as células PC3 foram semeadas a 5000 células /poço em placas de 96 poços durante a noite e tratadas com os compostos correspondentes (10 uM) A viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio MTT após 72 h. Colunas, quer dizer; bares, desvio padrão, n = 3.
Depois de ter isolado uma pequena molécula que inibe ETK, o próximo passo lógico foi determinar a sua especificidade para esta enzima. Para conseguir isso, purificada ETK, Btk, Src e Yes foram incubadas num tampão de reacção de cinase com CTA095 (0-1? M) na presença de
33P-ATP marcado e um péptido (YIYGSFK), mostrou previamente ser um excelente substrato para ambas as cinases da família Src e BTK. A actividade de cinase foi medida utilizando a técnica de TLC. Este estudo revelou que CTA095 era um inibidor potente para ETK, com um IC
50 de aproximadamente 60 nM (Figura 2A). A inibição foi observada de um modo dependente da concentração. Além disso, poderia também inibir CTA095 Src (IC
50 ≈ 120 nM). No entanto, a Btk e Yes eram significativamente mais resistentes à inibição CTA095 com IC
50 maior do que 10 uM (Figura 2A, Figura S2).
A potência de CTA095 para ETK, Src, Btk e Sim foi medido utilizando TLC (a) para identificar substrato péptido
33P-fosforilado. TK purificado (20 nM), CTA095 (0, 0,2, e 1 uM), e o substrato péptido (YIYGSFK) foram incubadas com
33P-ATP numa reacção de quinase. O produto resultante foi analisado numa placa de TLC. O efeito de CTA095 para ETK autofosforilação (B) foi adicionalmente examinada por incubação de ETK com CTA095 nas concentrações indicadas, na presença de
33P-ATP, a radioactividade foi medida de ETK usando filme radiossensíveis. A intensidade da mancha radioactiva foi medida usando densitómetro. Colunas, quer dizer; barras, desvio padrão, n = 3.
A família Btk de tirosina-quinases não receptoras é caracterizado pela presença de um sítio dentro da autofosforilação do domínio não catalítico de homologia de Src 3 (SH3). Assim, é também importante para determinar a capacidade de inibir a CTA095 ETK autofosforilação. Portanto, um
in vitro
ensaio autofosforilação ETK foi criada em que purificado ETK foi misturado com CTA095 na presença de
33P-ATP. Após 30 min, a reacção foi terminada, e as amostras foram carregadas num gel de SDS-poliacrilamida para electroforese. Após a secagem, o gel foi analisado com um phosphorimager. A Figura 2B mostra que CTA095 foi capaz de inibir a autofosforilação ETK de um modo dependente da concentração.
Além das tirosina-cinases da família da Btk, a actividade inibidora de CTA095 para outras cinases Lyn, incluindo, Axl, Mer, EGFR, e Abl, foi investigada utilizando um ensaio de TLC. Como mostrado na Tabela 1, CTA095 parece ter uma forte reactividade para ETK e Src, muito mais elevada do que a de qualquer outras quinases testadas.
CTA095 inibe ETK através da ligação da sua região de ligação ao ATP
para explorar o suposto mecanismo responsável pela inibição ETK por CTA095, foram realizadas de atracação e de dinâmica molecular estudos. Estes estudos prevêem que CTA095 interage com o back-pocket da região de ligação do ATP. Esta bolsa de ligação é formado pelos resíduos no laço rico Glicina, T489 ‘gatekeeper’, e a região de charneira (Figura 3A). O
3 grupo R de CTA095 interage com a molécula gatekeeper Thr489, e também estabiliza o motivo de Phe555 DFG numa posição inactiva “para fora” (Figura 3B). Além disso, o núcleo de três anéis de o composto interage com a Cys496, que é único para o ETK. Apenas 8 quinases fora dos 491 cinases que foram analisadas em um estudo anterior [29], [30] mostram treonina e cisteína a essas posições. Assim, a interação do CTA095 tanto com Thr489 e Cys496 podem fornecê-lo com seletividade única quinase. Nós também utilizado para predizer ligplot + ligações de hidrogénio e /ou interacções hidrofóbicas na bolsa de ligação, e os nossos resultados mostraram que múltiplas interacções hidrofóbicas são responsáveis pela ligação CTA095-ETK (Figura S3A e S3B). As cadeias laterais que putativamente interagem com CTA095 são mostrados na Figura S3C. Análise da dinâmica trajectórias moleculares também mostram que o
3 grupo R e o núcleo de três anéis interagir fortemente e de forma estável com as cadeias laterais da bolsa de ligação, ao passo que R
1 e parte da I
2 são solvente exposta, e pode servir como alvos para melhoria da ligação CTA095 e especificidade (filme S1).
(a) vista Superfície ETK encaixado para CTA095 depois de 20 ns de MD minimização e relaxamento. R
3 e o núcleo de três anéis ancorado mais profunda entre a região rica em glicina loop (ciano) e região dobradiça (laranja), R
1 e R
2 são solventes exposta. Azul: Hélice C; Vermelho: A ativação Loop; Verde: Motivo DFG (554-556); Cyan: laço Glycine-rich; Laranja; Região da dobradiça. representação (B) dos desenhos animados que mostra as interações previstos de CTA095 com o gatekeeper Thr489, DFG (554-556) motif e Cys496. CTA095 ligação estabiliza Phe555 na configuração “para fora”, e afeta o estado formação de ponte de sal activa entre Lys445 e Glu460. Azul: Hélice C; Vermelho: A ativação Loop; Verde: Motivo DFG (554-556); Cyan: laço Glycine-rich; Laranja; Região da dobradiça. Números foram gerados usando PyMOL.
Ao contrário de ligação ETK-CTA095, Src quinase mostra a encadernação com CTA095 no bolso sítio ativo formado pela N-lobo, C-lobo eo loop de ativação. CTA095 na sua posição ancorada abrange os resíduos Asp404 e Asn 391, que são ambos importantes para Mg
2 + e ligação de ATP. CTA095 também interage com o resíduo putativamente Tyr416 funcionalmente importante, que faz parte da região da ansa de activação (Figura S4). No geral, acreditamos que bloqueia CTA095 do ATP de bolso na Src quinase vinculativo, e inibe a ligação de ATP em ETK através da indução de alterações conformacionais através do back-bolso.
CTA095 inibe a fosforilação da ETK, Src e os sinais de Stat3 jusante e Akt em células de cancro da próstata
A actividade inibidora de CTA095 contra a fosforilação de ETK em células intactas foi analisada por Western blot. ETK, bem como a fosforilação de Src em PC3-ETK (células PC3 transfectadas estavelmente com ETK), as células foram significativamente inibida a 5 uM e 10 uM. A inibição de Src é susceptível de resultar tanto a inibição directa por CTA095, bem como a actividade diminuída ETK, que activa Src. Um alvo seletivo para ETK e Src é STAT3, cuja fosforilação também é inibida por CTA095. Akt é outro efector a jusante de ETK importante, e a sua fosforilação foi inibida por CTA095 (Figura 4).
As células foram cultivadas em placa de 10 mm a 50% de confluência e tratadas com CTA095. As células foram colhidas após 24 h. pEtk, ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, pAkt e os níveis de Akt foram medidos utilizando os anticorpos correspondentes por Western Blot. Uma de três experiências semelhantes representado.
CTA095 preferencialmente inibe o crescimento de células prostáticas malignas
Para determinar o efeito sobre a proliferação de CTA095, um painel de linhas celulares de cancro incluindo LNCAP, CWR22Rv1 , PC3 e o de células normais da próstata RWPE1 foram incubadas com CTA095 e a sua proliferação foi medida usando o ensaio MTT. CTA095 foi eficaz na inibição do crescimento de células de cancro da próstata (LNCAP, CWR22Rv1 e PC3), enquanto que o de células de próstata normais imortalizadas RWPE1 era mais resistente a CTA095 (Figura 5), provavelmente devido ao “dependência” ao sinal ETK por células de cancro da próstata , como mostrado anteriormente [11].
as células foram semeadas a 5000 células /poço em placas de 96 poços durante a noite e tratou-se com CTA095 nas concentrações indicadas. A viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio MTT após 72 h. pontos, quer dizer; bares, desvio padrão, n = 3.
CTA095 induz a autofagia em células de câncer de próstata
Anteriormente mostramos que o AZD0530 inibidor de Src induz a autofagia em células de câncer de próstata, o que contribui para a apoptose resistência e diminui a eficácia do inibidor de Src [16]. Para determinar se CTA095 pode desencadear autofagia, as células PC3 transfectadas estavelmente com GFP-LC3 foram tratados com CTA095, em seguida, examinadas sob microscopia de fluorescência. Após 24 h de tratamento com CTA095, estas células produziram grande morfologia “pontos lacrimais” autophagosome distinto, enquanto o tratamento com veículo não (Figura 6A). A capacidade de CTA095 para induzir autofagia em células PC3 foi ainda confirmada pela conversão de endógena LC3-I para formas (Figura 6B) II-LC3. Assim, como o inibidor da tirosina-quinase Src, a inibição da ETK também induz autofagia.
As células foram cultivadas em placas de 6 poços a 50% de confluência e tratadas com CTA095. Autophagy foi visualizado por GFP-LC3 “pontos lacrimais” (A) e imunotransferência de isoformas endógena LC3 (B). Todos os experimentos foram realizados 24 horas após o tratamento.
CTA095 induz a apoptose em células de cancro da próstata
Para determinar se a inibição do crescimento induzida por CTA095 em células PC3 foi devido a apoptose, o fluxo a análise de citometria foi realizada. A seguir ao tratamento com CTA095 durante 24 h, uma acumulação dependente da dose de um “sub-G1” fracção foi observado utilizando a coloração de PI (Figura 7A). Os dados com base na reactividade de anexina-V também indicaram um aumento, dependente da dose da apoptose de células PC3, após tratamento com CTA095 (Figura 7B). Outras investigações indicaram que o tratamento de células PC3 com CTA095 resultou em uma activação, dependente da dose de caspase3 /7 (Figura 7C) e caspase 9 (Figura 7D). Assim, em contraste com o AZD05350 inibidor de Src, este inibidor ETK induz um nível significativo de apoptose, apesar da sua estimulação da via autofagia. Mais interessante, células 293 (ETK negativo) são resistentes a induzir a apoptose por CTA095, indicando a especificidade deste composto para ETK (Figura S5). Como será discutido posteriormente, ETK controla directamente a via de sobrevivência, a ausência de que, aparentemente, pode substituir o efeito protetor da autofagia. Como resultado, CTA095 apoptose induzida pode ser ainda melhorada pelo bloqueio autofagia (ver abaixo).
células PC3 foram semeadas a 10
6 células /ml (2 ml) em uma placa de 6 poços durante a noite e, em seguida, tratada com CTA095 nas concentrações indicadas, durante 24 h. a paragem do ciclo celular foi analisada utilizando a coloração de PI (A). A apoptose foi analisada utilizando o kit de detecção de apoptose FITC anexina-V (B). Caspase 9 activação foi medida utilizando Western blot (D). Para a actividade da caspase 3/7, as células PC3 foram semeadas a 5000 células /poço em placa de 96 poços durante a noite e tratados com CTA095 a 0-10 ^ M durante 24 h. actividades de caspase-3/7 foram medidas usando o Caspase-3/7 kit Apo-ONE Homogeneous Assay (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. Colunas, quer dizer; bares, desvio padrão, n = 3. 5 mM e 10 mM são significativamente diferentes de 0 mM (*, P 0,05, ANOVA one-way com teste de Tukey para comparação par sábio)
CTA095. inibe a formação de tubos HUVEC celular e migração de células de cancro da próstata
ETK é altamente expresso em células endoteliais e mostrado para ser envolvido na angiogénese [31]. Para investigar a capacidade de CTA095 para inibir a angiogénese, foi examinada a formação de tubo vascular das células endoteliais HUVEC após o tratamento com CTA095. Como esperado, a formação do tubo de células HUVEC foi interrompida por CTA095 (Figura 8A). “Cicatrização de feridas” para explorar a capacidade de CTA095 para inibir a migração de células, de células PC3 foi medida após tratamento com CTA095. “Cicatrização de feridas”, como mostrado na Figura 8B, as células de PC3 foi grandemente inibida por CTA095 após 48 h. Estes resultados sugerem que CTA095 tem a capacidade não só para suprimir o crescimento de células de cancro da próstata, mas também para reduzir a angiogénese.
Inibição da formação de tubo vascular das células endoteliais HUVEC (A) e inibição da migração de (a cicatrização de feridas) de células cancerosas humanas da próstata PC3 (B) por CTA095. células HUVEC (A) foram as sementes em mitrogel e tratou-se com CTA095 (0 e 5 | iM) durante 6 h. formação de tubo vascular foi visualizada utilizando microscopia. (B) As células PC3 foram cultivadas em placa de 6 poços a 60% de confluência. Em seguida, as feridas foram feitas e tratadas com CTA095 (0 e 5 ^ M). A migração celular (cicatrização de feridas) foi visualizado sob o microscópio nos horários indicados.
CTA095 como um quimio-sensibilizador
Nossos estudos iniciais indicaram que CTA095 tem boa citotoxicidade em direção a um painel de próstata células cancerosas. Para examinar se ETK e Src inibidor duplo funciona eficazmente como um sensibilizador de quimioterapia, as células PC3 foram co-tratados com paclitaxel e CTA095 (PTX) (2 ng /ml), ou o inibidor de cloroquina autofagia (CQ) (10 uM). A inibição do crescimento foi determinada utilizando um ensaio MTT após 72 h. Curiosamente, foi observado um efeito sinérgico da CTA095 com PTX ou CQ a células de cancro da próstata (Figura 9). Isto sugere que CTA095 é um sensibilizador de quimioterapia, e bloqueio da autofagia por CQ promove CTA095 induzida morte celular.
Inibição do Crescimento de CTA095 e em combinação com 10 | iM de cloroquina (CQ), ou 2 ng /ml de paclitaxel (PTX ) para PC3 células cancerosas humanas da próstata. As células foram semeadas a 5000 células /poço em placas de 96 poços durante a noite e pré-tratados com os correspondentes co-tratamentos durante 1 h, em seguida, tratadas com 2,5 uM CTA095. A viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio MTT após 72 h. Colunas, quer dizer; bares, desvio padrão, n = 3.
CTA095nano inibe o crescimento de tumores PC3 xenoenxerto in vivo
Dada a
in vitro
atividade de CTA095 contra as células cancerosas da próstata, é importante para validar esses resultados
in vivo
. Desde CTA095 é altamente insolúvel em água, formulamos CTA095 em micelas nano. Este micela foi desenvolvido no nosso laboratório e tem sido utilizado com sucesso para formular fármacos hidrofóbicos tais como o paclitaxel e a vincristina, [33] [32]. Como mostrado na Figura 10, CTA095nano impediu significativamente o crescimento do tumor de xenoenxerto de PC3 a 10 mg /kg (duas vezes por semana, a injecção intra-venosa) sem toxicidade significativa.
(CAT095 formulado em nano-micelas.) 2 × 10 células
6 PC3 foram injectados por via subcutânea a ratinhos nus. Colunas, quer dizer; Colunas, quer dizer; Colunas, quer dizer;