Abstract

Introdução

A hereditariedade é estimada em causa pelo menos 20% de câncer colorretal. O hereditário sem polipose subconjunto câncer colorretal é dividido em síndrome de Lynch e familiar tipo de câncer colorretal X (FCCTX) com base na presença de defeitos de genes de reparo mismatch (MMR).

Purpose

Nós abordou a expressão do gene assinaturas em câncer colorretal ligada à síndrome de Lynch e FCCTX com o objetivo de identificar genes candidatos e para mapear as vias relevantes na carcinogênese colorretal hereditário sinalização.

o delineamento experimental

a 18 k todo o genoma c- emparelhamento mediada por DNA, a selecção, a extensão e ligação (WG-DASL) ensaio foi aplicado a 123 cancros colo-rectais, tumores, incluindo 39 e 37 síndrome de Lynch FCCTX tumores. genes alvo foram tecnicamente validado utilizando em tempo real RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) ea assinatura de expressão foi validado em conjuntos de dados independentes.

Resultados

cânceres colorretais ligada à síndrome de Lynch e FCCTX mostrou perfis de expressão gênica distintos, que por meio de análise de significância de microarrays (SAM) diferiram em 2188 genes. vias funcionais envolvidos foram relacionadas com a proteína G acoplado a sinalização do receptor, fosforilação oxidativa, e a função do ciclo celular e a mitose. qRT-PCR verificada expressão alterada dos genes selecionados

NDUFA9, AXIN2, MYC, DNA2

e

H2AFZ

. Aplicação da assinatura 2188-gene a conjuntos de dados independentes mostraram forte correlação com o estado MMR.

Conclusão

perfis genéticos distintos e desregulamentação dos diferentes vias canónicas aplicam-se a síndrome de Lynch e FCCTX e metas fundamentais contidos neste documento podem ser relevante para prosseguir para as estratégias de diagnóstico e terapêutica refinados em câncer colorretal hereditário

Citation:. Dominguez-Valentin M, Therkildsen C, Veerla S, Jönsson M, Bernstein I, Borg Å, et al. (2013) distintas assinaturas Expressão Gênica em Síndrome de Lynch e Familial Colorectal Cancer Tipo X. PLoS ONE 8 (8): e71755. doi: 10.1371 /journal.pone.0071755

editor: Ramon Andrade de Mello, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Portugal |

Recebido: 29 Abril, 2013; Aceito: 02 de julho de 2013; Publicação: 12 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Dominguez-Valentin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. The Danish e os fundos do cancro do sueco, do Conselho Sueco de Pesquisas, a Fundação Lundbeck, o Fundo Cancer Nilsson, o Fundo Cancer Kamprad e do Hospital Universitário Hvidovre, Dinamarca. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a hereditariedade é um fator de risco para câncer colorretal. Identificação de indivíduos e famílias em risco aumentado permite a vigilância orientada, que tem sido mostrado para reduzir a morbidade e mortalidade por câncer colorretal [1], [2]. câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC) é responsável por 3-6% de câncer colorretal. A síndrome é clinicamente classificados de acordo com os critérios de Amesterdão, que exigem pelo menos três tipos de câncer associados a HNPCC, dois parentes de primeiro grau afetados e pelo menos um indivíduo diagnosticado antes dos 50 anos [3], [4]. Entre um terço e metade das famílias que preenchem os critérios Amsterdam realizar germinal reparação incompatibilidade (MMR) mutações genéticas em

MLH1, MSH2, MSH6

ou

PMS2

e são referidos como tendo Lynch síndrome [5] – [7]. As famílias restantes com um fundo genético ainda não identificado mostram uma predominância de câncer colorretal, pólipos adenomatosos síncronas e metacrônicos frequentes e alguns tumores extra e são referidos como familial colorectal tipo de câncer X (FCCTX) [8], [9]. Em comparação com síndrome de Lynch, câncer colorretal ligados à FCCTX desenvolver mais tarde, ocorrem predominantemente no cólon distal e menos muitas vezes mostram as características morfológicas linfócitos infiltrantes tumorais distintos, pobre diferenciação e mucina característica produção de tumores síndrome de Lynch [8], [10], [11].

os dados sobre os recursos genéticos e os caminhos tumorigênicos de FCCTX são escassos, embora estudos genômicos têm demonstrado alterações número médio de 6-8 cópias com ganhos recorrentes de 7P, 7q, 8q, 13q, 20p e 20q e perdas de 17p, 18p e 18q [9], [12], [13]. Dois estudos têm abordado perfis de expressão de genes e padrões de mutação em tumores FCCTX e descreveram semelhanças entre FCCTX e tumores esporádicos MMR estáveis ​​[14], [15]. No cancro colorectal esporádica, tumores defeituosos MMR mostram perfis de expressão de genes distintas, com a regulação positiva de genes imunomoduladores, tais como acompanhantes, citocinas e mediadores citotóxicos, os genes de choque térmico, de histocompatibilidade principal genes do complexo e genes relacionados com apoptose [16] – [18] . Nós aplicamos expressão gênica global de perfil, a fim de delinear genes candidatos e envolvimento diferencial de vias dentro do subconjunto HNPCC de câncer colorretal hereditário com a comparação entre o cancro colorectal ligada à síndrome de Lynch e FCCTX.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O projeto foi eticamente revisto em Copenhague, onde foi concedida uma dispensa para recolha de tecidos e dados clínicos. Todos os pacientes forneceram um consentimento informado para inclusão no registo HNPCC dinamarquesa durante as sessões de aconselhamento genético. A aprovação ética para o estudo foi concedido pelo Comité Científico e ética no The Capital Região de Copenhaga, Dinamarca (HD-2.007-0.032).

Seleção de Amostras e RNA Extração

O HNPCC nacional dinamarquesa registro foi usado para identificar cânceres colorretais de indivíduos com síndrome de Lynch e FCCTX. síndrome de Lynch foi definida como famílias /indivíduos com mutações no gene da linha germinativa MMR-predisponentes doença (n = 16 no

MLH1

, n = 13 em

MSH2 Comprar e n = 10 no

MSH6

). a coloração imuno-histoquímica da proteína RMM e análise da instabilidade microssatélite (MSI) foram realizados como previamente descrito [11], [13]. tumores FCCTX foram definidos como tumores que se desenvolveram em famílias que preenchem os critérios Amesterdão, mas não mostrou mutações genéticas MMR-predispondo a doença, que conservaram a função MMR. cânceres colorretais esporádicos foram selecionados para representar MMR tumores proficientes deficientes e MMR de indivíduos sem história familiar de câncer. Os dados clínicos encontram-se resumidos na Tabela 1. Em comparação com tumores síndrome de Lynch, tumores FCCTX foram mais frequentemente localizados no lado esquerdo do cólon (p 0,00001, teste exacto Fishers) e mostrou diferenciação alta ou moderada (p 0,00001, teste exacto Fishers ). síndrome de Lynch e FCCTX não diferem no que se refere a idade de início (média de 53 anos versus 58 anos) ou o estágio do tumor.

áreas de tumor não-necróticas foram extração de macro-dissecados e RNA foi realizada a partir de três 5 –

μ

m seções de tecido embebido em parafina tumor [11], [13] utilizando o Pure Kit RNA parafina alta (Roche, Castle Hill, Austrália) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) e obtendo-se amostras de ARN suficiente (200 ng) com rácios 260/280 . 1.8 foram seleccionados

Gene Expression Profiling

análises de expressão de genes foram realizados no Genomics Center SCIBLU, Universidade de Lund, na Suécia. O sistema de grânulo Ilumina-matriz (HumanWG-6 V4 Expressão Beadchip, Ilumina) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o ARN total foi convertido em cDNA utilizando oligo-dT biotinilado

18 e nonâmero aleatório iniciadores. Dois oligonucleótidos específicos para ensaio foram concebidos para interrogar uma única sequência de 50 nt contígua em cada ADNc. Cada um destes oligonucleótidos consistia de duas partes: um oligonucleótido específico para o montante (OSU) contendo uma “sequência específica para o gene e um 5 ‘3 sequência de iniciador de PCR universal (P1), enquanto que o oligonucleótido específico para jusante (DSO) continha um 5’ -gene específico da sequência e uma “sequência diferente universal iniciador de PCR 3 (P2). Utilizando esta abordagem, um total de 24,526 oligonucleotídicos pares (sondas) foram concebidos e reunidas, que em conjunto constituem todo o genoma (WG) piscina ensaio DASL (DAP), o que corresponde a 18,626 genes únicos, com base no conteúdo bem anotada derivado do National center for Biotechnology Information (NCBI) Banco de dados Seqüência de Referência (Build 36.2, Release 22). A DAP foi então hibridado com os ADNc-alvo, seguido de passos de extensão e ligação enzimática, tal como previamente descrito [19]. produtos ligados foram amplificados por PCR e marcadas com um iniciador universal acoplado Cy3, após o que os produtos em cadeia simples marcado foram precipitadas e hibridado com WG BeadChips de expressão de genes, como previamente descrito [20]. BeadChips foram então digitalizados em um ™ Leitor BeadArray usando software BeadScan (v4.2), durante o qual intensidades de fluorescência foi lida e imagens extraídas.

Análise de Dados

Os dados de expressão foram carregados e processados ​​no software GenomeStudio (Illumina, San Diego, CA). Os dados foram normalizados utilizando correção de fundo, o método de ajuste cúbico [21] e dimensionamento placa. características RefSeq com uma detecção

P

valor de ≤0.01 em, pelo menos, 80% das amostras foram usadas, deixando 9,218 características para posterior análise. Os dados foram enviados para MeV v4 [22] onde foram LOG2 transformado e mediana centrado em toda ensaios. agrupamento sem supervisão foi realizada no conjunto total de amostras de CRC usando agrupamento média ligação com uma correlação de Pearson como métrica de similaridade. análise da significância dos microarrays (SAM) [23] foi utilizada para identificar genes diferencialmente expressos significativamente com uma taxa de falso-descoberta (FDR)

≤

5% [24]. dados de expressão de genes estão disponíveis no Gene Expression Omnibus NCBI (GEO) (número de acesso GSE36335). caminhos biológicos foram identificados usando o software DAVID baseado na web com um FDR

≤

5% [25].

Tempo real quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR)

qRT-PCR foi utilizado para validar tecnicamente aumento /diminuição da expressão de genes relacionados com o cancro 5-com expressão diferencial entre os 4 subconjuntos de cancro colorrectal. Os genes foram seleccionadas para representar vias desreguladas e os níveis de expressão principal foram investigados em 3 amostras de cada subtipo.

rRNA18S

foi usado como gene de referência interna e amostra de cólon normal, como um calibrador. iniciadores específicos de gene e conjuntos de sondas TaqMan para cada gene foram obtidos de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Transcrição reversa e PCR foi realizada utilizando Quantitect reverter kit transcrição e sonda kit PCR, respectivamente (Qiagen, Heidelberg, Alemanha).

Validação em dados externos

A assinatura expressão genética hereditária foi validado usando o dados GSE4554 definidos e os quatro maiores lotes de The Cancer Genome Atlas Network (TCGA) RNAseqv2 [26], [27]. A fim de se parecer com dados de microarranjos, os valores RPKM do TCGA foram quantil-normalizado, um deslocamento de 32 foi adicionado, limitado a 65.000, e os genes foram centradas. Subsequentemente, os dados foram ajustados para a variável lote. Todos os dados foram importados para MeV v4, LOG2 transformado, genes foram mediana centrada em todo ensaios e os 50% de genes menos variáveis ​​foram removidos. agrupamento hierárquico não supervisionada foi realizada como descrito acima. Um centróide a expressão do gene foi construído pela média dos valores das amostras em síndrome de Lynch e FCCTX para cada gene de expressão, de modo a estabelecer uma assinatura para mais próximo classificador classificação centróide. Uma amostra a partir de conjuntos de dados externos foi atribuído a qualquer um dos dois subconjuntos hereditárias com base no máximo de correlação de Pearson de sua expressão centróide para os valores centróide hereditárias.

Análise estatística

associação clínica (localização tumoral , a diferenciação, a idade de início e estágio) na síndrome de Lynch e FCCTX foram determinadas usando o teste exato de Fisher (com significado definido para

P Art 0,05). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software de estatística IBM SPSS Statistics 20 (SPSS, Chicago, IL, EUA).

Resultados

A análise de agrupamento hierárquico não supervisionado em toda a série (incluindo 39 síndrome de Lynch tumores, 37 FCCTX tumores, 21 tumores proficientes MMR esporádicos e 26 tumores deficientes MMR esporádicas) identificou dois subgrupos principais relacionadas ao estado MMR (Figura S1). A assinatura MMR intrínseca era forte com 3873 genes diferencialmente expressos, dos quais 2.159 (56%) eram sobre-regulada nos tumores defeituosos MMR e estavam relacionados com 5 vias de sinalização (Tabela S1).

Na tumor hereditária subconjunto, análise SAM 2188 identificou genes diferencialmente expressos entre tumores e FCCTX síndrome de Lynch (Figura 1). Nos tumores FCCTX, a via de sinalização da proteína G acoplada foi regulada (FDR = 0,6%), enquanto os tumores síndrome de Lynch mostrou-regulação de 2 vias relacionadas ao ciclo celular e mitose (FDR = 1,4%) e fosforilação oxidativa (FDR = 3,5%) (Tabela 2).

a figura ilustra o topo de 360 ​​genes expressos diferencialmente. As amostras estão dispostas ao longo eixo X e mostra tumores FCCTX (verde) e tumores síndrome de Lynch (azul).

Os perfis de expressão de genes de tumores FCCTX estavam intimamente relacionadas com aquelas em MMR esporádica cancros colo proficiente com genes envolvidos na modificação de ácido peptidil-amino, ligado a enzima de sinalização da proteína receptor e regulação do crescimento. Da mesma forma, a síndrome de Lynch e tumores esporádicos defeituosos MMR genes envolvidos na progressão do ciclo celular e resposta imune partilhada. Comparação entre FCCTX e tumores proficientes MMR esporádicos reveladas 4 genes diferencialmente expressos, enquanto comparação entre FCCTX e tumores deficientes MMR esporádicos identificados 3.906 genes diferencialmente expressos. tumores síndrome de Lynch diferiam dos tumores estáveis ​​MMR esporádicos de 415 genes diferencialmente expressos e de tumores deficientes MMR esporádicos por 91 genes. Dentre os tumores esporádicos, 1384 genes diferiram tumores proficientes e deficientes MMR.

Os perfis genéticos foram validadas em conjuntos de dados independentes, ou seja, o GSE4554 (Affymetrix microarrays) eo TCGA (RNA sequenciamento) [26], [27]. Ambos os conjuntos de dados compreendem principalmente casos colorretal esporádico, incluindo 51 tumores estáveis ​​MMR e 33 MMR tumores com defeito no conjunto de dados GSE4554 e 91 MMR estável, 19 tumores estáveis ​​defeituosos e 28 MMR-baixos MMR no conjunto de dados TCGA. agrupamento hierárquico não supervisionado com base em nossa assinatura 2188 gene identificado por nós, resultou em dois grandes grupos relacionados ao estado do MMR. A assinatura hereditária classificadas correctamente 82% e 80% dos tumores estáveis ​​MMR como FCCTX e 100% e 94% dos tumores defeituosos MMR como síndrome de Lynch, respectivamente (Figura 2).

a) Agrupamento baseado em GSE4554 e b) Clustering com base nos quatro maiores lotes dos conjuntos de dados TCGA RNAseqv2. tumores MMR proficientes (verde), tumores microssatélites de baixa (azul) e tumores deficientes MMR (vermelho) ao longo do eixo-x.

validação técnica baseada em qRT-PCR foi realizada utilizando 5 câncer relacionado ao os genes que representam as vias desreguladas em tumores observados estáveis ​​e deficientes MMR, respectivamente (Figura 3). O aumento da expressão resultados confirmado

MYC

e

AXIN2

em tumores FCCTX, diminuição da expressão de

NDUFA9

em tumores FCCTX e em tumores proficientes MMR esporádicos e aumento da expressão de

H2AFZ

em tumores deficientes MMR. Não foram observadas diferenças significativas para a

DNA2

.

A expressão diferencial de

MYC, NDUFA9

,

H2AFZ

,

AXIN2

e

DNA2

foi feito por 12 amostras representativas (3 de cada grupo) e os rácios de qRT-PCR foram normalizados para rRNA18S e mediana centrado.

Discussão

Dentro do HNPCC subconjunto de câncer colorretal hereditário, demonstramos distintamente diferentes assinaturas de expressão gênica em FCCTX e Lynch tumores síndrome, que diferem por 2188 genes. Com base nessas diferenças de expressão gênica, nossos dados sugerem que o status MMR influencia fortemente assinaturas genéticas, também dentro das famílias fenotipicamente semelhantes, o que está de acordo com estudos anteriores sobre o câncer colorretal esporádico [16] – [18], [27], [36] . Os perfis síndrome FCCTX e Lynch diferiam em 3 principais vias relacionadas ao câncer, principalmente relacionados ao ciclo celular andmitosis progressão, fosforilação oxidativa e sinalização do receptor acoplado à proteína G, que foram correlacionados com carcinogênese colorretal [18], [28], [29] , [36].

os tumores FCCTX mostrou-regulação de 1059 genes, muitos dos quais (n = 16) foram relacionados à via receptor acoplado à proteína G (Tabela 2). Um alvo candidato no presente documento inclui o

gene GNAS

, que codifica para o G

α-subunidade, e está localizado na região de 20q13.32 que foi encontrado para ser adquirida com tumores FCCTX [9], [12], [13]. As mutações de activação

GNAS

foram descritos no CRC e são sugeridos para promover a tumorigénese através da activação da ERK1 /2 MAPK vias de sinalização Wnt [28] e [29]. O potencial mecanismo tumorigênico é desconhecida e a mutação de ponto quente

GNAS

c.601G T não foi observado em tumores FCCTX [12]. Também outros genes candidatos envolvidos na proliferação e a migração, por exemplo,

CDH26, SRC

e

ASIP

estão localizados em 20q [30], [31]. Os tumores FCCTX também mostraram a sobre-regulação de

PTGER1,

que codifica para o receptor EP1 que podem promover a proliferação e desenvolvimento de tumor colo-rectal através da função alterada de prostaglandina E2 (PGE

2) [32] – [34 ].

tumores síndrome de Lynch mostrou-regulação de genes de 1129, por exemplo, genes envolvidos no G

1 /S de transição (

CCNE

,

CCNH

,

E2F2

e

CDK2), replicação de DNA (

CDC45

,

RPA1

,

RFC5

,

MCM4

e

POLD3

) ea organização cromossômica e mitose (

CCNB2

,

MLF1IP

,

CASC5

,

KIF2C

e

PLK4

), que está em linha com achados anteriores (Tabela 2) [16], [18], [35], [36]. -Regulação de exemplo

Wee1

,

CDKN1A

e

FANCD2

também foram observados em nosso estudo e também foram relatados por outros investigadores, o que pode sugerir o envolvimento da maquinaria do ciclo celular checkpoint [37 ], [38]. A sobre-expressão de proteínas do checkpoint tenham sido previamente ligados ao síndroma de Lynch e revogação da máquina de ponto de verificação foi mostrado para sensibilizar células de tumor deficientes para com MMR quimioterapia [39], [40]. Além disso os genes envolvidos na via de fosforilação oxidativa, v.g. o ATP sintase genes das subunidades e complexo I e genes de subunidade III estavam entre os up-regulada em tumores síndrome de Lynch. Down-regulação da ATP genes sintase subnit e eu complexo, genes III e V foram correlacionados com cancro colorectal metastizado e podem explicar o desenvolvimento de tumores mais agressivos e mau prognóstico observado em tumores proficientes MMR [11], [18], [41] .

no cancro colorectal, estado MMR é um importante factor de discriminação relacionada com distintamente diferentes perfis de expressão genética, que é apoiado pelos 3873 genes diferencialmente expressos em nossa série de tumores deficientes e proficientes MMR [15], [16] , [27]. Observou-se a importância do estado MMR também quando nós aplicamos a assinatura 2188-gene que discriminou entre a síndrome de Lynch e FCCTX a dois conjuntos de dados independentes que contêm principalmente tumores esporádicos. A assinatura correctamente definida 80-82% da MMR proficiente e 94-100% dos tumores deficientes em MMR (Figura 2). Várias proteínas de choque térmico e genes da resposta imune (Tabela S1) foram regulados positivamente em tumores defeituosos MMR, o que apoia o envolvimento de mecanismos de resposta imunitária, independentemente de se o tumor foi causado pela linha germinal ou inativação do gene MMR somática [16] – [ ,,,0],18], [42], [43]. Em esporádicos, assim como tumores proficientes MMR hereditários vários genes no

Wnt

sinalização foram up-regulada, que se encaixa bem com o seu papel central na tumorigênese colorretal (Tabela S1) [44], [45].

Em conclusão, cancro colorectal hereditário dentro dos perfis genéticos HNPCC subconjunto mostram distict com 2188 genes diferencialmente expressos entre síndrome de Lynch e FCCTX. Estes dados identificar genes e caminhos relevantes para prosseguir para diagnóstico refinados e terapêutica no cancro colorectal hereditário.

Informações de Apoio

Figura S1.

agrupamento hierárquico não supervisionado de todo o conjunto de dados. O dendograma mostra a aglomeração espontânea de 123 cânceres colorretais em dois grandes grupos relacionados ao estado do MMR. tumores MMR proficientes (verde), incluindo tumores FCCTX e tumores proficientes MMR esporádicos e tumores deficientes MMR (azul), incluindo tumores síndrome de Lynch e tumores deficientes MMR esporádicos

doi: 10.1371. /journal.pone.0071755.s001

(TIF)

Tabela S1.

Vias de sinalização sobre-regulada em tumores deficientes proficientes e MMR MMR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071755.s002

(XLS)

Reconhecimentos

obrigado Eva Rambech e Martin Lauss, Departamento de Oncologia, Instituto de Ciências clínicas, Universidade de Lund e Anja Nissen, Centro de Pesquisa Clínica do Hospital Universitário de Copenhague, Hvidovre para obter ajuda e assistência técnica e Sabrina da Silva, do Departamento de Medicina e Oncologia, Sir Mortimer B , Davis-Jewish general Hospital, da Universidade McGill, em Montreal, Canadá para suporte estatístico.