Abstract

autofágica de morte celular ou autofagia abortiva foi proposta para eliminar danificado, bem como as células cancerosas, mas continua a haver uma lacuna crítica no o nosso conhecimento na forma como este processo é regulado. O objectivo deste estudo foi identificar moduladores da via de morte celular autophagic e elucidar os seus efeitos sobre a sinalização celular e a função. O resultado de nossas projeções biblioteca siRNA mostram que um complexo coatomer intacta I (COPI) é obrigatória para a autofagia produtivo. Esgotamento de COPI membros complexos diminuiu a sobrevivência celular e deficientes autofagia produtiva que precedeu estresse do retículo endoplasmático. Além disso, a autofagia abortiva provocada pela depleção COPI fator de crescimento significativamente alterada sinalização em várias linhas celulares de cancro. Finalmente, mostra-se que COPI membros do complexo são sobre-expressos em um conjunto de linhas celulares de cancro e vários tipos de tecidos de cancro, em comparação com linhas celulares normais ou tecidos. Em tecidos de câncer, a superexpressão de membros COPI está associada com mau prognóstico. Os nossos resultados demonstram que o complexo é essencial para coatomer autofagia produtivo e sobrevivência celular, e assim a inibição da COPI membros podem promover a morte celular das células cancerosas quando apoptose é comprometida

citação:. Claerhout S, Dutta B, W Bossuyt , Zhang F, Nguyen-Charles C, Dennison JB, et ai. (2012) abortiva Autophagy Induz Retículo endoplasmático stress e morte celular em células cancerosas. PLoS ONE 7 (6): e39400. doi: 10.1371 /journal.pone.0039400

editor: Gordon Langsley, Institut national de la santé et de la recherche médicale – Institut Cochin, França |

Recebido: 22 Março, 2011; Aceito: 21 de maio de 2012; Publicado: 26 de Junho, 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada em parte por doações da Fundação Komen (KG 081.694 e FAS0703849), a Prevenção do Câncer e Instituto de Pesquisa do Texas, e Fundo de Investigação do cancro do ovário para GBM, e pelo MD Anderson Cancer Center suporte Grant CA016672. SC é apoiado pelo Programa Odyssey eo Theodore N. Lei Endowment for realização científica da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center. JBD é suportado pelo programa de bolsas MD Anderson GlaxoSmithKline triunfo e BD pelo National Institutes of Health siRNA consórcio para a terapêutica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as células cancerosas encontrar vários obstáculos, tais como mudanças de pH e uma oferta restrita de nutrientes e oxigênio durante o início do câncer, progressão e disseminação [1]. Para restabelecer a função celular adequada e homeostase sob níveis baixos a moderados de stress, as células cancerosas activar processos celulares de proteção, como autofagia. Autophagy é um processo altamente conservado encontrado a partir de leveduras aos mamíferos. É um processo de degradação única, caracterizada por a fixação do citoplasma granel, incluindo as proteínas e organelas, que são entregues ao sistema lisossomal para a digestão final [2]. A remoção e degradação destes componentes celulares produz energia e os blocos de construção necessários para a sobrevivência das células cancerosas durante stress metabólico. A conclusão deste processo é designado autofagia produtivo ou fluxo autofágica [2]. No entanto, não produtiva, descontrolada, ou autofagia prolongada conduz ao que foi designado “morte celular autofágica” [3], [4] ou, como nos referimos a “autofagia abortiva” [5].

no cancro, tem sido proposto o processo de autofagia para contribuir tanto para a supressão do tumor e de progressão. Por um lado, autofagia suprime tumores limitando iniciação e progressão. A expressão de beclin 1, o homólogo de mamífero do gene de levedura Atg6 autofagia que é crítico para a indução de autofagia, é diminuída em muitos tecidos de cancro e linhas celulares de cancro [6]. Além disso, o gene de resistência à radiação ultravioleta-associado (

UVRAG

), necessário para a função supressora de tumores de beclin 1, é também monoallelically mutados em muitos cancros humanos [7]. Além disso, também suprime autofagia tumorigénese, fornecendo o ATP requerido para a reparação do ADN [8] ou através da eliminação da p62 de longa vida de proteínas [9]. Por outro lado, a autofagia pode promover a tumorigénese, superando a tensão provocada por falta de nutrientes e de oxigénio em tumores pré-invasivos e que crescem rapidamente. O nosso laboratório mostrou que a fosforilação dependente da via LKB1-AMPK de p27 na treonina 198 estabiliza p27 e permite que as células sobrevivam a retirada do factor de crescimento e stress metabólico através da indução de autofagia [10]. Esta resposta autophagic pode contribuir para a sobrevivência de células de tumor durante a-factor de crescimento ou privação de nutrientes interrompido e o metabolismo energético. Assim, dependendo do contexto celular e da força e duração dos sinais de estresse, a autofagia quer previne ou promove carcinogênese.

Além de seu papel na carcinogênese, autofagia também modula a eficácia de drogas terapêuticas. A indução de uma “produtivo” processo autophagic por quimioterapia e radiação permite a sobrevivência de células cancerosas [11]. Isto sugere que os moduladores autofagia pode sensibilizar células tumorais para terapias contra o câncer convencionais [11], [12]. Ao direccionar proteínas chave em autofagia produtiva, as células podem sofrer “autofagia abortiva”, um mecanismo alternativo para a morte de células cancerígenas resistentes a agentes indutores de apoptose [11], [13]. Embora o processo de autofagia produtiva tem sido estudado extensivamente, não está claro quais os fatores que regulam a autofagia abortiva. A identificação desses moduladores poderia melhorar a eficácia da terapia convencional e contribuir na descoberta de novos tratamentos para pacientes com câncer.

O objetivo deste estudo foi identificar os reguladores de autofagia abortiva e elucidar seu efeito sobre os mecanismos de sinalização e sobrevivência celular em células cancerosas. Utilizou-se ecrãs pequenos ARN interferente (siRNA) em combinação com a validação e estudos funcionais. Membros do complexo coatomer I (COPI), que estão envolvidos no tráfico de celular, surgiu como top hits de nossas telas de modulação autofagia e morte celular em células cancerosas. autofagia abortiva e estresse do retículo endoplasmático (ER) foi observada após knockdown de componentes COPI. Além disso, o esgotamento COPI afetados fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K) /AKT via de sinalização. No seu conjunto, os efeitos do COPI em morte celular, a autofagia e ER stress eram mais pronunciada em células de cancro do que em células normais. Isto é consistente com a sobre-expressão de proteínas e genes COPI visto em linhas celulares de cancro e amostras de pacientes.

Materiais e Métodos

Linhas de Células e Reagentes

A célula de cancro da mama humano linhas de células MDA-MB-231 [10], MDA-MB-468 [10], BT549 (American Type Culture Collection (ATCC); Manassas, VA), T47D [10], SKBR3 (ATCC), HCC1428 (ATCC) e MCF7 [10], as linhas celulares de cancro do ovário SKOV3 (ATCC), e OVCAR3 (ATCC) foram mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 5% de FBS. MDA-MB-231, MDA-MD468, e SKOV3 células estavelmente transfectadas com GFP-LC3 foram cultivadas no mesmo meio. A linha de células U2OS do osteossarcoma (ATCC) e U2OS GFP-LC3 [10] foram cultivadas em DMEM e FBS a 10%. MCF10A (ATCC) foram cultivadas em DMEM /F12 e soro de cavalo a 5% com 20 ng /mL de EGF, 0,5 mg /mL de hidrocortisona, a toxina da cólera 100 ng /ml, e 10 ug /ml de insulina. As linhas celulares estáveis ​​GFP-LC3 foram criadas tal como descrito em [10]. As linhas celulares foram validados por impressão digital de ADN utilizando o kit de STR AmpFℓSTR Identifiler de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems cat 4322288). Os perfis STR foram comparadas com as impressões digitais ATCC conhecidas (ATCC.org), para a linha celular de banco de dados autenticação integrada Molecular (CLIMA) versão 0.1.200808 [14] e ao banco de dados de impressões digitais MD Anderson. Imatinib, uma simpática oferta do Dr. S. Kondo no MD Anderson Cancer Center, e bafilomicina A1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram dissolvidos em DMSO. Brefeldin A (Sigma-Aldrich) e rapamicina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) foi dissolvido em metanol.

Telas siRNA

Accell siRNA tela de moduladores autofagia.

MDA-MB-231, células U2OS, e SKOV3 estavelmente transfectadas com GFP-LC3 foram semeadas em placas de 96 poços a 2500 células /poço para as células MDA-MB-231 e SKOV3 ou 1000 células /poço, para células U2OS. Após 24 h meio foi mudado para meio Accell contendo 0,05% de FBS (80 uL /​​poço) (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). SiRNAs Accell (L-201000 Humana ARNi global, Lote 08103, em placas de 96 poços) foram dissolvidos em 10 ul de tampão 1x siRNA e incubado num agitador à temperatura ambiente durante 30 min. meios Accell (200 ul) contendo 0,05% de FBS foi adicionado a cada poço e misturou-se pipetando cinco vezes. Os siRNAs dissolvidos (20 ul) foram adicionados a cada poço para fazer uma concentração final de 1 siARN uM (100 uL /​​poço). As células foram incubadas com ARNsi durante 48 h. As drogas foram diluídas até uma concentração de dez vezes de trabalho e adicionados a cada poço, como indicado (11 uL /​​poço) para perfazer concentrações finais de 2 mM-desoxi-D-glucose 2 (2DG), 100 nM de rapamicina, e 10 uM de imatinib. As células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 45 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas três vezes com PBS, núcleos corados com Hoechst 33342 durante 5 minutos e lavou-se uma vez com PBS, e 250 uL de PBS foram adicionados às células. formação Autophagosome foi determinada por um analisador de celular 1000 imagem celular e sistema de análise (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey). Os resultados são apresentados como% autofagia. Além disso, todos os genes que foram combinadas para o cálculo de Z-pontuação. Z-score do gene

i

foi calculado a partir de

z

i

= (

x

i Network –

μ

) /

σ

, onde,

x

i

é a autofagia% da tela de autofagia, e

μ

e

σ Quais são a média e desvios-padrão com base em todos os genes presentes na tela.

tela siRNA para moduladores de viabilidade.

Nós usamos uma biblioteca vestiu de 779 piscinas siRNA (https://www.dharmacon.com/product /Productlandingtemplate.aspx?id=225 tab=1 para a lista de gene) que cobre o kinome humana e genes relacionados quinase (biblioteca Dharmacon SmartPool, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) no MDA-MB-231, MDA-MB-468 , linhas de células SKOV3, e OVCAR3. Cada pool de siRNAs sintéticos foi dispostas no formato de 96 poços, e as transfecções foram realizadas em placas em triplicado, utilizando 25 nM de ARNsi entregue por DharmaFECT I (Dharmacon). Seis repetições de RISC-livre não-alvo siRNA e siRNA contra PLK (controle de tóxicos) em cada placa fornecida controlos negativos e positivos para a morte celular em toda a tela inteira, respectivamente. Resumidamente, DharmaFECT I foi aplicado em 0,15 ul /poço, para entrega de 25 nM de ARNsi no modo de transfecção inversa. Após três dias, a viabilidade celular foi ensaiada com uma célula azul Titer Ensaio de viabilidade celular (Promega, Madison, WI). Titer celular reagente azul (resazurina 5 uL /​​poço) foi incluído no último 3 h de incubação. As células viáveis ​​reduzem resazurina em resorufina, altamente fluorescente. A intensidade de fluorescência foi medida utilizando um leitor de microplacas a um comprimento de onda de excitação de 530 nm e um comprimento de onda de emissão de 604 nm. viés Interplate foi eliminado por normalizar valores de viabilidade celular por meio de centralização e redimensionado para ter igualdade de variância e, em seguida, convertidos para os correspondentes z-scores para cada uma das três experiências em replicado. O z-score do gene

‘i’

para replicar

‘j’ na placa

‘k’

foi calculada como

z

ij

= (

x

ij Restaurant –

μ

jk

) /

σ

jk

, onde,

x

ij

é o valor de intensidade crua, e

μ

jk

e

σ

jk Quais são a média e desvio padrão de intensidades para todas as amostras na placa

k

, respectivamente. Em seguida, a mediana z-score foi calculado ao longo de todas as repetições de cada gene em cada linha celular, e siRNAs com

z

i

av

valores inferiores a -2 foram considerados “hits como significativamente inibitórios “para a linha celular correspondente

a transfecção e siRNA Reagentes

siRNAs. (Dharmacon; Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) foram transfectadas com DharmaFECT I (Dharmacon) ou Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) usando protocolos dos fabricantes. As sequências dos siRNAs são como se segue: controlo RISC livre nontargeting siRNA (D-001220-01-05), COPA (L-011835-00), COPB1 (L-017940-01), COPB2 (L-019847-00 ), COPG1 (L-019138-00), COPG2 (L-019988-01), DPOC (L-013063-01), COPE (L-017632-01), COPZ1 (L-020293-01), PLK1 (M -003290-01), BIP1 (L-008198-00-0005), Atg5 (L-004374-00) e Atg12 (L-010212-00).

Transmission Electron Microscopy

amostras de células foram fixadas com uma solução contendo 3% de glutaraldeído mais 2% de paraformaldeído em tampão de cacodilato 0,1 M, pH 7,3, durante 1 h. Após a fixação, as amostras foram lavadas e tratadas com 0,1% de cacodilato Millipore-filtrada tamponada ácido tânico, pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1% tamponado durante 30 min, e coradas en bloc com acetato de uranilo 1% Millipore-filtrada. As amostras foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol, infiltraram, e incorporado em meio de LX-112. As amostras foram polimerizados num forno de 70 ° C durante 2 dias. Secções ultrafinas foram cortadas em micrótomo Leica Ultracut (Leica, Deerfield, IL), coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo em um stainer Leica EM, e examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão JEM 1010 (JEOL, EUA, Inc., Peabody, MA ) a uma voltagem de aceleração de 80 kV. As imagens digitais foram obtidas utilizando um sistema de imagem de AMT (Advanced Techniques Microscopia Corp, Danvers, MA).

de SDS-PAGE e Western Blot Análise

transferência de Western foi realizada como previamente descrito [12]. Foram utilizados os seguintes anticorpos: p62 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), LC3 (Novus Biologicals, Littleton, CO), IRE1α, bip, calnexin, Atg5, Atg12, pSer473AKT, pThr308AKT, AKT, pSer235 /236 S6, pSer65 4EBP , e 4EBP (todos da Cell Signaling Technology, Beverly, MA), COPB1 (Fisher Scientific, Lafayette, CO), e β-actina (Sigma-Aldrich). Os anticorpos contra COPA, COPB2, DPOC, COPG1 e COPG2 foram um presente amável do Dr. Wieland (Universidade de Heidelberg, Heidelberg, Alemanha). Quantificação da intensidade da banda foi realizada por software gel Un-Scan-It (versão 5.1, Silk Scientific Corporation) e expresso em termos de aumento para o dobro do controle.

confocal e microscopia de fluorescência

A microscopia confocal .

imunocoloração para LAMP2 (BD Biosciences; 1/200) ou COPB2 (1/1000) foi realizada utilizando procedimentos padrão. Para o ensaio de tfLC3, as células que expressam transitoriamente tfLC3 [15] foram crescidas durante a noite e tratou-se como descrito. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com 4′-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). Para Anexina-V-Alexa 568 coloração, as células que expressam de forma estável GFP-LC3 foram cultivadas em lâminas de câmaras oito poços (BD Biosciences) e tratados conforme indicado. Anexina-V-Alexa 568 coloração (Roche, Mannheim, Alemanha) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Todas as imagens foram tiradas em um microscópio Olympus FV1000 com uma lente 100X (N.A. 1,30). As imagens foram adquiridas e processadas utilizando o software Fluoview e ImageJ

A microscopia de fluorescência

imagens de imunofluorescência para p62 (BD Biosciences; 1/200).. Foram adquiridos utilizando um microscópio Nikon Eclipse TE200-E e software de imagem IPlab (BioVision Technologies, Exton, PA).

crystal Violet celular Viabilidade ensaio

ensaio de viabilidade (violeta de cristal) foi realizada utilizando procedimentos padrão.

clonogênica repique Assay

As células foram cultivadas sob várias condições e todas as células foram colhidas por tripsinização e foram plaqueadas a 100-400 células por poço em placas de seis poços de cultura de tecidos. As colónias foram cultivadas durante 11-14 dias em meio de crescimento completo e coradas com solução de violeta cristal a 0,5% (80% dH

2O, 20% de metanol, 0,5% de violeta de cristal). Fotos das colônias foram feitas usando sistema de imagem FluorChemE (Cell Biosciences, Inc.), e o número de colónias foi analisada utilizando Alphaview SA (versão 3.2.3.0; celular Biosciences, Inc.). O experimento foi realizado em triplicado e repetida duas vezes.

RPPA Análise

Os procedimentos RPPA para coloração de anticorpos e detecção de sinal foram realizados conforme descrito anteriormente [10], [16].

Oncomine Data base

o Bittner multicancer conjunto de dados está disponível no domínio público em https://www.oncomine.org/main/index.jsp [17] e, portanto, não era necessário que a aprovação IRB. Tecidos com expressão diferencial de COPI membros complexos (P≤10

-6) foram selecionados.

Estatística e Análise de Dados

Todos os dados foram analisados ​​utilizando o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA, EUA). As comparações entre os dois grupos foram avaliados estatisticamente por um teste t emparelhado de duas caudas. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para comparar os níveis de expressão de genes em grupos benignos e câncer, foi utilizado um teste t de Student de duas amostras. Utilizou-se o modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox para análise de sobrevida univariada. Interrupções dos grupos de alta e baixa expressão foram optimizados para conseguir o menor valor de p. Todas as análises estatísticas, gráficos de caixas, e parcelas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram realizadas utilizando-R Software (https://www.r-project.org).

Resultados

Screening siRNA Identifica coatomer Complex membros como moduladores de viabilidade e Autophagy

para identificar jogadores moleculares novas no controle da morte celular autofágica, realizamos dois tipos de interferência de RNA (RNAi) telas para encontrar genes que, quando derrubou resultou em ambos diminuiu a viabilidade celular e formação de autofagossomas. Em primeiro lugar, exibiu o kinome humana, porque cinases e genes relacionados com a quinase são reguladores chave de funções celulares complexas, tais como a autofagia. siRNAs foram transfectadas em quatro linhas de células diferentes: duas linhas de células de cancro do ovário (SKOV3 [

HER2 amplificado

;

CDKN2A

,

PIK3CA

, e

TP53

mutantes] e OVCAR3 [

PIK3R1 Comprar e

TP53

mutantes]) e duas linhas de células de cancro da mama (MDA-MB-231 [

BRAF

,

CDKN2A

,

KRAS

, e

TP53

mutantes] e MDA-MB-468 [

EGFR

amplificada;

PTEN

,

RB1 ​​

,

TP53

, e

SMAD4

mutantes]) com diferentes origens genéticas. No total, foram identificados 67 genes, 9% do kinome, que quando derrubado reduziu significativamente a viabilidade das células (Z-pontuação inferior a -2) (Tabela S1). Destes 67 resultados positivos, knockdown de 12 genes reduziram a viabilidade de pelo menos duas das linhas celulares testadas. Estes genes foram

AKT2

,

CHEK1

,

COPB2

,

PRKAR2B, RPS6KA2

e

Wee1

(em três dos quatro linhas celulares) e

AVPR1B

,

CNKSR1

,

DGUOK, INSRR

,

JAK2, TAF1L

(em duas das quatro linhas celulares).

Para identificar genes também envolvidos na regulação da autofagia em células cancerosas, foi realizada uma pequena biblioteca de RNAi baseada em imagem (Accell; Tabela S2) tela com formação autophagosome como um ponto final. linhas de células de cancro MDA-MB-231, SKOV3, e U2OS foram estavelmente transfectadas com a proteína fluorescente verde-microtúbulo associado à proteína 1 de cadeia leve de 3 (GFP-LC3) vector repórter do [18], [19]. Porque LC3 é degradado durante a fase final de autofagia produtiva [20], a acumulação de LC3 persistente em vesículas puntiformes foi usada como um marcador para a autofagia prejudicada ou abortiva. A rapamicina, 2-desoxi-D-glucose (2DG), e imatinib eram controlos positivos para a formação autophagosome. Não segmentação siRNAs mexidos, utilizados como controlos negativos, não resultou em autofagia (Fig. S1A-C). Em todas as linhas celulares testadas, observou-se que a depleção da subunidade complexa proteína coatomer beta 1 (COPB1) provocou uma acumulação dos salpicos LC3-positivas que são sugestivos de autofagia (Fig S1A-C;. Tabela S3), indicando que a autofagia mecanismo é conservada entre diferentes linhagens tumorais. Em conclusão, utilizando telas de siRNA foram identificados e COPB2 COPB1 como moduladores de, respectivamente, a viabilidade celular e autofagia.

Modulam Proteínas coatomer Viabilidade Celular

e COPB1 COPB2, componentes do complexo copi, foram considerados candidatos atractivos para estudo adicional com base no impacto significativo nas células cancerosas em tanto a viabilidade das células e formação autophagosome (Tabela S1 e S3, Fig. S1). Num rastreio secundário, que validado e analisados ​​os efeitos sobre o crescimento celular e formação autophagosome depois de derrubar membros independentes deste complexo em três linhas de células de cancro (MDA-MB-231, MDA-MB-468 e SKOV3). Como mostrado na Figura S2, siRNAs reduzida expressão de vários componentes COPI. Consistente com os nossos resultados a partir da tela siRNA, esgotamento da COPA, COPB1, COPB2, COPG1, DPOC, e COPZ1 reduziu o crescimento celular (Fig. 1A e C). Em contraste, a viabilidade celular não foi afectada em células tratadas com siRNA alvejando não (Fig. 1A e B) ou apenas moderadamente afectado em MCF10A, uma linha de células de mama normal, como, após COPB2 knockdown (Fig. S9B). A adição do inibidor da pan-caspase zVAD não resgatar a morte celular (dados não mostrados) indicando que a morte celular foi independente de caspases. Para confirmar que as células cancerosas estão comprometidos com a morte quando COPI é prejudicada, determinou-se a recuperação clonogênica após 72 h de tratamento siRNA em MDA-MB-231 (Fig. 1D) e U2OS (Fig. 1E) células cancerosas. Em ambas as linhas celulares, eficiência repique não foram reduzidos após a depleção COPG2 relação ao controle, confirmando nossos resultados. Em contraste, a expressão de redução COPA ou COPB2 aboliu quase completamente a recuperação clonogénicas (Fig. 1D, E), o que é consistente com os nossos resultados de viabilidade (Fig. 1a). Notavelmente, a eficiência replating não foi reduzida em células U2OS tratados com rapamicina (Fig. 1F), consistente com a capacidade da rapamicina para induzir autofagia produtiva como um processo de sobrevivência. A morte celular após COPI knockdown foi ainda mais visualizados e confirmado usando anexina V coloração (Fig. S3). No seu conjunto, estes resultados mostram que a maioria dos componentes COPI modular a viabilidade das células cancerosas.

(A) células MDA-MB-231, MDA-MB-468, e SKOV3 foram transfectadas com ARNsi de segmentação membros independentes de COPI. Knockdown da PLK1 foi utilizado como controlo positivo para a morte celular. O número de células após 72 h foi medido por coloração com violeta de cristal. (B, C) representativos de microscopia de luz imagens de MDA-MB-231 células tratadas com RF ou siRNA contra COPB2. (D) a eficiência replating clonogénico de células MDA-MB-231 de cancro da mama após a diminuição da expressão da COPA, COPB2 ou COPG2 em comparação com as células tratadas com o RISC-free (RF). Os resultados são a média ± DP a partir de triplicados de duas experiências independentes. eficiência replating clonogénicos de células de cancro U2OS após o tratamento com ARNsi contra COPB2 COPG2 ou (E) ou rapamicina (F). Os resultados são a média ± DP a partir de triplicados de duas experiências independentes. **, P 0,01; ***, P . 0.001

coatomer Proteínas Modular Autophagy

Em seguida, testamos se o esgotamento de diferentes proteínas complexas COPI independentes autofagia iniciado, usando a formação pontuada GFP-LC3 como um Leia. Redução da expressão da COPA, COPB1, COPB2, COPG1, DPOC, e COPZ1 induziu a formação ponteada GFP-LC3 em MDA-MB-231, linhas de células de cancro MDA-MB-468 e SKOV3 (Fig. 2A). Os resultados foram comparáveis ​​aos observados quando as células foram tratadas com imatinib, um controlo positivo para a indução autophagosome (Fig. 2A-C). formação Autophagosome também foi avaliado pela conversão de endógena LC3-I lc3-II utilizando imunotransferência porque a quantidade de LC3-II se correlaciona com a quantidade de membranas marcadas com autofágicos LC3-II [19]. Consistente com os dados obtidos em células cancerosas exogenamente que sobre-expressam GFP-LC3 (Fig. 2A-C) e com a excepção de COPG2, reduzir a expressão das subunidades coatomer conduziu a uma acumulação de endógena LC3-II em MDA MB-231 células (Fig. 2D). Resultados semelhantes foram observados em células cancerosas U2OS (Fig. 2E) MDA-MB-468 e. Nós validado ainda mais a persistência do aumento LC3-II após a depleção de uma análise COPI curso de tempo prolongado (Fig. 2F). A expressão reduzida sustentada dos COPI mantida expressão LC3-II, sem aparente degradação da LC3-II, sugestivo de autofagia prejudicada. análise de microscopia eletrônica (Fig. 3A, C e E; insere Fig 3B, D e F.) confirmou a formação e marcado aumento (Fig 3G.) de autofagossomas após o esgotamento COPB2 (Fig 3C e D.) e tratamento com imatinib (Fig. 3E e F) ao nível ultra-estrutural pela presença de organelos membranares dupla contendo conteúdos citoplasmáticos não digeridas [18]. Em contraste, ARNsi de controlo (RF) (Fig. 3A e B) não promovem a formação de autophagosome. Embora o aumento no autofagossomas foi semelhante entre MDA MB-231 tratadas com COPB2 siARN e imatinib, descobrimos que autofagossomas induzidas por COPB2 siRNA foram significativamente maior em comparação com autofagossomas induzidas pelo imatinib como avaliada por quantificação da área de autophagosomal /citoplasma em electrões microscopia imagens (Fig. 3H). Esta observação foi também confirmada pela determinação do tamanho dos organelos positivas GFP-LC3 de células MDA-MB-231 tratadas com COPB2 ou ARNsi de controlo (Fig. S4A). O tamanho de autofagossomas induzidas por siCOPB2 é também maior do que a induzida pela inanição autofagossomas (Fig. S4B e S4C). Colectivamente, estes resultados indicam que a depleção de COPI resulta em acumulação de salpicos LC3-positiva em células cancerosas.

(A), MDA-MB-231, as células MDA-MB-468, e que sobre-expressam de forma estável SKOV3 GFP-LC3 eram transfectadas com siRNA segmentação membros independentes do COPI durante 72 h, e formação de autophagosome foi analisada utilizando o analisador de celular em 1000 do sistema. O imatinib foi usada como um controlo positivo para formação autophagosome. Os resultados são a média ± DP a partir de triplicados. gráfico representativos de duas experiências independentes é mostrado. (B, C) imagens de microscopia de epifluorescência representante (em celular Analyzer 1000) de vesículas-GFP-LC3 positivo no controle de células MDA-MB-231 ou após o esgotamento COPB2. análise (D) Immunoblot de LC3 em células MDA-MB-231 de 72 h após siRNA depleção mediada por membros independentes do COPI. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. células (E) MDA-MB-468 e U2OS tratados com RF ou COPB2 siRNA foram ensaiados quanto a níveis de proteína de LC3. células (F) MDA-MB-231 foram transfectadas com ARNsi contra COPB2, COPG2 ou RISC-free (RF) e crescidas durante os tempos indicados, lisadas, e coradas imunologicamente com anticorpos contra a LC3, COPB2, COPG2 e β-actina. *, Aspecific banda.

(A-F) eletrônica de transmissão análise de microscopia de autofagia em células MDA-MB-231 células tratadas com RF ou siRNA contra COPB2 por 48 h ou imatinib durante 24 h. setas brancas indicando autofagossomas são mostrados em painéis C e E. (B, D, F) imagens de alta ampliação de áreas em caixa. As barras de escala indicam 2 uM (A, C, E) e 500 nm (B, D, F). (L) Número de autofagossomas por célula foi calculado por contagem do número de organelos membranares duplas em 20 ou mais células individuais. (H) Área Percentual autophagosomal foi calculada pela área coberta pelo organelos de dupla membrana no citoplasma de 20 ou mais células individuais medindo. **, P 0,01; ****, P 0,0001,

Rompimento de COPI Induz abortiva Autophagy

Porque esgotamento de COPI membros complexos causou a morte celular e formação autophagosome, partimos para testar se abortiva autofagia foi o mecanismo. Para diferenciar entre autofagia abortiva e produtivo analisamos p62, que é preferencialmente degradada durante autofagia, mas os níveis de permanecer constante ou aumentado mediante a indução de autofagia abortivo [21]. Conforme determinado por análise de imunotransf erência de diferentes linhas celulares de cancro (Fig. 4A) e da análise de imunofluorescência em MDA-MB-231 (Fig. 4B, C), siCOPB2 não reduziu os níveis de p62, como seria de esperar de autofagia produtiva, mas aumentou os níveis de p62 em comparação com os níveis de controlo. Em contraste, os níveis de p62 foram diminuiu em MCF10A (Fig. S9D), embora os níveis de proteína COPB2 foram significativamente diminuída (Fig. S9C). Além disso, utilizou-se bafilomicina A1 (BafA1), um inibidor específico do lisossoma de degradação de proteínas e as fases finais do processo para inibir o fluxo autofagia autophagic [18], [22]. tratamento BafA1 foi mostrado para aumentar os níveis de LC3-II em células que sofrem autofagia produtivo, mas tem um efeito limitado sobre os níveis LC3-II em células que sofrem autofagia abortivo [20]. Em MDA-MB-231 com knockdown de COPB2, tratamento BafA1 não aumentar ainda mais o nível II LC3-(Fig. 4D), em contraste com COPG2 empobrecido ou células de controlo, indicando a degradação auditivos do conteúdo autophagosomal pelos lisossomas após a depleção COPB2 . Nós confirmou esta observação em células cancerosas U2OS tratados com BafA1 ou rapamicina (Fig. S5). degradação prejudicada do conteúdo luminal interna do autofagossomas pelos lisossomos pode resultar de: 1) falhou fusão autophagosome /lisossoma; 2) prejudicada degradação; ou 3) a reciclagem incompleta dos componentes autolysosomal [18], [23]. Para determinar qual dessas possibilidades foi responsável pelo aumento da LC3-II e p62 em células com depleção COPI, analisamos primeira fusão de autofagossomas (GFP-LC3) e lisossomos (lamp2) após knockdown de COPI no MDA MB-231 estavelmente transfectadas com GFP-LC3 (Fig. 5A). análise confocal revelou co-localização de GFP-LC3 e LAMP2 em células cancerosas tratadas com siRNA contra COPB2 (Fig. 5A), sugerindo a fusão não foi completamente bloqueada por esgotamento de COPI. Testamos o efeito do COPB2 siRNA na degradação autophagosomal usando MRFP-GFP conjunto fluorescente LC3 marcado (tfLC3; [15]). Em células transfectadas transitoriamente com tfLC3, GFP /RFP puncta-positivo representam autofagossomas não fundidos a lisossomos, enquanto puncta RFP-positivo /GFP-negativos representam autolysosomes como GFP é mais rapidamente extinta por baixo pH lisossomal [15]. MDA-MB-231 transfectadas transientemente com tfLC3 mostrou co-localização do sinal MRFP e GFP após a depleção COPI ou tratamento BafA1 (Fig. 5B, linhas 2 e 3), indicativa de maturação diminuída dos autofagossomas. O tratamento de células MDA-MB-231 com imatinib resultou em pontos lacrimais RFP-positiva /GFP-negativo que representa a presença de autolysosomes e, assim, o fluxo autophagic (Fig. 5B, última linha). Resultados semelhantes foram obtidos em células cancerosas U2OS (Fig. S6). Além disso, as células COPB2 empobrecido mostrou grandes LAMP2 organelos positivos (Fig. S4D).