Abstract

Objectivo

Muitos estudos têm relatado o valor preditivo de prognóstico de CD166 como um marcador de células-tronco de câncer em cânceres do sistema digestivo; no entanto, seu valor preditivo permanece controverso. Aqui, nós investigamos a correlação entre CD166 positividade em cânceres do sistema digestivo e as características clinicopatológicas usando meta-análise.

Métodos

Uma busca exaustiva no PubMed e ISI Web of Science a março de 2013 foi realizada . Somente os artigos que contêm antigénios CD166 coloração imuno-histoquímica em cânceres do sistema digestivo foram incluídos, incluindo câncer pancreático, câncer de esôfago, câncer de estômago e câncer colorretal. Foram coletados dados comparando a sobrevida global de 3 e 5 anos, juntamente com outras características clínico-patológicas.

Resultados

Nove estudos com 2553 pacientes que atenderam foram incluídos os critérios de inclusão para a análise. A taxa média de CD166 expressão coloração imuno-histoquímica foi de 56% (25,4% -76,3%). No cancro colorectal especificamente, os resultados de um modelo de efeitos fixos indicou que a expressão CD166-positive foi um marcador independente associado com uma carga tumoral menor (categoria T; RR = 0,93, 95% CI: 0,88-0,98), mas pior se espalhou para os nódulos linfáticos próximos (categoria N; RR = CI 1,17, 95%: 1,05-1,30). A taxa de sobrevida global em 5 anos foi mostraram relação com coloração positiva citoplasmática de CD166 (RR = 1,47 95% 1,21-1,79), mas nenhuma associação significativa foi encontrada na piscina ou qualquer outra análise estratificada, com sobrevida global de 3 ou 5 anos taxa.

Conclusão

com base nos estudos publicados, localização celular diferente de CD166 tem valor prognóstico distinto e expressão positiva citoplasmática está associada com desfecho pior prognóstico. Além disso, nossos resultados também encontram expressão CD166 indicam avançou categoria T e estado N-positivo no cancro colorectal especificamente

Citation:. Ni C, Zhang Z, Zhu X, Y Liu, Qu D, Wu P, et al . (2013) valor prognóstico da CD166 expressão em cânceres do sistema digestivo: uma revisão sistemática e meta-análise. PLoS ONE 8 (8): e70958. doi: 10.1371 /journal.pone.0070958

editor: Syed A. Aziz, Health Canada e Universidade de Ottawa, Canadá |

Recebido: 03 de maio de 2013; Aceito: 24 de junho de 2013; Publicação: 05 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ni et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Provincial de Zhejiang para o cultivo de alto nível talentos inovadores Saúde (JH), o projeto 151 Talent da Província de Zhejiang (JH), o projeto chave de Zhejiang medicina tradicional (No. 2012ZZ010), a disciplina chave da Saúde Ministério da Província de Zhejiang (11-CX11) eo Key cultivar programa da National Science Foundation (No. 91.019.005). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Embora os tratamentos para cânceres do sistema digestivo têm vindo a desenvolver-se rapidamente, esses tipos de câncer, especialmente câncer de pâncreas e colo-rectal, ainda são responsáveis ​​por um número de mortes [1]. Tem sido relatado que uma pequena subpopulação de células, chamadas células-tronco cancerosas (CSCs), dominam a iniciação, progressão, metástase e recidiva do cancro. Nos últimos anos, certos marcadores de superfície celular têm sido relatados como marcadores CSC em cancros do sistema digestivo, com uma expressão elevada destes marcadores geralmente um indicador de prognóstico pobre. Entre eles, CD166 foi identificado experimentalmente como um marcador de células estaminais putativo em vários cancros [2] – [5] com uma alta capacidade de formação de esfera e xenoenxerto

CD166, também conhecido como molécula de adesão de leucócitos activados. (ALCAM), é altamente conservada de 110 kDa de múltiplos domínios transmembranar de tipo-1 glicoproteína da imunoglobulina de super família, que foi descrita pela primeira vez como um ligando CD6 nos leucócitos [6]. Outros estudos têm revelado que é amplamente expresso em diferentes tecidos e células, incluindo neuronais, células do sistema imunológico e epiteliais, bem como células estaminais hematopoiéticas e de origem mesenquimal. CD166 desempenha um papel importante em muitas actividades biológicas, incluindo a activação das células T e a proliferação, a angiogénese, a hematopoiese e fasciculação axónio [7]. CD166 também está intimamente relacionada com vários cancros, incluindo melanoma, câncer de próstata e câncer de mama. Muitos cancros do sistema digestivo também foram encontrados a ter elevada expressão de CD166; no entanto, os resultados de prognóstico destes estudos são contraditórios. Dois estudos anteriores por Weichert e Horst et al [8], [9] relatou expressão positiva de CD166 no câncer colorretal e que CD166 foi um marcador prognóstico independente associado com menor sobrevida. resultados conflitantes No entanto, outros dois estudos independentes recentes descobriram [10], [11].

Porque a contradição pode ser causada por tamanhos de amostra limitada, juntamente com outros fatores, aqui, foi realizada uma análise conjunta de todos os cancros do sistema digestivo, incluindo pâncreas, gástrico, esofágico e cancro colo-rectal. Embora todos os tipos de cancro foram obtidas a partir do sistema digestivo, heterogeneidade dentro dos diferentes tecidos podem também existir. Portanto, analisamos câncer de pâncreas e colo-rectal de forma independente para melhorar a precisão. Aqui, apresentamos uma meta-análise que visa clarificar o valor prognóstico do CD166 em cânceres do sistema digestivo com base em evidências atualmente publicado. Outras características clinicopatológicas foram também examinadas neste estudo.

Materiais e Métodos

Pesquisa Estratégia

Foi realizada uma pesquisa sistemática da literatura das bases de dados eletrônicas PubMed e ISI Web of Science-se a março de 2013. Os termos de pesquisa incluíram “antigénio CD166”, “ALCAM” ou “molécula de adesão celular de leucócitos ativados” com “câncer”, “neoplasia” ou “carcinoma”. Os títulos e resumos de referências potenciais foram cuidadosamente examinados para excluir estudos irrelevantes; os restantes artigos dentro do tema de interesse foram revistos em profundidade para a sua relevância.

Critérios de Seleção

Os estudos nesta meta-análise incluiu tanto estudos controlados e randomizados (ECR) ou estudos observacionais (caso -control ou coorte) que avaliou a relação entre a expressão de CD166 e o ​​risco de desenvolver um cancro do sistema digestivo. Os estudos foram incluídos se eles preencheram os seguintes critérios: (a) eles se concentraram em cânceres do sistema digestivo (esôfago, estômago, pâncreas e câncer colorretal); (B) que definiu um grupo de CD166 positivo por imuno-histoquímica; e (c) descreveram uma correlação entre CD166, características clínico-patológicas e os resultados de sobrevivência (ou sobrevida livre de doença ou sobrevida global). Os artigos foram excluídos das análises com base nos seguintes critérios: (a) os papéis não estão em inglês; (B) artigos de revisão ou letras; e, (c) dados suficientes para determinar a RR e IC, ou o texto completo não pôde ser encontrado.

Com base em uma lista de verificação de revisão crítica fornecido pelo Centro Cochrane Holandês [12] e, em um esforço para controlar a qualidade desta meta-análise, examinamos a qualidade de todos os estudos incluídos. Sete pontos-chave são retratados aqui: (a) definição clara de população do estudo e origem do país, (b) definição clara do tipo de carcinoma, (c) definição clara do desenho do estudo, (d) definição clara da avaliação de resultados , (e) definição clara do cut-off de expressão CD166, (f) definição clara do método de avaliação CD166 e (g) o tempo suficiente de follow-up.

Data Extraction

Todos os dados foram extraídos por dois revisores independentes. tabelas de dados foram gerados para extrair todos os dados relevantes a partir de textos, tabelas e figuras, incluindo: autor, ano, país, número do paciente, método de detecção, duração do follow-up, categoria T, categoria N, metástases à distância, taxas positivas de CD166 superexpressão , bem como a sobrevivência global (OS) taxa. Para artigos que só forneceram dados de sobrevivência numa curva de Kaplan-Meier, o software GetData Graph Digitizer 2,24 (https://getdata-graph-digitizer.com/) foi aplicado para digitalizar e extrair os dados.

Devido a pontuação de corte para CD166 positividade variou entre os estudos, definimos o grupo positiva CD166 no que diz respeito aos artigos originais. Por causa do alto grau de malignidade e mau prognóstico de pacientes com câncer pancreático em clínica, a OS foi padronizado para 3 anos no câncer de pâncreas, e os outros tipos de câncer foram padronizados para 5 anos.

Análise Estatística

a análise estatística foi realizada de acordo com as diretrizes propostas pelo Meta-análise de estudos observacionais no grupo Epidemiology. O risco relativo (RR), com intervalo de confiança de 95% (IC 95%) foi calculada com Review Manager 4.2. A heterogeneidade entre os estudos foi medido utilizando o Q e I

2 testes. Um fixo ou modelo aleatório foi utilizado em função da análise da heterogeneidade. O potencial de viés de publicação foi avaliada usando o método de correlação Begg eo método de regressão ponderada Egger (stata11.0 software). valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os valores de p são bicaudais.

Resultados

Resultados da busca em

Inicialmente, 148 artigos foram recuperados utilizando a estratégia de busca acima. A partir do título e fiscalização abstracta, 120 dos artigos foram excluídos devido a experiências não-humanos, estudos relacionados com o cancro do sistema não-digestivos, ou artigos não originais (por exemplo, revisão, letra). Dos artigos restantes, 19 foram excluídos por não fornecer dados clínico-patológicas, nomeadamente a taxa OS [2] – [4], [13] – [28]. Finalmente, um total de 9 estudos foram incluídos na meta-análise de 2553 com os participantes. Todos estes estudos avaliaram explicitamente a expressão de CD166 e do risco de morte por câncer de coloração imuno-histoquímica (Figura 1).

Características de Estudos

Todos os recursos dos 9 estudos elegíveis são listados na tabela 1. Entre eles, sete eram da Alemanha, um do Japão e uma da Suíça. Além disso, 2 estudos focados em câncer pancreático, 4 focada em câncer colorretal, e um foco em cada um dos neuroendócrino do pâncreas, esôfago e câncer gástrico. Um total de 2553 pacientes com uma mediana de 188 (38-1274) por estudo foram incluídos. O palco e tumor de grau TNM foi relatada em 8 e 7 estudos, respectivamente. Além disso, estudos 6 determinada expressão CD166 apenas na membrana, e 3 estudos coradas CD166 tanto na membrana e no citoplasma. Tissue microarrays para análise da expressão de CD166 foram utilizados em estudos 5. Três estudos utilizaram imunoquímica tecido coloração todo e um estudo aplicado ambos os métodos (Tabela 1). Em estudos 6, nenhum dos pacientes recebeu neo-adjuvantes radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia, [8] – [10], [29] – [31]. Pertencente diretamente para câncer colorretal, os pacientes com recidiva do tumor no estudo de Horst foram tratados com quimioterapia, radioterapia ou ressecção cirúrgica quando possível. No estudo de Lugli, 478 pacientes receberam a terapia pós-operatória. No estudo de Kahlert, 88 casos tinham uma ressecção R0 e 9 casos teve uma ressecção R1. Para o câncer gástrico, todos os pacientes tiveram uma ressecção R0 com pelo menos um D1 linfonodo dissecação.

Correlação de CD166 para Características Clínicas

A correlação de expressão membrana CD166 com a categoria T global , categoria N, metástases distantes do tumor e grau é ilustrado nas Figuras S1, S2, S3 e S4. Os resultados sugerem que CD166 correlacionado mais com pacientes categoria T1 e T2 (RR combinado = 0,94, 95% CI: 0,89-0,99) pacientes N-positivos e (RR = 1,20, 95% CI: 1,09-1,32). No entanto, no cancro colorectal especificamente, expressão CD166 foi associada com a categoria mais avançada T (RR = 0,93, 95% CI: 0,88-0,98) e o estado N-positivo (RR = 1,17, 95% CI 1,05-1,30), e ele fez não mostram qualquer relação com outros tipos de tumores digestivos. Além disso, permitiu a estratificação dos dados extraídos por área geográfica, padrão de coloração, tempo de seguimento e tamanho da amostra: estudos na Europa mostraram expressão CD166 foi relacionada com os pacientes categoria T1 e T2 (RR = CI 0,94, 95%: 0,89-0,99; membrana coloração: RR = 0,94, 95% CI: 0,89-0,99) e o estado N-positivo (RR = 1,17, 95% CI: 1,06-1,30; coloração da membrana: RR = 0,94, 95% CI: 0,89-0,99). a coloração das membranas de CD166 revelou também relacionada com os pacientes categoria T1 e T2 (RR = 0,94, 95% CI: 0,89-0,99), e ambos os padrões de coloração foram mostrou associado com status de N-positivo (coloração da membrana: CI RR = 0,94, 95% : ,89-,99; membrana coloração citoplasmática RR = 1,51, 95% CI: 1,09-2,10). Estudos com mais curto (RR = 1,34, 95% CI: 1,04-1,71) ou mais vezes de acompanhamento (RR = 1,17, 95% CI: 1.05-1.30) ambos mostraram uma relação positiva entre a expressão de CD166 e estado N. O mesmo resultado foi também encontrado em ambos os estudos com menor (RR = 1,40, 95% CI: 1,02-1,92) ou amostras maiores (RR = 1,18, 95% CI: 1,06-1,30). No entanto, não houve uma clara associação entre a expressão de CD166 e outras características clínico-patológicas, incluindo metástases à distância (RR = 1,10, 95% CI: 0,85-1,43) ou o grau do tumor (RR = 0,90, 95% CI: 0,63-1,27), quer em geral ou análises estratificadas (Tabela 2).

Expression CD166 e 3 ou 5 anos a sobrevida global taxa

A taxa de sobrevida global em 5 anos foi extraído a partir de 9 estudos, o que era composto por 4 estudos colorectal cancer, 1 gástrica, esofágica 1 e 3 estudo do cancro do pâncreas e dois estudos de câncer de pâncreas também foram examinados com sobrevida global de 3 anos. Os 5 anos as taxas de sobrevida global em pool de pacientes CD166-positivos e CD166-negativos foram de 57,3% (767/1339) e 33,7% (523/1214), respectivamente. As taxas de sobrevida global de 3 anos foram de 25,3% (38/150) e 12,2% (17/139) para os mesmos pacientes, respectivamente. A análise piscina não mostraram associação significativa entre a taxa de sobrevida global e estado CD166 (Figuras S5 e S6), no entanto, o grupo estratificada com base no padrão de coloração revelou membrana e coloração citoplasmática foi relacionado a um pior prognóstico (RR = CI 1,47 95% 1.21- 1,79), mas a coloração da membrana por si só não poderia mostrar qualquer valor de predição (Tabela 2, Figura 2).

viés de publicação

testes de heterogeneidade e viés de publicação foram realizadas análises entre os estudos com base na membrana e coloração citoplasmática. Os resultados indicam que as parcelas do funil são quase simétrica e que os valores P de Begg e testes de Egger foram 0,296 e 0,533, respectivamente (Tabela S1). Assim, não foram encontradas evidências de viés de publicação na meta-análise.

Discussão

Muitos carcinomas do aparelho digestivo foram consideradas doenças relacionadas com células-tronco do câncer nos últimos anos, incluindo o esôfago, gástrica, pâncreas e cancro colorectal [32] – [35]. Num esforço para identificar estas pequenas populações de células, uma série de proteínas da superfície das células foram identificadas como marcadores CSC. Muitos estudos têm demonstrado experimentalmente que CD166 pode enriquecer em células CSC-como numa variedade de cancros [4], [5]. Além disso, Levin et ai, [4], descobriram que a CD166 é expressa em níveis baixos em células intestinais diferenciadas mas robusta expresso na superfície de células no interior do nicho de células estaminais na base de uma cripta, que infere fortemente a sua relação com as propriedades de células estaminais . Apesar de alta expressão de marcadores de CSC são geralmente considerados como um prognóstico mau resultado, diversas contradições a essa generalização existir em estudos publicados sobre o putativo CSC-marcador CD166 [21].

Para investigar a base para estas conclusões contraditórias , os métodos de coloração entre os estudos nesta meta-análise foram comparados. Embora o mesmo anticorpo foi utilizado em cada um destes estudos, os métodos de coloração têm variado entre analisando a coloração tanto membranas e do citoplasma, enquanto outros tomar apenas a coloração das membranas em consideração. Tachezy et al [11] verificaram que CD166 foi predominantemente expresso na membrana celular e que a intensidade de coloração citoplasmática foi relacionado com a intensidade da coloração das membranas e não ocorreu na ausência de coloração das membranas; Assim, apenas a coloração das membranas foi considerado em seu estudo. Os outros três estudos nesta meta-análise que incidiu sobre a coloração das membranas incluindo colo-rectal e cancro pancreático, todos concluíram que a alta expressão de CD166 é um marcador positivo para um bom prognóstico [10], [14], [36]. Em contraste, os três estudos em nossa análise que analisam tanto membrana e intensidade da coloração citoplasmática propor que CD166 alta expressão contribui para a má evolução clínica [8], [30], [31]. Curiosamente, na forma oral, da mama e carcinomas do ovário, diminuição da membranoso e o aumento da expressão citoplasmática de CD166 também está associada a um pior prognóstico [37] – [39]

CD166 foi demonstrado participar na cascata metastática do cancro. células. CD166-adesão intercelular mediada envolve interacções entre o domínio amino-terminal D1 de moléculas receptoras opostos em duas células e é reforçada por oligomerização lateral das moléculas vizinhas na superfície da célula, que engatam os domínios membrana proximais D4 e D5, [40]. Estes dados sugerem que a elevada expressão de CD166 pode impedir a libertação de células de cancro a partir de uma lesão local. Além disso, tem sido mostrado que a CD166 /ALCAM pode ser activamente clivado por proteólise ADAM17 /TACE mediada por [41]. No cancro do ovário, a inibição farmacológica de proteínas ADAM ou silenciamento específico de ADAM17 /TACE, derramamento dificultada de CD166 expressas na superfície da célula. Curiosamente, CD166 /ALCAM pode ser translocados da superfície celular para o citoplasma, através de uma via dependente de clatrina. Especificamente, solúvel CD166 /ALCAM (sALCAM) liga-se a scFv I /F8 para formar uma quimera, que induz endocitose do ligado à membrana CD166 /ALCAM. sALCAM moléculas quiméricas recombinantes inibem a função adesiva de CD166 /ALCAM através de um efeito de ligação competitiva, o que resulta num aumento da motilidade de células de cancro [42], [43]. Van Kempen et ai [44], também descobriram que a interrupção de CD166 auto-interacção foi associada com a motilidade de células tumorais e metástases. Estes estudos sugerem que todas as CD166 derramamento a partir da superfície da célula podem prever a progressão do tumor e de prognóstico reservado.

O cancro do cólon é um modelo clássico para estudos de progressão tumoral, devido ao seu desenvolvimento natural a partir de células-tronco da cripta de adenomas para carcinomas formados integralmente [45]; CD166 é altamente expresso na superfície das células da cripta nesta doença. No entanto, tanto a superfície celular e expressão citoplasmática de CD166 é evidente na formação de adenoma no início Apc

Min /+ ratos, cancro colorectal humana e doença metastática. Além disso, apenas um subconjunto de células positivas CD166 co-localizar com o marcador de proliferação Ki67 [4]. Estas observações sugerem que a localização subcelular de CD166 específico poderia ser utilizado como um marcador de prognóstico clínico devido a perda de expressão na superfície celular CD166 parece ser um precursor para a progressão do tumor.

Parte da CD166 derramamento iria libertar para dentro do tumor meio ambiente e circulação. Alguns estudos têm ido tão longe como para examinar o derramamento de CD166 /ALCAM no soro sanguíneo. Dois estudos nesta meta-análise de câncer de esôfago e pâncreas encontrou uma regulação positiva significativa de CD166 no soro do sangue dos pacientes, mas esta observação só tinha um valor prognóstico em pacientes com câncer de esôfago, como nenhuma correlação significativa foi encontrada entre a expressão e tecido elevada nível sérico nos doentes com cancro pancreático [29], [36]. Klasingam et ai. [46] descreveram significativamente alta sALCAM no soro do sangue de pacientes com câncer de mama, mas não foram relatados dados de prognóstico. Variação de sALCAM entre os estudos podem ter várias causas: sALCAM deve passar através da barreira de tecido do tumor e células endoteliais vasculares para ser liberado na corrente sanguínea, e secção sequencial não foi capaz de estabelecer uma relação direta entre ADAM17 /TACE e ALCAM [31] . Estes dados implicam que o nível de sALCAM em circulação é instável e que não é apropriado usá-lo para estimar prognóstico.

Embora a evidência dirigida acima pode implicar que a expressão da superfície celular de CD166 seria um marcador de prognóstico positivo e que o derramamento de CD166, em outras palavras, expressão CD166 citoplasmática iria prever o resultado inverso, mas em nossa análise estratificada, apenas a coloração citoplasmática mostrou estreita relação com prognóstico reservado, e o resultado da coloração da membrana de CD166 em claro, porque dois dos incluídos estudos forneceram resultados significativamente contraditórias [9], [29]. Recentemente, um estudo do câncer colorretal pode ter fornecido um método sucinta para avaliar o valor prognóstico da CD166 [21]. Eles descobriram que um nível elevado de mRNA CD166 foi associada com mau resultado, a proteína CD166 membranous ainda intacto (domínio extracelular e intracelular co-localizada) está associado a um melhor resultado. Com um novo método que coradas os domínios extracelulares e intracelulares de CD166 separadamente, eles descobriram que o domínio extracelular de CD166 foram submetidos derramamento enquanto o epitopo intracelular permaneceu. Assim, concluiu-se que a supressão do domínio extracelular de CD166 correlacionada com o resultado do paciente, em vez de perda de expressão, que foi anteriormente considerado o valor prognóstico da CD166. Infelizmente, o anticorpo utilizado nos estudos anteriores não podiam diferenciar o epitopo subcelular de CD166 em imuno-histoquímica, tornando difícil para um patologista para avaliar com precisão se a proteína foi localizada na superfície da célula, que afecta grandemente a capacidade de prognóstico da expressão CD166.

Esta meta-análise está sujeito a algumas limitações. Em primeiro lugar, o número de estudos incluídos é relativamente pequeno, particularmente para o cancro gástrico e esofágico. Em segundo lugar, 8 dos 9 estudos foram da Europa, incluindo 7 da Alemanha, um da Suíça e apenas um da Ásia. diferenças local distinto são acreditados para existir e poderia causar viés de publicação. Em terceiro lugar, os critérios para determinar a expressão positiva ou negativa de CD166 variou entre os estudos. Seis estudos só estudou expressão CD166 membranoso, enquanto o resto também teve expressão citoplasmática em consideração. Finalmente, embora nós tentamos identificar a taxa de sobrevida livre de doença, esses dados foram quase inteiramente ausente a partir desses estudos. Mais importante ainda, com base em nossa meta-análise de estudos anteriores e revisão sistemática de artigos relacionados indica que a função biológica de CD166 na progressão tumoral é complicado e que determinar a sua localização subcelular pode ser a chave para as previsões prognósticos precisos. Assim, um método de coloração mais uniforme deve ser empregada em estudos futuros.

Informações de Suporte

Figura S1.

expressão CD166 e da categoria T

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s001

(TIF)

Figura S2.

expressão CD166 e categoria N

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s002

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Figura S3.

CD166 expressão e tumor de grau

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s003

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Figura S4.

expressão CD166 e metástases à distância

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s004

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Figura S5.

expressão CD166 e taxa de sobrevida global em 5 anos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s005

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Figura S6.

CD166 expressão e taxa de sobrevida global de 3 anos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s006

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Tabela S1. teste e publicação viés

Heterogeneidade análises entre os estudos incluídos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s007

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Arquivo S1.

PRISMA Diagrama de Fluxo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s008

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S2 arquivo.

PRISMA Checklist

doi:. 10.1371 /journal.pone.0070958.s009

(DOC)