Abstract

Fundo

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer nos Estados Unidos, sugerindo que novas estratégias para a prevenção e tratamento de PDAC são urgentemente necessários. mutações K-ras são observados em 90% do cancro do pâncreas, sugerindo o seu papel na iniciação e estágios iniciais de PDAC. A fim de obter uma visão mecanicista quanto ao papel do K-ras mutantes, vários modelos de ratos têm sido desenvolvidos visando um condicionalmente mutantes K-ras

G12D para recapitular PDAC. Um co-operatividade significativa foi mostrado no desenvolvimento de tumores e metástases em um modelo de rato com o composto activado K-ras e deficiência INK4A /Arf. No entanto, o mecanismo molecular (s) pelo qual K-ras e deficiência INK4a /Arf contribuir para PDAC ainda não foi completamente elucidado.

Metodologia /Principais Achados

Para avaliar o mecanismo molecular (s ) que estão envolvidos no desenvolvimento de PDAC nos ratinhos transgénicos composto com K-ras activado e deficiência INK4A /Arf, utilizou-se vários métodos, tais como em tempo real de RT-PCR, o ensaio de transferência de western, imuno-histoquímica, ensaio de MTT, invasão, EMSA e ELISA. Descobrimos que a eliminação do INK4a /Arf no K-ras camundongos expressando

G12D leva a PDAC, que é em parte mediada através da ativação de Notch e vias de sinalização NF-kB. Além disso, encontramos a regulação negativa de miR-200 família, que também poderia desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral de PDAC nos ratinhos transgénicos compostos.

Conclusões /Significado

Nossos resultados sugerem que a activação de Notch e NF-kB em conjunto com a perda de miR-200 família é mecanisticamente ligada com o desenvolvimento e progressão de PDAC no composto K-ras

G12D e INK4A /Arf ratinhos transgénicos deficientes.

Citation: Wang Z, Banerjee S, Ahmad A, Li Y, Azmi AS, Gunn JR, et al. (2011) activados K-ras e INK4a /Arf Deficiência Cooperar durante o desenvolvimento do cancro do pâncreas pela ativação de Notch e NF-kB vias de sinalização. PLoS ONE 6 (6): e20537. doi: 10.1371 /journal.pone.0020537

editor: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de abril de 2011; Aceito: 02 de maio de 2011; Publicação: 03 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Cancer Institute, National Institutes of Health concede 5R01CA131151, 5R01CA131151-S02, e 5R01CA132794 (FH Sarkar) e CA-075059 para M. Korc. Os autores agradecem Puschelberg e Guido bases para a sua contribuição financeira generosa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é uma doença maligna altamente agressivo, que é classificada como a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer com uma sobrevida mediana de 6 meses, e com uma estimativa de 43.140 novos casos diagnosticados e um aproximadamente 36.800 mortes nos Estados Unidos em 2010 [1]. Foi aceite que o desenvolvimento da PDAC ocorre através da progressão de lesões precursoras, tais como neoplasias pancreáticas intraepiteliais (pancreáticas intraepiteliais), variando de PanINs de baixo grau (PanIN-1A, PanIN-1B) para PanINs de alto grau (PanIN-2, PanIN-3) [2], [3]. PDAC tem sido mostrado ter a progressão molecular de várias etapas incluindo alta frequência de mutações de activação K-ras e subsequente inactivação de p16

INK4A, p53, SMAD4, p14ARF supressores de tumores e outras anormalidades genéticas adicionais em modelos de ratinho [4] – [ ,,,0],6] e no humano [7]. A mutação K-ras mais comum em PDAC humana está no codão 12 (Kras

G12D), a qual está relacionada com a activação da actividade de GTPase. Portanto, vários modelos de rato de PDAC ter sido gerado por uma segmentação condicionalmente mutadas K-ras

G12D para recapitular a progressão da PDAC [8] – [12]. Um modelo de rato composto contendo K-ras activadas e deficiência INK4a /Arf mostrou a cooperar na produção metastático PDAC [13], [14]. No entanto, o mecanismo (s) molecular pelo qual K-ras activado e deficiência INK4A /Arf contribuem para a agressividade PDAC não foi totalmente elucidado.

Nos últimos anos, muitas vias de sinalização, incluindo via de Notch foram investigados e encontrou a desempenhar papéis importantes na PDAC [15]. sinalização Notch tem funções críticas sobre o controle do crescimento celular, diferenciação, apoptose, migração, invasão e metástase em PDAC [16]. genes Notch codificam proteínas que podem ser activadas através da interacção com uma família de seus ligandos. Até o momento, quatro receptores Notch (Notch1-4) e cinco ligantes (DLL-1, Dll-3, Dll-4, Jagged-1, Jagged-2) foram identificados [17]. Curiosamente, foi relatado que a função de sinalização de Notch na tumorigénese pode ser oncogénico ou oncosuppressive, e a função é também dependente na PDAC [18] contexto, [19]. sinalização Notch é frequentemente desregulado com expressão regulada para cima de receptores Notch e seus ligantes na PDAC [20]. Mostrámos que a sub-regulação de Notch-1 utilizando siRNA específica foi correlacionada com a diminuição das taxas de proliferação, um aumento da apoptose, migração reduzida, e diminuiu propriedades invasivas das células cancerígenas pancreáticas [21], [22]. Recentemente, verificou-se que a sinalização Notch activo pode sinergizar com K-ras em PanIN iniciação e progressão para adenocarcinoma invasivo [8], [23]. A inibição da via de sinalização Notch resultou na inibição de progressão tumoral num modelo de ratinho (K-ras, p53 G /+ ratinhos) de PDAC [24]. Mais recentemente, Mazur et ai. descobriu que a deficiência de Notch-2 pára a progressão PanIN, prolongar a sobrevivência através da inibição da Myc sinalização no K-ras-driven carcinogênese pancreática [25]. Surpreendentemente, Notch-1 foi recentemente encontrado como um supressor de tumor em um modelo de induzida por K-ras PDAC [18], o que sugere que são necessários estudos suplementares para determinar o papel do Notch em PDAC.

caminho do entalhe tem sido relatada a conversa cruzada com NF-kB, um dos principais factores de transcrição associada com o crescimento celular e vias reguladoras apoptóticas no cancro pancreático. Estudos do nosso grupo revelou que a sinalização de Notch pode induzir actividade de NF-kB em cancro pancreático [21]. Recentemente, foi demonstrado que a via de NF-kB é necessário para o desenvolvimento de tumores num modelo de ratinho (K-ras, p53 G /G ratinhos) de adenocarcinoma pulmonar [26]. Além disso, verificou-se que a deleção genética da subunidade p65 de NF-kB num modelo de ratinho do cancro do pulmão induzida por K-ras reduzida tumorigénese pulmão na presença e na ausência do supressor tumoral p53 [27]. No entanto, é em grande parte incerto se NF-kB é necessário para a K-ras-induzida progressão PDAC.

No presente estudo, avaliou-se as alterações moleculares em tumores de ratos desenvolvidos em ratinhos transgénicos composto com K- activada ras e INK4a /deficiência Arf. Aqui, demonstramos pela primeira vez, que a supressão da INK4A /Arf em K-ras expressando ratinhos leva a PDAC, que é em parte mediada através da activação de Notch e vias de sinalização de NF-kB. Além disso, foram encontradas alterações na expressão da família miR-200, que também poderia desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral de PDAC em ratinhos transgénicos composto com K-ras activadas e deficiência INK4a /Arf.

Resultados

via de sinalização Notch é altamente expressa em Pdx1-Cre; LSL-K-ras

G12D; INK4a /Arf rato

Para delinear o papel mecanicista do K-ras mutantes no desenvolvimento e progressão do PDAC, avaliamos a expressão da via Notch no modelo murino. Neste modelo, K-ras oncogénicas (Kras

G12D) é batido-in no seu próprio local e transcricionalmente silenciados devido à inserção de um elemento-LoxP-Stop LoxP (LSV). Quando LSL- Kras

ratinhos G12D são criados com ratinhos transgénicos que expressem a recombinase Cre sob o controle do promotor Pdx1, expressão da recombinase Cre em células progenitoras pancreáticas permite a remoção da cassete de transcrição PARAR floxed, que conduz à activação do oncogénico K-ras alelo. Neste modelo, não havia nenhum tumor facilmente encontrados até 30 semanas de idade em LSL- K-ras

G12D; Pdx1-Cre (chamado KC neste manuscrito) ratos, de acordo com estudo anterior [13]. Nós também não encontrou nenhuma evidência de PDAC no INK4a /Arf; Pdx1-Cre (chamado IC neste manuscrito) animais até a idade de 24 semanas, semelhante à observação documentada por outros grupos [13]. No entanto, todos os 25 camundongos de LSL- K-ras

G12D; Pdx1-Cre; INK4a /Arf (chamado KCI para este manuscrito) grupo foram encontrados para ter tumores pancreáticos que variam de diâmetro de 4 a 10 mm entre 45 a 80 dias (Fig. 1A). O composto ratos KCI com tumores se tornou moribunda (Fig. 1A, curva de sobrevivência). Os tumores foram confirmadas por exame histopatológico (Fig. 1B). O Ki-67, um marcador de proliferação conhecido, foi altamente expressa em tumores pancreáticos KCI (Fig. 1B). Tem sido relatado que a via de sinalização Notch tem um papel crítico no desenvolvimento e progressão do cancro pancreático. Portanto, avaliou-se a expressão dos genes Notch nestes tecidos ratinhos transgénicos. É importante notar que, concentramos nossos estudos sobre a Notch clivado porque é a forma funcional activa de Notch. Portanto, Notch em nossas todas as lendas figura significa Notch clivada ativa. Descobrimos que a sinalização de Notch foi activada nos tumores dos ratinhos KCl, quando comparado com o pâncreas de ratos KC e IC, respectivamente (Fig. 1C, D). A expressão de Notch-2 e Notch-4 foi regulada tanto a níveis de mRNA e proteína em camundongos KCI. No entanto, Notch-1 expressão não mostrou nenhuma mudança e Notch-3 expressão foi aumentado apenas no nível de ARNm nos tumores dos ratinhos KCI, sugerindo que os papéis de Notch-2, e Notch-4 podem ser mais importante na progressão do cancro pancreático. Nós também descobrimos que todos os cinco ligantes Notch foram up-regulada nos tumores derivados dos ratos KCI (Fig. 2A, B). Para confirmar estes resultados, avaliamos a expressão de genes a jusante Notch como Hes-1 e Hey-1. Descobrimos que a expressão de HES-1 e Ei-1 foi aumentada nos tumores dos ratinhos KCI (Fig. 2A, B), que se esperava com base na expressão sobre-regulada de Notch-2, Notch-4 e os seus ligandos.

a, Top painel esquerdo: incidência de tumores em camundongos KCI (N 25). Os ratinhos de controlo: ratos KC e IC. Painel superior direito: Tempo médio de tumores em camundongos KCI (N 20). Painel inferior: Kaplan-Meier curva de sobrevivência livre de tumor de pâncreas de ratos KCI e animais de controlo. Os ratinhos de controlo: combinações de ratos KC e IC. B, Painel superior: O exame microscópico de tumores derivados dos ratos KCI compostas por células que estão se formando dutos em locais (setas vermelhas). As células tumorais são focalmente em folhas. As células são grandes, altamente atípica, com grandes núcleos pleomórficos e proeminente 2-3 nucléolos (setas amarelas) por célula. O citoplasma é eosinofílica com inclusões eosinofílicas pálidas (setas verdes) em algumas células dando uma característica rabdóide para as células. Circundante estroma mostra células fusiformes com núcleos alongados (setas pretas) e infiltrado inflamatório espalhados compreendendo de neutrófilos, linfócitos e algumas células plasmáticas. Painel inferior: Ki-67 foi altamente expressa em tumores obtidos a partir de ratinhos KCI como avaliado por imuno-histoquímica. C, via de sinalização Notch foi regulada ao nível de ARNm tal como avaliado por em tempo real de RT-PCR em tumores derivados de ratinhos KCI. D, via Notch foi altamente expresso em tumores derivados de camundongos KCI como avaliado por análise de western blot e imunohistoquímica, respectivamente.

A, A expressão de ligantes Notch e Notch genes a jusante foi aumentada a nível mRNA tal como avaliado por em tempo real de RT-PCR em tumores derivados de ratinhos KCI. B, A expressão de ligandos de Notch e Notch genes a jusante foi altamente expressa em tumores derivados de ratinhos KCI como avaliado por análise de transferência de Western. C, actividade de p65 de NF-kB foi aumentada em tumores derivados de ratinhos KCI por ELISA. D, painel esquerdo, a actividade de ligação do ADN p65 de NF-kB é aumentada em tumores derivados de ratinhos KCI como avaliado por EMSA. Painel da direita, fosfo-p65 foi altamente expressa em tumores obtidos a partir de ratinhos KCI como avaliado por imuno-histoquímica.

actividade de ligação a ADN de NF-kB foi activado em KCl ratinhos tecido

NF- kB tem sido relatada a cross-talk com via Notch [28]. Temos relatado anteriormente que a Notch-1 pode regular positivamente a actividade de ligação de NF-kB de ADN em cancro pancreático [22]. Por isso, nós investigamos se a efeito a jusante de Notch-se-regulação pode ser mecanisticamente associadas com a activação de NF-kB via nos tumores destes animais. É bem sabido que a família NF-kB é composta de homo- e heterodímeros de proteínas Rel; NF-κB1 (p50); NF-kB (p52), RELA (p65), RelB, e c-Rel (Rel). NF-kB (p50 /p65) é um heterodímero ubíqua, constitutiva e induzível. Em geral, a actividade de ligação a ADN de NF-kB, tradicionalmente, refere-se ao p50 /p65 (p50 /RelA) heterodímero-mediada de ligação ao ADN, e é um regulador conhecido da sobrevivência das células e sinalização anti-apoptose. No núcleo, a subunidade p65 de NF-kB é um forte activador de uma vasta variedade de genes; Portanto, avaliamos a expressão nuclear da proteína p65 por imuno-histoquímica. As proteínas nucleares de tumores obtidos a partir de ratinhos transgénicos foram também submetidos a NF-kB p65 ELISA, e a actividade de NF-kB p65 de ligação ao ADN como medido por EMSA. Os resultados mostraram que a actividade de p65 de NF-kB como avaliado por ELISA, e a actividade de ligação do ADN de NF-kB p65 foi activada em tumores derivados de ratinhos KCI composto (Fig. 2C e D). Estes resultados mostraram um aumento da acumulação nuclear da p65 nos tumores dos ratinhos KCI, sugerindo que tanto a activação de K-ras e deficiência INK4A /Arf são necessárias para uma melhor activação do NF-kB. Além disso, a imunocoloração também mostrou que a fosfo-p65 foi altamente expressa no compartimento nuclear nos tecidos tumorais de murganhos KCI (Fig. 2D).

genes a jusante de NF-kB são activados em KCl ratinhos

tem sido relatado que a via de Notch estimula a actividade de NF-kB em células de cancro cervical pela associação com o signalosome IKK através IKKα [29]. estudo anterior mostrou que a via Notch regula a expressão IKKα em câncer pancreático [30]. Assim, investigou-se a expressão da proteína IKK nos tumores dos ratinhos KCI. Verificou-se que todos os membros da família, tais como IKK IKKα, IKKβ e IKKγ foram activados nos tumores dos ratinhos KCl (Fig. 3A). Para explorar ainda mais os efeitos da activação de NF-kB, foram examinados os níveis de expressão de certos genes alvo de NF-kB, incluindo a COX-2, ciclina D1, MMP-9, MMP-2, Bcl-2, c-myc, e survivina pela em tempo real de RT-PCR e western blotting, respectivamente, utilizando os tecidos de tumor obtidos a partir do composto de KCl animais transgénicos. Em tempo real de RT-PCR e análise de Western blot mostrou que a expressão destes genes foi activada nos tumores dos ratinhos KCI (fig. 3A, B). Nós também descobrimos que a expressão da STAT3 foi activada em tumores formar KCI ratinhos (dados não mostrados). É bem sabido que estes genes desempenham papéis críticos no crescimento celular, invasão e metástase. Portanto, estes resultados suportam ainda mais o papel do NF-kB em crescimento e progressão do tumor nos ratinhos KCI compostos.

a, análise de mancha de Western mostrando a expressão sobre-regulada de IKK, p65 e NF-kB jusante genes em tumores derivados de ratinhos KCI. B, em tempo real de RT-PCR que mostra o aumento da expressão de genes a jusante do NF-kB, tais como survivina, ciclina D1, Bcl-2, C-myc, MMP-2, MMP-9 e em tumores derivados de ratinhos KCI. C, A expressão da família de miR-200 foi regulada negativamente nos tumores dos ratos tal como avaliado por KCI em tempo real de RT-PCR. D, em tempo real de RT-PCR que mostra a diminuição da expressão de E-caderina, e o aumento da expressão de vimentina, e um modesto aumento na expressão de ZEB1 enquanto que um 30-vezes maior expressão de ZEB2 em tumores derivados de ratinhos KCI.

a família miRNA-200 foi regulada para baixo em KCI ratos

a família miR-200 foram encontrados para regular a via de sinalização Notch [31]. A família miR-200 tem cinco membros: miR-200a, miR-200b, miR-200C, miR-141 e miR-429. Descobrimos que a Notch-1 poderia ser um dos genes alvo da família de miR-200 (miR-200b, o miR-200 ° C), porque a sobre-expressão destes miARNs inibiu significativamente a Notch-1 expressão no cancro da próstata [31] e do cancro do pâncreas ( dados não publicados). Para abordar se a família de miR-200 está envolvida nos tumores dos ratinhos KCI que mostraram alta expressão de Notch (Notch-2 e 4) via de sinalização, foi investigada a expressão de miR-200 família. Como esperado, a expressão de miR-200a, 200b e miR-miR-200c foi significativamente reduzida nos tumores dos ratinhos KCI (Fig. 3C). Estes resultados sugerem que os tumores desenvolvidos nos ratinhos composto pode mostrar o comportamento agressivo como a aquisição de epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) fenótipo, e, assim, foi investigada adicionalmente a composição molecular dos tumores derivados do composto de KCl transgénico camundongos como detalhado abaixo.

Evidência de EMT fenótipo nos tumores derivados do composto de camundongos transgênicos KCI

recentemente, muitos estudos têm mostrado que a família miR-200 regula EMT, visando zinc-finger E -box homeobox 1 (ZEB1) e ZEB2 vinculativo. EMT é um processo pelo qual as células epiteliais sofrem mudanças morfológicas notáveis ​​caracterizados por uma transição de paralelepípedos fenótipo epitelial para o fenótipo fibroblástica alongado. Os nossos estudos anteriores mostraram que o miR-200a, miR-200b, 200c e miR-foram regulados negativamente em células de cancro do pâncreas gemcitabina-resistente, consistente com o fenótipo de EMT observado [32], [33]. Além disso, mostrámos que o miR-200 regula a expressão da família de ZEB1, lesma, E-caderina, e vimentina, e, portanto, sugerida a re-expressão de miR-200 podem ser úteis para a reversão do fenótipo de EMT-a- mesenquimais transição epitelial (tEM), que tem sido documentada em parte na nossa publicação recente [34]. Desde que encontramos baixa expressão da família miR-200 em tumores de camundongos KCI, foram avaliados os marcadores de EMT para investigar se os tumores nos ratos KCI sofreu EMT ou não. Encontrámos perda de expressão de E-caderina e elevada expressão de vimentina e ZEB2 nos tumores dos ratinhos KCI embora a expressão de ZEB1 mostrou aumento modesto (Fig. 3D), sugerindo que a expressão destes factores podem ser importantes para induzir EMT fenótipo em os tumores dos ratinhos KCI, que parece ser consistente com o comportamento agressivo dos tumores desenvolvidos no composto ratinhos transgénicos KCI.

a inibição da via de Notch causou crescimento das células cancerosas reduzida em uma linha de células de rato PDAC

Para avaliar melhor o papel potencial da via Notch em câncer pancreático, usamos Rink-1 linha de células que foi derivado de tecidos pancreáticos KCI e estudou os efeitos de inibidores da via Notch. Estudos anteriores demonstraram que as células Rink-1 exibiram um crescimento rápido

in vitro Comprar e formaram tumores em ratinhos nus [14]. Uma vez que a sinalização Notch é activada

através

a actividade de γ-secretase, de várias formas, incluindo inibidores γ -secretase DAPT e L-685.458 têm sido utilizados para inactivar o caminho do entalhe. Portanto, determinou-se a viabilidade celular de células de Rink-1 tratadas com GSI pelo ensaio de MTT, e os dados são apresentados na Figura 4A. O tratamento de células de Rink-1 durante 72 horas com DAPT, e L-685,458 resultou na inibição do crescimento celular. Para determinar qual o receptor de Notch pode ser um alvo terapêutico eficaz para o cancro pancreático, foi examinado o efeito de entalhe 1-4 siARN no crescimento celular das células de cancro do pâncreas. A eficácia do GSI e Notch siRNA para knockdown de proteína Notch foi confirmada através de transferência de Western. Observou-se que o nível de proteína Notch era dificilmente detectável em células GSI tratadas ou Notch siRNA transfectadas (Fig. 4B). Muito Curiosamente, apenas a inactivação do receptor de Notch único não inibiu significativamente o crescimento celular (Fig. 4A). Estes resultados sugerem que a inativação de múltiplos receptores Notch por GSI são boa maneira de tratar PDAC. Para confirmar esta conclusão, testou-se a expressão de genes alvo em células Rink Notch-1 tratadas com siRNA GSI ou entalhe. Porque o crescimento celular ligeiramente inibida única Notch-2 e Notch-4 siRNA, foi detectada a expressão de genes alvo em células Rink Notch-1 tratadas com estas duas ARNsi. Como se esperava, verificou-se que GSI inibiu a expressão de genes alvo Notch incluindo HES-1, Survivina, Bcl-2, c-myc, uPA a mais graus, em comparação com Notch-2 siRNA ou Notch-4 siARN transfecção (fig. 4C). Portanto, nós utilizamos GSI nas experiências seguintes. Em seguida, testou-se os efeitos do tratamento sobre a viabilidade celular pelo ensaio clonogénico. GSI tratamento resultou numa inibição significativa da formação de colónias de células de Rink-1 quando comparado com o controlo (Fig. 5A). No geral, os resultados do ensaio clonogénico foram consistentes com os dados de MTT, sugerindo que a inactivação da via de Notch pode inibir o crescimento celular de células de Rink-1.

A, painel esquerdo, a inibição de Rink-1 de crescimento de células por Notch 1-4 siARN testados por ensaio MTT. Os resultados foram representados como médias ± DP de três experiências separadas, tendo seis determinações por experiência para cada condição experimental. painel do meio e Direita: L-685,458 e DAPT foram inibidores y-secretase (GSI), que impedem a clivagem do receptor Notch, bloqueando a transdução de sinal Notch. GSI inibiu significativamente o crescimento de células Rink-1. As células foram semeadas em placas de 96 poços a 5000 células por cavidade e tratadas com GSI durante 72 horas. Após o tratamento, as densidades celulares foram determinadas por ensaio MTT. Cada valor representa a média ± DP (n = 6) de três experiências independentes. * P 0,05, comparado com o controlo. B, A expressão da via de Notch foi regulada para baixo na pista de células tratadas com 1 GSI ou transfectadas com ARNsi de Notch 1-4 tal como avaliado por análise de transferência de Western. C, a expressão de genes alvo Notch foi regulada para baixo na pista de células tratadas com 1 GSI ou transfectadas com Notch-2 siRNA ou Notch-4 siRNA como avaliado por como avaliado por em tempo real de RT-PCR.

A, Top, painel esquerdo: a sobrevivência celular de células Rink-1 tratados com GSI. As células tratadas com GSI durante 72 horas foram avaliadas pelo ensaio clonogénico. diferença fotomicrográfico na formação de colónias em células não tratadas e tratadas com GSI. Painel da direita: Houve uma redução significativa na formação de colónias em células de Rink-1 tratadas com GSI em comparação com células de controlo.

P

valores representam comparações entre as células tratadas com GSI e controle usando o

t

pareado. Inferior, Painel esquerdo: Caracterização de apoptose foi realizada depois iodeto de propídio (PI) e coloração de anexina V-FITC com kit de detecção de apoptose seguido por análise de citometria de fluxo após 48 h de tratamento GSI de células Rink-1. A percentagem de células apoptóticas aumentou de 10% no controlo para 28-33% em células tratadas GSI. Painel direito: GSI induziu apoptose em células de Rink-1. células de Rink-1 foram expostas a GSI durante 72 horas. A apoptose foi medida por ELISA de ADN histona. Os valores são registados como média ± DP. * P 0,05, comparado com o controlo. B, Top, painel esquerdo, ensaio de invasão usando GSI células mostrando baixa penetração das células através da membrana Matrigel-revestidas tratados, em comparação com células de controlo. Painel da direita: Os gráficos que mostram o valor de fluorescência a partir das células de Rink-1 invadidas. Os valores indicam a quantidade comparativa de células Rink-1 invadidas. Inferior, ensaio de cicatrização da ferida foi realizado para avaliar a capacidade de migração celular. GSI tratamento diminuiu a migração celular em células de Rink-1. C, GSI inibiu a actividade de ligação a ADN de NF-kB em células de Rink-1 conforme avaliado por EMSA. D, em tempo real A análise de Western blot e RT-PCR mostrou que a L-685,458 inibiu a expressão de Survivina, c-myc, Bcl-2, e os genes uPA.

A inibição da via de Notch causado por apoptose morte celular na linha celular de Rink-1