Abstract

A genisteína (GEN) é uma isoflavona derivado de plantas e podem bloquear o crescimento celular descontrolado em cancro do cólon por inibição da via de sinalização Wnt. Este estudo teve como objetivo testar a hipótese de que a expressão gênica aumentada da sinalização Wnt antagonista do caminho, DKK1 por tratamento genisteína está associado a modificações epigenéticas do gene em células cancerígenas do cólon. A genisteína tratamento induziu uma prisão fase G2 dependente da concentração na linha celular de cancro do cólon humano SW480 e proliferação celular reduzida. Os resultados de várias outras linhas celulares de cancro do cólon humano confirmaram os efeitos inibidores do crescimento de genisteína. Superexpressão de DKK1 confirmou a sua participação na inibição do crescimento. Knockdown de expressão DKK1 por siRNA induzida ligeiramente o crescimento celular. a expressão do gene DKK1 foi aumentada em genisteína em SW480 e HCT15 células. A metilação do DNA no promotor DKK1 não foi afectada pelo tratamento com genisteína em todas as linhas celulares testadas. Por outro lado, a genisteína induzida histona H3 acetilação da região promotora do DKK1 em células SW480 e HCT15. Isto indica que o aumento da acetilação de histona está associada com a expressão induzida pelo DKK1 genisteína. A associação entre a acetilação de histonas e a expressão do gene DKK1 é confirmado pelo inibidor de histona desacetilase tricostatina A tratamento (TSA). Em conclusão, o tratamento genisteína diminui o crescimento e proliferação celular em linhas celulares de cancro do cólon. O efeito está associado com a expressão aumentada de DKK1 através da indução de acetilação da histona na região promotora DKK1

citação:. Wang H, Li Q, Chen H (2012) A genisteína afeta histona Modificações na proteína Dickkopf-1 relacionadas (DKK1) Gene na linha celular de cancro do cólon humano SW480. PLoS ONE 7 (7): e40955. doi: 10.1371 /journal.pone.0040955

editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de março de 2012; Aceito: 15 de junho de 2012; Publicação: 18 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado em parte por uma concessão do NIH /NCI para HC (CA135262) ​​e da Associação de soja Illinois. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a soja contém vários componentes bioativos, que receberam muita atenção na sua capacidade potencial para reduzir o risco de câncer [1], [2]. Estudos epidemiológicos mostraram que o consumo de níveis mais elevados de produtos de soja na dieta contribui para a menor incidência de cancro colorrectal nos países asiáticos [3], [4], [5]. Especificamente, a genisteína (4, 5, 7-trihidroxi-isoflavona), uma isoflavona na soja natural abundante, foi mostrado para reduzir o risco de cancro colo-rectal [6], [7]. Estes estudos fornecem fortes evidências para a necessidade de investigar mais profundamente os mecanismos por trás potencial anticancerígeno de genisteína.

Em estudos de cultura de células, a genisteína foi relatado para alterar a fisiologia da célula em várias linhas celulares de cancro do cólon. Um estudo recente realizado por Fan et ai. identificou-se que células cancerígenas do cólon tinha mudado morfologia, incluindo a condensação da cromatina e fragmentação nuclear após o tratamento genisteína [8]. Além disso, as concentrações mais elevadas de genisteína de 10 mmol /L induziu significativamente a inibição da proliferação celular e fragmentação do ADN em uma linha de células do cólon humano [9]. Além disso, em linhas celulares de cancro do cólon de Caco-2 e SW620, a morte celular foi induzida pelo tratamento com extracto de soja [10]. Portanto, a genisteína está se tornando um composto promissor na prevenção e tratamento do cancro do cólon. No presente estudo, exploramos ainda mais as propriedades antitumorais de genisteína, testando a progressão do ciclo celular e a proliferação celular em várias células de cancro colorectal em resposta ao tratamento com concentrações crescentes de genisteína.

Vários caminhos e mecanismos têm sido propostos ser responsável pela capacidade da genisteína para reduzir o risco de câncer. sinalização de IGF-IR, a regulação Akt e crescimento celular estão associadas com os efeitos anti-tumorais da genisteína [9], [11]. Além disso, a genisteína também possui propriedades antioxidantes, imitando estrogénio através de estrogénio fosforilação mediada pelo receptor de ERK1 /2 e a activação do NFkB via [12] sinalização. Outros relatórios de estudos recentes em animais indicaram que a genisteína inibiu as células cancerosas hormônio-dependentes ou independentes de regulando as interações entre a vitamina D e receptor de estrógeno [13], [14], [15]. A genisteína regula a transcrição de genes em várias linhas celulares de cancro por regulamentos epigenéticas, por exemplo, metilação de DNA e histonas modificações [16], [17], [18]. A genisteína altera a metilação do DNA de vários genes em modelos de rato e de murganho [19], [20]. No entanto, os mecanismos subjacentes do papel de genisteína na proliferação celular ou apoptose durante a carcinogénese permanece pouco compreendido.

O Wingless-int (WNT) via de sinalização compreende um grande número de factores de crescimento que estão envolvidos na organogénese, proliferação, regeneração, determinação célula destino e adesão célula-célula [21], [22]. proteínas Wnt ligam-se a receptores Frizzled (Frz) e da proteína relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP) co-receptores, causando citosólica estabilização β-catenina e acumulação. Por conseguinte, aumenta nucleares β-catenina e complexos com os factores de transcrição TCF /LEF, que conduz ao aumento da transcrição de genes alvo, incluindo ciclina D1 [23]. sinalização Wnt aberrante é um dos contribuintes para a transição do epitélio do cólon normal a células de tumor maligno [24], [25]. A genisteína foi relatado recentemente para suprimir a sinalização WNT em linhas celulares de cancro do cólon [26], [27], que fornece um mecanismo potencial para a capacidade anticancerígena de genisteína.

Um dos principais reguladores da via de sinalização WNT é o seu antagonista Dickkopf 1 (DKK1). DKK1 impede a transdução de sinal mediada por β-catenina por ligação a LRP e proteínas Kremen, promovendo a diferenciação das células e a apoptose [28], [29], [30], [31], [32]. O silenciamento ou perda de DKK1 foi documentada em várias doenças. No cancro colorectal silenciados

DKK1

expressão está fortemente associado com instabilidade de microssatélites de subtipos de tumor [33]. Relata-se que a capacidade de supressão de tumor de DKK1 é reprimido pela hipermetilação do promotor em estágios avançados de cancro colorrectal [34]. Em células de carcinoma renal humano, quimicamente indução de acetilação de histonas no promotor DKK1 resultou na re-activação da expressão de DKK1, demonstrando que, para além da metilação do DNA, modificações cauda histona também pode contribuir para o controlo da transcrição de genes críticos relacionados com o desenvolvimento do cancro [ ,,,0],35].

no presente estudo, investigamos as propriedades anticancerígenas de genisteína, identificando os seus efeitos sobre a fisiologia da célula cancerosa e examinando a base mecanicista da

DKK1

ativação. Em particular, este estudo é um dos primeiros a vincular modificações epigenéticas mediada por genisteína de

DKK1

às propriedades anticancerígenas da genisteína no cancro colorectal.

Resultados

A genisteína Tratamento seletivamente induzida Gene Expression DKK1, mas não alterou DKK1 promotor padrões de metilação

Para investigar a correlação entre a metilação do DNA no

DKK1

promotor CpG ilha e o efeito do tratamento genisteína em

DKK1

expressão, em tempo real de RT-PCR foi realizada para medir

expressão

DKK1 mRNA e metilação de reacção em cadeia da polimerase específica (MSP) e sequenciação de bissulfito (BSF) do

DKK1 região promotora

foram realizadas para examinar o estado de metilação do promotor (Fig. 1). Primeiro,

expressão DKK1

gene foi analisada em linhas celulares de cancro do cólon disponíveis para investigar os efeitos do tratamento genisteína. Entre as linhas celulares testadas, SW480 e células HCT15 mostrou indução da expressão do gene DKK1 por genisteína (Fig. 1A). A análise da metilação do DNA na região promotora de

DKK1

confirmou que a expressão do gene DKK1 em geral está inversamente relacionada com o nível de metilação da região testada (-159 /+ 109, a Fig. 1B, 1C, 1D e) . Especificamente, RKO, SW48, e DLD-1 células exibiram muito alta, se não for completa, a metilação da região (Fig. 1C e 1D). Este hipermetilação está inversamente relacionada com o nível de expressão do gene DKK1 como mostrado na Fig. 1A. Para as linhas de células que expressam o DKK1-HCT15, HT29, SW480 e, não é a metilação do DNA mínima que se observa (Fig. 1C e 1D). Mais importante ainda, o tratamento genisteína não alterou a metilação de ADN da região promotora de

DKK1

em todas as linhas celulares testadas, independentemente do nível de metilação do DNA na região (Fig. 1C e 1D).

SW480, DLD-1, HCT15, HT29, RKO e SW48 foram tratadas com genisteína para 2 d antes da coleta da amostra para análise posterior. A) Expressão de ARNm de DKK1 Relativa. expressão de mRNA foi analisada por RT-PCR. Os dados foram normalizados para o controlo interno L7a. Três amostras de células independentes foram analisados ​​e apresentados como a média ± SEM. Os asteriscos (*) indicam significância estatística em relação ao controle na mesma linha celular (p 0,05). B) Desenho esquemático da região do promotor de DKK1. barra horizontal representa a ilha de CpG dentro da região do promotor. As barras verticais indicam os locais CpG individuais. pontas de setas pretas indicam as posições dos iniciadores utilizados para amplificações por PCR em bissulfito de Sequenciação (-159 a 109). As setas representam as posições dos iniciadores utilizados para amplificações por PCR em MSP (-60 + 73). C) MSP da região promotora do DKK1 em HCT15, HT29, RKO e SW48. Eixo Y representa o nível de metilação e os valores são calculados como percentagem de M /(M + UM). Quando não viu, barras de erro estão dentro das colunas. D) Bissulfito sequenciação da região promotora do DKK1 em SW480 e células DLD-1. Cada círculo aberto representa um C não metilado CpG dentro de um círculo a cheio, enquanto um representa um grupo C dentro de um metilado CpG. Cada linha de círculos representa um clone indivíduo utilizado para a sequenciação.

A genisteína dose e tempo-dependente Induzida Gene Expression DKK1

em tempo real RT-PCR foi realizada para medir

os níveis de expressão de ARNm de DKK1

em resposta a diferentes doses de genisteína e tempos de exposição. Em geral,

DKK1

expressão foi aumentado por genisteína de uma maneira dose-dependente (Fig. 2A). Após 2 d de tratamento genisteína,

expressão DKK1

ARNm foi de 3 vezes e oito vezes mais elevada após os tratamentos de 50 e 75 pmol /L de genisteína, respectivamente, quando comparado com o controlo não-genisteína (p 0,05, A Fig. 2A). O nível de ARNm de

DKK1

em células SW480 também foi aumentada por tratamento a genisteína (75 umol /L) de um modo dependente do tempo (Fig. 2B) e atingiu uma indução de 10 vezes em d 4, em comparação ao nível do controlo de DMSO.

células SW480

a) foram tratados por várias concentrações de genisteína durante 2 d. expressão de mRNA foi analisada por RT-PCR. Eixo X indica concentrações de genisteína e eixo y mostra o nível de expressão de mRNA relativo. Os dados foram normalizados para o controlo interno L7a. Asteriscos (*) indicam significância estatística em comparação com 0 mmol /L de genisteína (

p Art 0,05). B) Curso de tempo de

expressão DKK1

em SW480 após o tratamento genisteína. células SW480 foram tratadas com 75 mmol /L de genisteína e amostrados no dia 1, 2, 3 e 4 do tratamento. Os dados foram normalizados para o controlo interno L7a. Três experiências independentes foram realizados e apresentados como a média ± SEM. Onde invisível, as barras de erro são contidos nas barras. Os asteriscos (*) indicam significância estatística em comparação com um d de 75 umol /L de genisteína (

P

0,05). C) a expressão da proteína de DKK1. extractos de proteína de célula total foram recolhidos a partir de células SW480 e análise Western blot de DKK1 foi realizada como descrito em materiais e métodos. Uma mancha de análise ocidental é mostrado e a quantificação representa a média ± erro padrão de 3 amostras independentes. Actina foi utilizado como controlo de carga. Asteriscos (*) indicam significância estatística em relação ao controle 0 mmol /L de genisteína (

p Art 0,05).

A indução de

DKK1

foi confirmada por medir o seu nível de expressão de proteína em células SW480 (Fig. 2C). DKK1 expressão de proteína apresentou uma indução de 3 vezes por 75 umol /L de tratamento de genisteína em células SW480 após um tratamento de 4-d quando comparado com o controlo.

A genisteína a progressão do ciclo celular é inibido em células SW480

Para investigar o efeito da genisteína na progressão do ciclo celular de células SW480, o conteúdo em ADN das células SW480 foi medida por análise de ajuste área após a análise de citometria de fluxo. Os histogramas mostram que a população de células em G1 foi marcadamente reduzida em 75 mmol /L de tratamento de genisteína em comparação com o controlo não-genisteína, com uma redução de células na fase S (Fig. 3A). Por outro lado, o tratamento genisteína resultou numa acumulação de células na fase G2 /M em Células SW480.

SW480 células foram tratadas com várias concentrações de genisteína durante 2 d antes da recolha da amostra. A) histogramas de ADN representativos de tratamento genisteína de 0 e 75 mol /L por citometria de fluxo. Eixo dos Y representa o teor de ADN relativo e o eixo X mostra as fases do ciclo celular. B) a análise do ciclo celular das células tratadas genisteína. A percentagem de células em G1 (•), S (▴) ou G2 /M (▪) é mostrado. Os dados representam as médias ± SEM de três experiências independentes. C) Ensaio de proliferação de WST-1. WST-1 a partir de sinais de cada cavidade foi lida a 450 nm para absorvância contra um comprimento de onda de referência de 630 nm. A absorvância foi convertida em números de células actuais, utilizando um padrão gerado por diluições em série de um número conhecido de células. Três amostras de células independentes foram analisados ​​e apresentados como a média ± SEM. Os asteriscos (*) indicam significância estatística comparativamente com 0 umol /L de genisteína (

P

0,05).

Os efeitos da genisteína na progressão do ciclo celular foram ainda analisados ​​por tratamento de células com genisteína em concentrações de 1 a 75 nmol /L. Percentagem de células em diferentes fases foi calculado como a proporção de células fechadas para a população total de células. Genistein concentrações superiores a 5 umol /L aumentou a percentagem de células na fase G2 /M significativamente (p 0,05) com a maior acumulação observada a 75 umol /L de genisteína (p 0,05, Figura 3B.). Os resultados demonstram que a percentagem de células na fase G1 foi abolida após 75 umol /L de genisteína tratamento (Fig. 3B). A percentagem de células em fase S foi significativamente reduzida (p 0,05) a seguir 50 e 75 umol /L genisteína tratamentos após um aumento transitório de 25 umol /L de genisteína em comparação com o controlo não-genisteína. Tomados em conjunto, a progressão do ciclo celular em células SW480 foi regulada pela genisteína de uma forma dependente da dose.

A genisteína Proliferação celular inibido em SW480 e várias outras linhas de células de cancro do cólon

A proliferação celular foi testada através o ensaio de WST-1, o que mostrou que a genisteína tratamentos diminuiu o número de células de células SW480 de uma forma dependente da dose (Fig. 3C). A concentrações acima de genisteína número de células /L 15 umole foram significativamente diminuídos quando comparados com o controlo não-genisteína (p 0,05). Este efeito anti-proliferativo de genisteína foi confirmada em várias linhas celulares de cancro do cólon (Figura S1). O ensaio de iodeto de propídio mostrou-AnnexinV nenhuma mudança por qualquer um dos tratamentos genisteína, indicando que a genisteína não afecta a taxa de apoptose (dados não apresentados). Estes resultados indicam que o crescimento de supressão efeito da genisteína é generalizável às linhas humanas comuns de células de câncer de cólon.

A ciclina D1 mRNA Expression Diminuição seguinte genisteína Tratamento em Células SW480

genes controle do ciclo celular

p21

,

a ciclina D1

e

c-MYC

são altamente correlacionados com a regulação do crescimento celular. Com base nos dados apresentados acima, a paragem do ciclo celular em G2 ocorreu em células SW480 por tratamento genisteína. Para investigar mais profundamente os efeitos da genisteína na progressão do ciclo celular, a expressão de ARNm de genes de controlo do ciclo celular in

p21

,

Ciclina D1 e

c-myc foram medidos por

em tempo real de RT-PCR. Os nossos resultados mostraram que a expressão de

Ciclina D1

foi reduzida significativamente (p 0,05) por 50 e 75 umol /L de genisteína em comparação com o controlo (Figura 4, p. 0,05). A expressão de

p21

e

c-MYC

não foi afetada por nenhum dos tratamentos genisteína. A expressão diminuída de

Ciclina D1

está de acordo com os dados do ciclo celular da citometria de fluxo que mostra que a progressão do ciclo celular foi inibida por tratamento de genisteína.

SW480 células foram tratadas com 0, 1, 5 , 15, 25, 50 ou 75 umol /L de genisteína durante 2 d. Os níveis de expressão de ARNm de

p21, a ciclina D1

e

C-MYC

foram medidas por RT-PCR. L7a foi usado como controlo interno. Três experiências independentes foi analisado e apresentados como a média ± SEM. Asteriscos (*) indicam significância estatística em relação ao controle, 0 mmol /L de genisteína (

p Art 0,05).

A superexpressão de DKK1 inibido a progressão do ciclo celular e proliferação celular em SW480 células

Para investigar o papel potencial dos

DKK1

na progressão do ciclo celular, SW480 células foram transfectadas com um plasmídeo pCMV-XL5 contendo humana

DKK1

. A sobre-expressão de

DKK1

foi confirmada por análise de RT-PCR de mRNA e análise por Western blot de proteínas (Fig. 5A e 5B). Análise de

Ciclina D1

expressão mostraram que a sobre-expressão de DKK1 induzida semelhante a repressão da expressão génica como a genisteína tratamento (Fig. 5A). A sobre-expressão de

DKK1

aumentou significativamente a percentagem de células na fase G2 /M, quando comparado com o controlo de vector (p. 0,05, figura 5C), apesar de a um menor grau comparado com o tratamento de genisteína. Enquanto isso, a percentagem de células na fase G1 foi significativamente diminuída em células que sobre-expressam o DKK1 (p 0,05), e não houve alteração significativa no número de células na fase S. Os resultados do ensaio de WST-1 mostrou que a sobre-expressão de

DKK1

diminuiu a proliferação de células SW480, embora em muito menor grau, em relação ao tratamento de genisteína (p 0,05, Figura 5D.). Em geral, a sobre-expressão de

DKK1

produziu efeitos semelhantes na inibição da progressão de células e proliferação de células, como fez o tratamento genisteína, sugerindo um papel de DKK1 nestes eventos celulares.

pCMV vector contendo humana

gene DKK1

foi usado para transfectar células antes da coleta de amostra para análise. Vazio vector pCMV foi utilizado como controlo para as experiências superexpressão. Três amostras de células independentes foram analisados ​​e apresentados como a média ± SEM. A) a expressão do mRNA de

DKK1

e

A ciclina D1

em regular e

DKK1

-transfected SW480 células. A expressão de mRNA foi analisada por RT-PCR. Os dados foram normalizados para o controlo interno L7a. B) a expressão da proteína DKK1 em células normais e células SW480 transfectadas. extractos de proteína de célula total foram recolhidos a partir de células SW480 transfectadas e análise Western blot de DKK1 foi realizada como descrito em materiais e métodos. Um blot representativo é mostrado e a quantificação representa a média ± SEM de 3 pratos independentes. Actina foi utilizado como controlo de carga. C) a análise do ciclo celular de regular e

DKK1

-transfected SW480 células. O resultado foi obtido por citometria de fluxo. Eixo Y representa% de células fechadas e X-eixo mostra diferentes fases do ciclo celular, incluindo G1, S e G2 /M. D) ensaio de proliferação de WST-1 em vectores e

DKK1

-transfected SW480 células. sinais de WST-1 foram convertidos para os números de células actuais, utilizando um padrão gerado por diluições em série de um número conhecido de células. Os dados foram normalizados para controlar para o tratamento de genisteína e DKK1 vector para a transfecção, respectivamente. Asteriscos (*) indicam significância estatística em comparação com o respectivo grupo de controlo (genisteína para controlar; DKK1 ao vetor;

p Art 0,05). Para o knockdown de DKK1, ARNic em cadeia dupla contra gene DKK1 humano foram transfectados em células SW480. mexidos sequências foram utilizados como ARNsi de controlo. E) a expressão do mRNA de

DKK1

e

A ciclina D1

no controle siRNA (N si /S) e

DKK1

siRNA (si DKK1) tenha sido tratada com SW480 células de controle e tratamentos genisteína. A expressão de mRNA foi analisada por RT-PCR. Os dados foram normalizados para o controlo interno L7a. F) ensaio de proliferação de WST-1 no controle siRNA e células

DKK1

siRNA SW480. sinais de WST-1 foram convertidos para os números de células actuais, utilizando um padrão gerado por diluições em série de um número conhecido de células. Asteriscos (*) indicam significância estatística em relação ao controle de 0 mmol /L de genisteína (

p Art 0,05). O suporte indica diferença estatística entre os grupos N /S si e si DKK1 tratados com genistein (p = 0,002).

Knockdown de DKK1 em Células SW480 parcialmente revertida a mudanças do perfil celular causado pela genisteína Tratamento

Para investigar se a alteração das propriedades celulares de SW480 causados ​​pela genisteína é dependente do

DKK1

expressão do gene, siRNA alvejando DKK1 foi transfectado em células SW480, seguido de tratamento genisteína. Em tempo real de RT-PCR mostrou que siRNA eficazmente reduzida expressão DKK1 em SW480 em ambos os tratamentos de controlo e de genisteína (p 0,05., Figura 5E). Além disso, a redução de

Ciclina D1

expressão de ARNm por tratamento genisteína como observado em células não-específicas tratadas com siRNA (N /S SI) foi abolido por o knockdown de DKK1 (DKK1 Si, a Fig. 5E). Entretanto, embora o efeito inibidor do crescimento de genisteína é observada em ambos N /S siRNA e

grupos DKK1

siRNA, knockdown de DKK1 aumentou significativamente a proliferação de células SW480 em comparação com o de ARNsi de controlo no tratamento de genisteína (p .. 0,05, DKK1 siRNA vs N /S siRNA em tratamentos de genisteína, Fig 5F)

a genisteína Induced acetilação das histonas dentro do gene DKK1 em SW480 e HCT15 Cells

chip foi realizada para analisar o estrutura da cromatina no promotor (-96 /-28), codificação (+ 635 /+ 742) e 5 ‘regiões de controlo a montante (-2781 /-2713) do

DKK1

gene (Fig. 6A) . região de controlo a montante de 5 ‘foi usado como um controlo negativo para mostrar a região inactivo relativa durante a transcrição. As células DLD-1 foram utilizados como um controlo negativo para mostrar o estado da cromatina quando o

expressão do gene DKK1

é silenciado e não responsivos ao tratamento genisteína. IgG de coelho normal foi utilizado como um anticorpo de controlo interno e ligação de qualquer ADN similar à ligação em IgG de controlo foi considerada não específica. O aumento da ARN polimerase II (polii) de ligação na

DKK1 e região promotora indicado aumento da transcrição da

DKK1

gene em células SW480, em resposta a genisteína (p 0,05, Figura 6B.). Em contraste, houve polii mínimas de ligação dentro dos

DKK1

de genes em células DLD-1, confirmando a transcrição silenciado do gene em células DLD-1 (Fig. 6B).

A) Um desenho esquemático do

gene DKK1

. setas pretas representam os iniciadores utilizados para PCR para testar três regiões no ensaio Chip: promotor, codificação e controle a montante 5 ‘. caixas cheias representam exons do

DKK1

gene, enquanto a caixa aberta representa o

DKK1

promotor. linhas pretas representam íntrons. B) Análise ChIP da abundância relativa de proteína dentro de diferentes regiões do

DKK1 gene

em SW480 e células DLD-1. ADN imunoprecipitado foi analisada por PCR em tempo real. Os anticorpos específicos utilizados para imunoprecipitação são rotulados no eixo-x. A IgG de coelho não específica foi utilizado como controlo negativo. Os dados foram representados graficamente como a razão com o valor de 25% de ADN de entrada. Três experiências independentes foram analisados ​​e apresentados como a média ± SEM. Os asteriscos (*) indicam significância estatística em comparação com o controlo utilizando o mesmo anticorpo na linha celular (p 0,05).

Para determinar se o aumento do nível de transcrição do

DKK1

gene em resposta a genisteína foi modulado por alterações da estrutura da cromatina, anticorpos contra histonas acetiladas, metilados, ou fosforilados foram utilizados no ensaio de chip. histonas modificações nas três regiões representativas da

DKK1

gene foram examinados pela primeira vez em células SW480 após o tratamento genisteína, utilizando células DLD-1 como controlo negativo. Aumentos na histona H3 acetilada no promotor e regiões de

codificação DKK1

foram observados em células SW480 após o tratamento genisteína (p . 0,05, Fig 6B, H3Ac), sem acetilação significativa das histonas em células DLD-1 antes ou depois do tratamento de genisteína (Fig. 6B). A abundância de outro histona acetilada testado, a histona H4 acetilada, não foi afetada pelo tratamento genisteína tanto em linhas celulares (H4Ac). Embora houvesse um nível muito mais elevado de dimetil histona H3 lisina 4 em células SW480 em comparação com as células DLD-1, o tratamento genisteína não afectou o estado de metilação deste resíduo histona H3 (Fig. 6B, H3K4Me2). A fosforilação da histona H3 na serina 10 também foi investigado e os resultados mostraram que houve uma redução modesta em várias regiões do

gene DKK1

por tratamento genisteína em todas as linhas celulares testadas (p . 0,05, Fig 6B, H3S10p). Em resumo, a transcrição activa da

DKK1

gene foi associado com o aumento da acetilação de histona H3 na sua região do gene, o que provavelmente resultou no recrutamento de polii ao seu promotor.

DKK1 mRNA Expression foi induzida através da desacetilase de histona (HDAC) em células SW480

TSA é um inibidor da histona-desacetilase (HDAC) que interage com a maioria dos membros da família de HDAC e induz a acetilação das histonas. Para confirmar os efeitos de acetilação da histona induzida por genisteína em

DKK1

transcrição, que tratado com células SW480 de uma série de concentrações de TSA e comparados os resultados para o tratamento de genisteína. A expressão de ARNm de

DKK1

foi aumentada de forma significativa pelo tratamento com TSA de uma forma dependente da dose, semelhante ao resultado observado de genisteína tratamento (p . 0,05, Fig 7).

nível

DKK1 mRNA foi analisada em células SW480 tratados com 50, 100 ou 200 nmol /L de TSA (TSA50, TSA100, e TSA200, respectivamente) durante 1 d. A genisteína tratamento foi realizado como previamente descrito. nível de expressão de mRNA foi analisada por RT-PCR. Três amostras de células independentes foram analisados ​​e apresentados como a média ± SEM. Valores com letras diferentes diferem (

p Art 0,05).

Discussão

O presente estudo destina-se a identificar os potenciais mecanismos dos efeitos antitumorais de genisteína. Observou-se que tanto os níveis de mRNA e de proteína de DKK1 foram regulada pelo tratamento genisteína. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com genisteína induzida paragem do ciclo celular e proliferação celular inibida em células cancerígenas do cólon SW480. Isso foi mais tarde confirmada em várias outras linhas celulares de cancro do cólon. Tanto a sobre-expressão e knockdown de

DKK1

confirmou o envolvimento de DKK1 na inibição da progressão do ciclo celular e a proliferação celular. O nosso resultado demonstrou que a expressão aumentada de DKK1 pode ser uma das razões que causaram a paragem do ciclo celular e inibição da proliferação celular por meio do tratamento de genisteína. Além disso, a comparação entre as células

DKK1

-expressing incluindo HCT15, HT29 e SW480 e os

DKK1

-repressed células, incluindo RKO, SW48 e DLD-1 mostrou que a transcrição do gene da

DKK1

é inversamente proporcional ao seu estatuto de metilação do promotor. O genisteína não afeta a metilação do DNA do

DKK1

promotor. Por outro lado e, mais importante, temos feito a observação de que a genisteína induz acetilação das histonas dentro do

gene DKK1

e isso está correlacionada com a ativação de sua transcrição de genes.

Os papéis anticancerígenos de genisteína, incluindo a promoção de apoptose, a inibição da progressão do ciclo celular, a proliferação celular e a invasão, o bloqueio da angiogénese e metástases em vários tipos de cancros têm sido bem documentadas [7], [36], [37], [38]. Os mecanismos moleculares subjacentes a estas funções anticancerígenos de genisteína incluem modulações de inibidores do ciclo celular, a regulação de genes relacionados com apoptose, assim como a inibição de IGF-IR e PI3K /AKT de sinalização [11], [39], [40], [41]. Trabalho pelo nosso grupo demonstrou que a genisteína inibe outra via crítico no desenvolvimento do cancro do cólon, da via Wnt /β-catenina, por interferir com a metilação do promotor de genes específicos. Especificamente, induzida genisteína

Wnt5a

expressão por diminuição da metilação dentro da região do promotor do gene de [27]. A genisteína também inibida a via /β-catenina WNT ativando outro antagonista de WNT,

sFRP2

, por desmetilação de ilhas de CpG dentro do gene [26]. O presente estudo permitiu aprofundar o conhecimento para incluir DKK1 como outro fator na sinalização WNT que medeia a resposta do tratamento genisteína. Como um repressor de crescimento de células de cancro, é um principal DKK1 antagonista que interfere com a via Wnt e regula negativamente a expressão de genes alvo a jusante, incluindo ciclina D1 [28], [42], [43].

A expressão de DKK1 foi silenciado por hipermetilação do promotor em estágio avançado de câncer de cólon (Dukes ‘C e D) [34]. Na linha de células DLD-1 de Dukes ‘C, uma fase mais avançada de cancro do cólon, a desmetilação do gene DKK1 por 5-aza-2’-desoxicitidina, um inibidor DNMT, re-activada expressão DKK1 [34], [44] . Dado que a genisteína tem sido mostrado para activar genes através de desmetilação de CpG [19], que primeiro testada a possibilidade de DKK1 promotor desmetilação por genisteína. O nosso resultado confirmou que o nível de metilação na ilha CpG do promotor está inversamente relacionado com a expressão do gene de DKK1. Nas linhas de células com a região do promotor hipermetilado, incluindo DLD-1, RKO, e SW48, foi mínimo não se silenciados expressão do gene DKK1. Além disso, o tratamento genisteína não alterou a hipermetilação da região nestas células, nem induzir qualquer expressão do gene. Por outro lado, o DKK1 estava não metilado na fase precoce do cancro do cólon (Dukes B) e linhas de células relacionadas, incluindo SW480 [34] e HCT15. Ambos MSP e sequenciação bissulfito confirmou que a metilação do ADN foi muito pouco, se algum, nas linhas celulares. Além disso, a hipometilação não é alterada pelo tratamento genisteína. Portanto, a desmetilação de ADN foi excluída como um mecanismo para a indução da expressão do gene DKK1 por genisteína nestas linhas celulares.

Tem sido relatado que a genisteína também modula outros marcadores epigenética a nível da cromatina [16], [45 ], [46].