Abstract

fosforilados são biomarcadores da fisiopatologia e resistência à terapia do câncer, mas porque analitos Fosfoproteína são muitas vezes instáveis, práticas de laboratório clínico mal controlados podia evitar que a tradução dos resultados da investigação nesta área a partir da bancada à cabeceira. Por isso, em comparação múltipla biomarcador e fosfoproteína imuno-histoquímica (IHQ) resulta em 23 amostras de carcinoma colorectal clínicos após quer um romance, rápida protocolo de fixação do tecido ou um protocolo de fixação do tecido padrão utilizado pelos laboratórios clínicos, e nós também investigou o efeito de um definidos pós-operatório período de isquemia “frio” nesses resultados IHC. Descobrimos que um intervalo de isquemia fria de uma hora, permitiu por orientações ASCO /CAP para certos ensaios de biomarcadores do cancro, é altamente nocivos para certos analitos fosfoproteína, especificamente o receptor do factor de crescimento epidérmico fosforilado (pEGFR), mas intervalos isquémicos mais curtos (menos do que 17 minutos) facilitar a preservação de fosfoproteínas. Em segundo lugar, verificou-se que uma rápida 4 horas, dois temperatura, a fixação de formalina produziu coloração superior em vários casos com SELECT marcadores (pEGFR, pBAD, PAKT) em comparação com um protocolo padrão durante a noite fixação temperatura ambiente, apesar de ter menos tempo. Estes resultados indicam que os futuros de pesquisa e clínicos utilitários de fosfoproteína IHC para avaliar colorectal carcinoma fisiopatologia absolutamente dependem atenção aos fatores pré-analíticos e protocolos de fixação tecidual rigorosamente controlados

Citation:. Theiss AP, Chafin D, Bauer DR, Grogan TM, Baird GS (2014) imunohistoquímica do colorectal Cancer Biomarcador fosforilação Requer controlado fixação do tecido. PLoS ONE 9 (11): e113608. doi: 10.1371 /journal.pone.0113608

editor: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de junho de 2014; Aceito: 28 de outubro de 2014; Publicação: 19 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Theiss et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi financiado em parte por uma bolsa de pesquisa para GSB da Ventana Medical Systems, Inc. Não há número de concessão associado a esta investigação por contrato conceder. Este estudo foi um esforço colaborativo entre instituição e Ventana do GSB, e, portanto, os funcionários Ventana estavam envolvidos em todas as etapas da pesquisa (desenho do estudo, coleta de dados, análise, decisão de publicar, e preparação do manuscrito). A parte restante deste trabalho foi financiado pela Universidade interno dos fundos Washington

Conflito de interesses:. Geoffrey Baird tenha lido a política da revista e os autores deste manuscrito tem os seguintes interesses concorrentes: Os autores indicados são funcionários da Ventana Medical Systems, Inc. Esta não altera a adesão de qualquer autor para qualquer PLOS ONE política.

Introdução

recente atenção

na terapia-alvo de câncer colorretal, houve colocada na importância de identificar o estados de ativação de células moléculas sinalizadoras para a predição de respostas à terapia. Um caso em questão é a reativação mediada por EGFR de sinalização MAPK, que contribui para a falta de sensibilidade dos carcinomas colo-rectais BRAF-mutante à inibição RAF com Vemurafenib [1]. É importante salientar este evento reactivação pEGFR está sujeita a modulação por inibidores de EGFR, ea politerapia combinada inibidores de BRAF e EGFR superar essa resistência, com resposta benéfica

modelos in vitro Comprar e em animais

in vivo

.

a extensão destes achados laboratoriais anteriores à clínica, e nossa capacidade de afetar os tratamentos alternativos, é totalmente dependente da nossa capacidade de preservar com precisão e detectar os estados de ativação em questão. Na tentativa de determinar a preservação (fixação do tecido) óptima condições para apoiar a terapia-alvo, a literatura levou-nos a questionar se ou não uma prática normal no laboratório de patologia anatômica é suficiente para cobrir todos os potenciais armadilhas que podem afetar biomarcador estado /activação preservação. Por exemplo, na nossa experiência clínica laboratório, amostras de tecido pode permanecer à temperatura ambiente antes da imersão no fixador durante períodos longos, e o tempo gasto num fixador, e a temperatura do referido fixador, são por vezes mal controlada. Atuais diretrizes profissionais norte-americanos sobre esta questão [2] – [4] abordar apenas um número limitado de tipos de amostras clínicas e biomarcador jusante análises, ou ainda são bastante ampla na definição do que é considerado aceitável em termos de tempo de fixação (uma variação de 2 vezes no tempo máximo de fixação, 16-32 horas, é recomendado nas diretrizes do CLSI, e uma gama de 12 vezes de duração fixação, 6-72 horas, é considerado aceitável nas diretrizes marcador do cancro da mama ASCO /CAP). Um pré-fixação do tempo “isquemia fria” de até uma hora também é considerada aceitável em uma destas orientações [3], que está dentro da gama do que temos observado clinicamente nas nossas próprias instituições. biomarcadores de câncer estudos de imunohistoquímica anteriores têm realmente encontrado ~ 1 vezes horas de isquemia aceitável, embora estes estudos têm focado principalmente na biomarcadores estabelecidos, como receptor de estrogênio e HER2 [5], [6]. No entanto, as orientações que existem, nenhuma pretende abordar a preservação dos estados de ativação biomarcador, tais como estados de fosforilação, em tudo. Isto é particularmente problemático, porque os estados de fosforilação são conhecidos há algum tempo para ser altamente sensível às condições pré-analíticas [7] -. [9], incluindo tempos de aquecimento isquêmicos [10] (que não são aqui investigados)

para este fim, desenvolvemos um romance, rápida de dois temperatura estratégia de fixação de formalina que encontramos preserva características-chave do tecido como a morfologia, assim como a expressão da proteína como avaliada por imuno-histoquímica [11]. Nesse trabalho, encontramos preservação pAKT significativa num modelo de xenoenxerto do mouse Calu3, avaliada por IHQ, utilizando um protocolo de fixação de dois temperatura, e descobrimos que esta coloração foi quase totalmente perdido usando fixação temperatura ambiente padrão. Avançando a partir deste estudo, nós estendemos nosso estudo em amostras de carcinoma colorretal, analisando para phosphoepitopes adicionais. Neste estudo global actual, foi perguntado se ou não a tecnologia de dois temperatura adicionalmente ajudado na preservação do estado de activação dos biomarcadores relevantes para a terapia do cancro colo-rectal, bem como com ou sem controlo de intervalos isquémicos frio pré-fixação foi importante para estes marcadores. Usando 23 amostras de carcinoma colorectal cirúrgicos recolhidos com intervalos definidos de isquemia fria e protocolos de fixação em formalina, foram estudados o estado de fosforilação de numerosos alvos da via de PI3-cinase, bem como a mutação de BRAF V600E e outros marcadores utilizando imuno-histoquímica [12], [13]. Registramos aqui tanto a importância do tempo de isquemia fria como uma variável na análise fosfoproteína, bem como o impacto global da nossa rápida de dois temperatura protocolo de formalina fixação.

Materiais e Métodos

Amostra amostras de carcinoma do cólon humano de recolha e Fixação

foram obtidas a partir de Indivumed GmbH (Hamburgo, Alemanha) como blocos embebidos em parafina. As amostras foram coletadas em Indivumed porque Ventana não é um centro médico e, portanto, não tem acesso a amostras cirúrgicas, e também porque Indivumed era conhecido por ser capaz de fornecer amostras de tecido com uma curta documentados (menos de 17 minutos) pós-excisão intervalo isquêmico. cientistas Indivumed realizada coleções de tecidos sob a aprovação do seu conselho de revisão institucional local e obtido o consentimento por escrito dos pacientes envolvidos.

Para todas as experiências, os protocolos de fixação foram realizados por cientistas Indivumed, e consistiu de imersão em 10% neutra formalina tamponada (10% saturada aquosa de formaldeído a partir de Fisher Scientific, Houston, TX, tamponada a pH 6,8-7,2 com tampão de fosfato 100 mM) durante vários tempos a temperaturas na gama 4-45 ° C. A temperatura ambiente variou de 20-25 ° C. As amostras de tecido coletadas de casos clínicos foram divididos em três partes e cada fixado de forma diferente. Um pedaço foi envolta em gaze embebida salina e mantidos à temperatura ambiente durante 1 hora ( “1 horas de isquemia fria”) antes de fixação 24 h à TA. Isto foi para testar o efeito do intervalo de isquemia fria prescrito-orientação a mais de uma hora. As restantes duas peças foram para testar o efeito da menor (menos de 17 minutos) do intervalo de isquemia fria. Uma parte foi colocada directamente na sala de temperatura de formalina durante 24 horas ( “24 horas”). Uma terceira parte foi colocada directamente em 4 ° C formalina durante 2 horas, seguido de 2 horas em 45 ° C em formalina ( “2 + 2”) [11]. O último foi para testar se o processo pode ser acelerado para aumentar a eficiência de trabalho no hospital. A fixação foi realizada em béqueres 100-500 mL abrangidos no frigorífico durante 4 ° C de tratamento, ou numa hote química padrão para as temperaturas mais elevadas. tempos de isquemia fria para o “24” e as amostras “2 + 2” em média 10 +/- 3 minutos (intervalo de 6-17 min). processamento do tecido a jusante foi realizada como descrito [11], com todas as etapas de processamento de solventes mantidos a 45 ° C, sob pressão ambiente, e o passo de parafina foi mantida a 60 ° C sob vácuo. Todas as amostras foram embebidas em parafina e cortado em lâminas de vidro como secções 4-micron para IHC ou histomorfologia.

Automatizada A imuno-histoquímica

ensaios imunoistoquímicos foram realizadas num instrumento automatizado coloração VENTANA Descoberta de acordo com a XT as instruções do fabricante. As lâminas foram de-parafinado usando solução EZprep (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) durante 30 minutos a 75 ° C. Epitopo recuperação foi realizado no Stainer automatizado com solução CC1 (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) durante 64 minutos a 95 ° C. Os anticorpos obtidos a partir de Cell Signaling Technologies ou Epitomics foram titulados em primeiro lugar sobre uma gama de concentrações para proporcionar a razão óptima de coloração específica para a coloração de fundo. Uma vez que os títulos foram criados, os anticorpos foram transferidos com diluente às embalagens podem ser preenchidos usuário para uso no stainer automatizado. As lâminas foram desenvolvidos utilizando a vista Opti

kit de detecção de DAB (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Resumidamente, os passos incluídos inibidor durante 8 minutos, ligante durante 8 minutos, multímero durante 12 minutos, DAB /peróxido de 8 minutos, e de cobre durante 4 minutos. As lâminas foram então contrastadas com hematoxilina II por 8 minutos (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Anticorpos, clones, e os títulos são listados na Tabela 1. Os títulos de anticorpos foram determinados para cada anticorpo utilizando tecidos de controlo positivas e negativas seguindo as instruções do fabricante.

Análise Imunohistoquímica

análises imuno-histoquímicos foram marcado por dois patologistas independentes, cada cegado com a metodologia de fixação para cada lâmina, usando um H-score para semiquantitation proporção de coloração e intensidade [14]. Nos casos com ambos

em

situ e neoplasia invasiva, apenas o tumor invasivo longe das margens da amostra de tecido foi marcado. coloração de alta intensidade que foi claramente relegado para as margens do tecido absolutos (ou seja, o que é comumente referido no imunohistoquímica clínica como um “efeito de borda” [15]) foi ignorado. Pontuações foram unblinded por um terceiro, e todas as contagens de H de cada patologista foram plotados contra o outro para cada marcador. Pontuações que apareceram subjectivamente discrepantes, ou seja, aqueles que, substancialmente, se desviou da linha de identidade como avaliado por inspeção visual, foram revistos em conjunto em um microscópio multi-dirigido e uma pontuação de consenso foi gerado.

Análise Estatística

Toda a análise foi realizada utilizando o pacote estatístico R. Para cada caso, as contagens de H dos dois revisores foram em média. As diferenças estatísticas entre grupos de fixação (24 hr vs 2 + 2, 24 hr vs isquemia fria), utilizando um teste de classificações de Wilcoxon Signed frente e verso emparelhado. Como várias condições foram avaliados em simultâneo, os valores de p para estas comparações foram convertidos em valores de q falsos descoberta corrigido a taxas [16], [17]. Boxplots na Figura 1 foram gerados com o ggplot2 pacote. barras pretas representam valores médios e as caixas se estendem desde o 25

th a 75

th percentis. Bigodes estender a 1,5 × a distância interquartil.

contagens de H de intensidade de coloração para todos os biomarcadores estudados, por condição de tratamento. “2 + 2” é a condição de fixação rápida “, 24 hr.” É a condição de temperatura de quarto 24 horas padrão sem isquemia fria pré-fixação, e “Isquemia” denota um período de isquemia fria de 1 hora antes de quarto 24 horas fixação temperatura. As medianas são representados por linhas horizontais, as caixas em parcelas correspondem ao 25 ​​

th e 75 percentis de cada distribuição, os bigodes estender para o valor mais extremo que está no intervalo de 1,5 vezes a distância entre o primeiro e o terceiro quartis, e dados além dos bigodes são mostrados como pontos.

resultados

H pontuações para todos os marcadores são representados graficamente em boxplots Figura 1, e os resultados dos testes de comparação são apresentados na Tabela 2 .

Muito poucos casos mostraram qualquer coloração apreciável para três dos marcadores (V600E BRAF, pMEK1 /2 e pAKT), mas dois casos foram inequivocamente positiva para a mutação BRAF V600E, uma descoberta confirmada por análise molecular (dados não mostrados). No geral, o protocolo 2 + 2 rendeu tanto ou mais sinal de IHC que o tratamento 24 horas, com resultados de coloração representativos mostrados na Figura 2. Enquanto várias diferenças de casos específicos são destacadas na Figura 2, não houve diferenças estatisticamente significativas observadas em múltiplos comparações pareadas através dos 24 casos (Tabela 2). A Tabela 2 demonstra que dois marcadores pareceram ter um ligeiro aumento de coloração no tratamento de 24 h (EGFR e pERK), mas mais uma vez, estas diferenças não foram estatisticamente significativas, bem como os patologistas a marcar as amostras encontrar qualquer caso em que a coloração divergente entre 2 + 2 e 24 horas condições iria conduzir a uma alteração na interpretação fisiopatológico destes dois marcadores.

os resultados representativos das análises de IHC de duas amostras de carcinoma do cólon submetidos a um a condição fixação rápida ( “2 + 2”) ou padrão 24 condição de temperatura ambiente -hour sem isquemia fria pré-fixação ( “24 horas”). Perk, pMTOR, pMEK1 /2 e pPRAS40 são mostradas para um caso e pBAD e pAKT são mostrados a partir de um segundo caso. Dois casos diferentes são mostrados aqui, porque nem todos os casos mostraram coloração para todos os marcadores. Todas as micrografias são tomados em 200 × com exposições equivalentes.

O sinal de IHC foi muito mais afectado pela período de isquemia fria mais de 1 hora antes da fixação quando comparado com os protocolos de intervalo isquémicos mais curtos, com a única exceção de EGFR. Essas tendências foram altamente estatisticamente significativa para pEGFR e pMSK1, ea redução na coloração pERK aproximou significância estatística. Em dois casos, em particular, mostradas nas Figuras 3 e 4, carcinomas que albergam a mutação BRAF V600E foram encontrados para ser claramente positiva para pEGFR em ambas as condições de intervalo isquémicos mais curtos, mas a coloração foi quase inteiramente ausentes quando a amostra foi exposta ao longo 1 hora condição de isquemia fria.

imagens representativas de um caso de carcinoma do cólon corados com anticorpos para BRAF V600E, pEGFR, EGFR, e pMSK1, mostrando uma perda significativa de coloração pEGFR na condição de isquemia. Todas as micrografias são tomadas em 200 × com exposições equivalentes.

Representante de um segundo caso de carcinoma do cólon corado com anticorpos para BRAF V600E, pEGFR, PTEN e pMSK1, mostrando uma perda significativa de coloração pEGFR na isquemia condição. Todas as micrografias são tomadas em 200 × com exposições equivalentes.

Discussão

Os resultados deste estudo demonstram claramente que uma substancial pós-cirúrgica, pré-fixação frio intervalo isquêmico (uma hora ) confunde a tentativa de identificar os estados de fosforilação de um elemento-chave via PI3 quinase em tecido fixado em formol. Este resultado é consistente com relatórios anteriores que indicam a sensibilidade pré-analítica significativa de ensaios fosfoproteína [7], [18]. Se um tratamento cuidadoso amostra é utilizada para minimizar o intervalo de frio isquêmica (menos de 17 minutos), no entanto, tanto temperatura ambiente formalina fixação 24 horas e nosso protocolo de fixação rápida de dois temperatura preservar sinais de fosforilação em média, essencialmente para todos os marcadores investigados. Por que alguns marcadores foram mais afetadas pela isquemia fria está claro para nós; o equilíbrio entre a quinase sem obstáculos e atividade de fosfatase durante os intervalos de isquemia fria não é provável que jogar fora de forma idêntica para cada alvo de fosforilação, no entanto, para identificar os alvos com sensibilidades exageradas a isquemia fria através de estudos como este será de importância vital como o campo de fosfoproteína imunohistoquímica avanços.

Quando prefixação tempo de isquemia fria se estende até a uma hora considerado um intervalo aceitável nas diretrizes ASCO /CAP atuais para testes ER [3], descobrimos que o sinal do fosfoproteínas selecionados diminui significativamente. Especificamente, em dois espécimes encontrados para abrigar a mutação BRAF V600E (Figuras 3 e 4), a 1 hora de intervalo de isquemia fria apareceu para obscurecer a expressão de pEGFR, um erro que poderia levar à incapacidade de identificar esses pacientes como candidatos para adicional terapia [12], [13], [19]. Nestes dois casos, o protocolo de fixação rápida de dois temperatura produziram visivelmente mais coloração pEGFR que o protocolo de fixação de 24 horas, indicando que o protocolo rápido poderia ser uma metodologia mais sólida para avaliar este estado de ativação biomarcador clinicamente significativa. Uma tendência semelhante é observada em alguns marcadores adicionais (por exemplo. PBAD, PAKT) nos casos selecionados apresentados na Figura 2. Esta constatação acentua claramente o impacto potencial da amostra pré-analíticas manipulação na era da medicina personalizada, uma vez que a preservação dos estados de ativação biomarcador parece ser relativamente constante, em média, entre os protocolos de fixação para alguns biomarcadores, mas difere substancialmente para casos específicos

.

Vários estudos já identificaram que MAPK via reactivação constitui um mecanismo de resistência a terapia em BRAF V600E mutante carcinomas colo-rectal que são tratados com Vemurafenibe [1], [20], [21].

in vitro e modelos de xenoenxerto

indicar que este estado resistente pode ser superado por terapia dupla, incluindo inibidores de EGFR dirigidos a pEGFR, mas esta abordagem baseia-se na capacidade de diagnosticador para identificar pEGFR sobre-expressão na amostra de tecido clínica. Enquanto a literatura existente indica que a terapia dupla tem muito potencial benefício para os pacientes com esses fenótipos tumorais específicas, nossos achados indicam que todo esse benefício potencial está em risco se um processo de preservação de tecido e fixação descontrolada é empregado. Os dois pacientes cujos carcinomas nutriam mutações BRAF V600E, por exemplo, não seriam identificados como candidatos para terapia dirigida por EGFR tinha as suas amostras foram recolhidas com o mais uma hora a frio intervalo isquémica que é não só visto nas áreas de patologia clínica, mas é igualmente considerado aceitável em uma análise de orientação biomarcador de câncer atual. Além dessas considerações clínicas, é também vale a pena considerar os custos extremos associados com novas terapias direcionadas, de tal forma que misidentifying pacientes como candidatos para terapias poderiam ser não só pessoalmente prejudiciais, mas também economicamente um desperdício.

Além do BRAF V600E /example pEGFR , é também notável que a expressão é diminuída pERK após 1 hora de isquemia fria (ver Tabela 2). Desde pERK tem sido utilizada para monitorizar a eficácia da terapia, este efeito, se presente num ensaio clínico, pode potencialmente danificar monitorização terapêutica. casos, também, em determinadas (Figura 2), a expressão de pBAD aparente pode ser reduzida por isquemia fixação prévia, confundindo a nossa capacidade para avaliar a expressão de um factor conhecido para ser relevante para patogénese do cancro do cólon [19].

Um potencial fraqueza deste estudo é que relativamente poucas amostras foram estudadas. Embora todas as amostras foram analisadas para todos os marcadores, o alto custo ea dificuldade de obtenção de amostras com tratamentos pré-analíticas definidas com precisão de nosso fornecedor comercial impedia o estudo de mais amostras. Claramente, maiores estudos adicionais seria benéfico para confirmar estes resultados. Trabalho em modelos de xenotransplante também pode ser esperado para ser benéfico nesta área, e ele tem de fato sido tão em nosso trabalho anterior sobre este tema [11] por causa do controle requintado sobre as condições pré-analíticas que é possível em tais sistemas. No entanto, optou-se por trabalhar em amostras clínicas aqui por causa de sua crescente relevância para os problemas atuais na pesquisa do câncer translacional. Note-se que a média de tempo de isquemia fria de 10 minutos de amostras recolhidas no âmbito do presente protocolo de pesquisa não são tipicamente observado nas práticas atuais anatomopatológicas, nem podem tais tempos de isquemia fria rápidos ser obtida com processos actualmente em vigor em laboratórios clínicos. Embora possa ser um desafio para incorporar nossas descobertas em fluxos de trabalho clínicos padrão, porque muitas instalações médicas atuais não são capazes de reduzir o tempo de isquemia significativamente, acreditamos que nossos dados indicam que a padronização e otimização das condições pré-analíticas é, pelo menos, um objetivo digno.

Outro ponto fraco potencial é que as pontuações de sinal fosfoproteína toda condições de tratamento não foram comparados com os limiares de pontuação clinicamente validados, simplesmente porque não existem tais limites para os marcadores aqui investigados. O que observamos com a nossa abordagem semi-quantitativa, no entanto, foi que os sinais eram muitas vezes drasticamente reduzida em amostras com um intervalo isquêmico longo prefixação, e que, nos dois casos específicos que discutimos, o intervalo isquêmico longo prefixação apareceu para retirar todos os sinais relevantes a partir de uma crítica biomarcador. Nestes casos, os protocolos de fixação controlados investigamos sinais preservados que, provavelmente, ser interpretado, no julgamento médico de dois patologistas praticando, como fisiopatologicamente relevantes para a terapia potencial.

Finalmente, embora tenhamos interpretado perdas de fosfoproteína IHC sinais como indicações de efeitos deletérios pré-analíticas, que poderia ser o caso que aumenta na coloração eram os verdadeiros artefatos e que a diminuição da coloração estava mais próxima do verdadeiro estado

in situ

. No entanto, outros autores demonstraram que numerosas phosphomarkers, incluindo pAKT, são claramente diminuída no contexto das condições de fixação alterados ou isquemia fria [22], [23], então a nossa interpretação não é sem precedente. Enquanto esta questão não pode ser resolvida sem futuro

in vivo

estudos, o que é absolutamente claro a partir deste trabalho é que as mudanças nos estados de ativação aparente de muitos biomarcadores de câncer relevantes parecem ser sensíveis às variáveis ​​pré-analíticas comuns. Dessas variáveis, o intervalo isquêmico é talvez um dos mais importantes e, portanto, acreditamos que mais pesquisas e estudos clínicos devem incorporar controles que abordam este factor.

informação de apoio

Tabela S1. dados

Raw H-score para todos os casos analisados ​​neste estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0113608.s001

(XLSX)