Sumário

Os mecanismos moleculares subjacentes cordoma patogênese desconhecidas. Por isso, procurou identificar novas mutações para melhor compreender a biologia cordoma e identificar potenciais alvos terapêuticos. Tendo em conta os custos relativamente elevados de toda a sequenciação do genoma, foi realizada uma análise genética focado usando dessorção /ionização por laser em tempo assistida por matriz de espectrômetro de massa de voo (Sequenom Iplex genotipagem). Testamos 865 mutações de ponto de acesso em 111 oncogenes e selecionados genes supressores de tumor (OncoMap v. 3.0) de 45 amostras de tumores cordoma humanos. Das amostras analisadas, sete foram identificados com pelo menos uma mutação. Seis destes foram de amostras congeladas frescas, e uma era de uma amostra embebida em parafina. Estas observações foram validados utilizando uma plataforma independente usando massa homogênea estender MALDI-TOF (Sequenom HME Genotipagem). Estas alterações genéticas incluem: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A), as ARN (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), e SMARCB1 (R40 *). Este estudo relata na maior análise mutacional abrangente de chordomas realizados até à data. Para focalizar mutações que têm a maior chance de relevância clínica, foi testada apenas oncogenes e genes supressores de tumor que foram previamente implicados na tumorigênese de tumores malignos mais comuns. Foram identificadas alterações genéticas raras que podem ter significado funcional para a biologia subjacente e potenciais terapias para chordomas. As mutações em CDKN2A e PTEN ocorreu em áreas de perda de cópia cromossómica. Quando estes dados são emparelhados com os estudos que mostram 18 de 21 amostras de cordoma exibindo perda de cópia no locus de CDKN2A, 17 de 21 amostras de cordoma exibindo perda de cópia em PTEN, e 3 de 4 amostras de cordoma exibindo deleção no locus SMARCB1, podemos inferir que uma perda de heterozigosidade nestes três loci podem desempenhar um papel significativo na patogénese cordoma

Citation:. Choy E, MacConaill LE, Cote GM, Le LP, Shen JK, Nielsen GP, ​​et al. (2014) Genes Genotipagem Cancer associados do cordoma Identifica mutações em oncogenes e em áreas de perda de cromossomos envolvendo CDKN2A, PTEN e SMARCB1. PLoS ONE 9 (7): e101283. doi: 10.1371 /journal.pone.0101283

editor: Anette Duensing, da Universidade de Pittsburgh Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Outubro, 2013; Aceito: 04 de junho de 2014; Publicação: 01 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Choy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado em parte pela Yates Fundação Jennifer Hunter, o L. Fundo Chordoma Harris Stephan, o Berry Fundo Endowed Sarcoma Cassandra Moseley, os Fundos Gategno e Wechsler, eo (mérito) concessão KL2 Medical Research Investigator Training adjudicado à CE através de Harvard Catalisador /The Harvard Clinical and Translational Science Center (National Institutes of Health conceder 1KL2RR025757-01) e por contribuições financeiras da Universidade de Harvard e seus centros de saúde acadêmicos filiados. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. CE recebeu honorários de consultoria da Amgen, Bayer, NPS, e Pfizer. LG é consultor da Novartis e Fundação Medicina e acionista da Fundação de Medicina. No entanto, isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Cordoma é um tumor primário agressivo do esqueleto axial que é pensado para originar a partir de tecido notocordal [1]. A maioria destes tumores ocorrer na base do crânio (35%) ou no sacro (50%), e estes são tipicamente controlado com cirurgia e /ou radioterapia [2] – [10]. Seu comportamento clínico é marcado por um crescimento lento e uma predileção que volte a ocorrer apesar da ressecção cirúrgica. A maioria dos pacientes com cordoma recorrentes e quase todos os pacientes com metástase acabará por morrer desta doença [11], [12]. Infelizmente, não há nenhum agente sistémico eficaz para controlar cordoma inoperável ou metastático e para o desenvolvimento de novos tratamentos está limitada pela nossa compreensão incompleta da sua biologia [12] – [15]

A identificação de mutações do condutor em malignidade. , tais como os cancros do pulmão com mutação do EGFR, tumores estromais gastrointestinais c-kit mutante, e tumores ALK-translocados, entre outros, mudou dramaticamente a paisagem tratamento para estas doenças [15] – [20]. Nós supomos, por conseguinte, que para um tumor normalmente resistente à quimioterapia, tais como cordoma, onde não existe uma terapia sistémica eficaz, a identificação de mutações nos genes para os quais não existe uma estratégia terapêutica pode informar o desenvolvimento de novos medicamentos. No entanto, devido à raridade dos pacientes com estes tumores, a compreensão molecular abrangente da patogênese cordoma é atualmente incompleto.

chordomas estudos cariotípicas observados com perda no cromossomo 1p e 3p e ganhos envolvendo os cromossomos 7q, 20, 5q, e 12q [21], [22]. Mobley et ai. identificaram uma coorte de chordomas pouco diferenciados que carecem SMARCB1 /expressão INI1 [23]. avaliação citogenética usando FISH mostrou que 3 das 4 amostras tinha eliminação neste locus. Gene sequenciamento não revelou quaisquer mutações pontuais. Recentemente, Le et ai. realizada hibridização genômica comparativa em 21 amostras de tumores cordoma para mostrar a perda frequente de regiões cromossômicas 9p21 e 10q23.3 [24]. Eles também genotipados para 56 mutações pontuais que ocorrem em 13 genes comumente associados com o cancro, incluindo CDKN2A (localizado em 9p21) e PTEN (localizado em 10q23.3), mas não identificou quaisquer alterações na sua coorte. Procuramos expandir essas observações, analisando 45 amostras cordoma via alta genotipagem taxa de transferência de genes associados ao câncer conhecidos por desempenhar um papel importante no cancro.

Métodos

Declaração de Ética

Institutional Review Board aprovação foi obtida para estudar retrospectivamente essas amostras de tumores do Comitê da Partners Human Research, 116 Huntington Avenue, suite 1002, Boston, MA 02116. o número do protocolo é 2007P-002.464. O conselho de revisão institucional dispensou a necessidade de consentimento. tumor espécimes foram obtidos a partir dos arquivos clínicos do Dr. Francis Hornicek (Departamento de Cirurgia Ortopédica, Hospital Geral de Massachusetts) e no Repositório Tissue Hospital Geral de Massachusetts (https://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id = 31).

amostras de tumores cordoma

amostras de tumor foram obtidas a partir dos arquivos clínicos do Dr. Francis Hornicek (Departamento de Cirurgia Ortopédica, Hospital Geral de Massachusetts) e no Repositório Tissue Hospital Geral de Massachusetts ( https://www.massgeneral.org/cancer/research/resourcelab.aspx?id=31).

extração de DNA genômico

A extração de DNA a partir de tecidos tumorais cordoma e linhas celulares foram realizada utilizando QIAamp DNA micro kit (Qiagen) tal como anteriormente descrito em publicações anteriores [25]. A extracção foi levada a cabo de acordo com as instruções do fabricante. DNA foi preservada a -20 ° C até o uso.

Seleção de Câncer Gene Mutações e OncoMap v3 Assay Design by

Seleção de mutações do gene do cancro para o projeto de ensaio e genotipagem por espectrometria de massa foram realizados conforme descrito anteriormente [25] – [27]. Vários bancos de dados, incluindo o banco de dados Sanger Institute COSMIC, PubMed, e The Cancer Genome Atlas (TCGA), foram consultados para oncogenes e genes supressores de tumor mutações somáticas conhecidas. As mutações foram classificadas em importância pela frequência em cancros e em subtipos de câncer, e genes modificadores com terapêuticas existentes foram preferencialmente selecionado.

Os primers para amplificação por PCR e a sonda de extensão foram projetados usando Sequenom MassARRAY Ensaio Projeto 3.0 eo DNA resultante sequências foram (1) consultado na base de dados dbSNP para evitar a incorporação de SNPs durante o design de ensaio, (2) confirmou através de uma ferramenta de alinhamento BLAST-like (BLAT) e modificados, quando necessário para evitar a amplificação de pseudogene [28], e (3) sintetizado não modificada usando a purificação padrão (Tecnologias de ADN integradas, Coralville, IA).

Mass Espectrométrico Genotipagem

Primers e sondas foram reunidas e depois validado em DNA controle derivado a partir do painel CEPH de humano HapMap DNAs ( Instituto Coriell), bem como um painel de linhas de células humanas com o estado mutacional conhecida, tal como descrito anteriormente [26]. O ADN genómico foi quantificada utilizando Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia), submetido a amplificação de todo o genoma (WGA) utilizando Qiagen Repli-g kit, e um passo de limpeza pós-WGA foi implementado utilizando um Kit de Purificação Nucleofast (Macherey-Nagel). genotipagem por espectrometria de massa utilizando produtos químicos Iplex foi realizada como publicado anteriormente [27].

mutações candidatos foram ainda filtrados por revisão manual e selecionado para confirmação usando química extensão multi-base de homogênea Mass-Extend (HME) com plexing de ≤ 6 ensaios por pool. Condições para a validação HME foram consistentes com os métodos descritos por MacConaill et ai. 2009 [27].

Matriz Hibridização Genômica Comparativa (CGH) Análise

array CGH usando o microarray Agilent 4x180k CGH + SNP (Santa Clara, CA) foi previamente descrito [24]. chamadas aberrações no número de cópias foram feitas com uma base absoluta regionais mínima média log 2 proporção de 0,25 e contagem sonda contígua mínimo de 5. Todos os dados de matriz foram revistos manualmente para mudanças sutis.

Resultados

Características de amostras de tumores clínicos

Um total de 45 amostras de DNA foram derivadas de 40 pacientes que haviam sido submetidos a ressecções operativas de sua cordoma. data de paciente de cirurgia (DOS), idade, sexo, localização do tumor, recorrência e metástase são catalogados na Tabela 1. 28 espécimes foram obtidos a partir de tecido fresco congelado, e 17 foram obtidos a partir de blocos de FFPE.

Genótipo e Análise CGH

Exemplos das leituras de espectrometria de massa são mostrados na Figura 1. resultados de mutação são catalogados ao lado as características do paciente na Tabela 1. as mutações identificadas incluem: ALK (A877S), CTNNB1 (T41A), também conhecido como β-catenina, as ARN (Q61R), PIK3CA (E545K), PTEN (R130), CDKN2A (R58 *), e SMARCB1 (R40 *).

produtos de PCR diferem em massa, dependendo se a extensão da sonda detecta uma citosina (C) ou timina (T). A figura à direita mostra enredo da espectrometria de massa de um alelo em SMARCB1 exibindo um pico em ambos C e T. O painel esquerdo mostra que a maioria das amostras testadas eram homozigotos com C e 2 amostras eram heterozigotos.

Entre as 28 amostras congeladas de fresco testado, foram identificados 6 mutações. Das 17 amostras testadas FFPE, foi identificada apenas uma mutação (em ALK). Semelhante aos nossos taxas previamente relatados de detecção de frequência similar de mutações entre recém-congelado e as amostras de tumor osteossarcoma embebidos em parafina [25], não parecia haver nenhuma diferença na taxa de mutações em amostras que foram recentemente congelados quando comparado com as amostras de FFPE preparadas (teste exato de Fisher, p = 0.22 duas caudas). Duas amostras (amostras # 7 e 8 na Tabela 1), extraídos de um mesmo paciente em diferentes localizações anatômicas e datas cirúrgicas, cada um tinha as mesmas mutações em ambos SMARCB1 e CDKN2A. Quando foi realizada a análise CGH nas amostras com mutações CDKN2A e PTEN, observou-se perdas no número de cópias no respectivo locus (Figura 2), demonstrando que estas mutações ocorreram em regiões da perda cromossómica.

medidas eixo X localização ao longo cromossoma 9 (Painel A) ou 10 (Painel B). medidas do eixo Y contagem sonda relativa. A: aCGH que mostra a perda cópia heterozyogous em CDKN2A; B:. ACGH que mostra a perda cópia heterozyogous no PTEN

Discussão

Chordomas foram previamente descritos para ter aberrações cromossómicas e são caracterizados por ganhos cromossômicas e perdas em diversas regiões do genoma [ ,,,0],21], [22], [24], [29]. Uma ampla pesquisa de todo o genoma para mutações de alto rendimento ainda não foram realizadas através de uma grande coleção de chordomas. Matriz de hibridização genômica comparativa (aCGH) foi utilizado para analisar 21 amostras de tumores cordoma [14] e observaram grandes perdas no número de cópias envolvendo os cromossomos 1p, 3, 4, 9, 10, 13, 14 e 18 [24]. Nesse estudo, uma análise focada de 11 genes relacionados com o cancro, não revelou quaisquer novas mutações na sequência de ADN. Diaz et ai. realizada a todo o genoma single-nucleotide polymorphism análise de microarray de 21 amostras de cordoma clival para confirmar os resultados CGH por outros que cromossomo 3 aneuploidia e eliminação do cromossomo 9p ocorre (embora com menos frequência do que em chordomas sacrais) [29].

com a tecnologia atual, sequenciamento de genoma completo de grandes coleções de chordomas é caro e trabalhoso. Assim, buscamos ampliar nossa tela mutacional ao focalizar apenas nas alterações genéticas que foram previamente implicados como tumorigenisis motoristas em outros tipos de tumores, com o objetivo geral de identificar novas mutações capazes de dirigir mais investigação sobre cordoma descoberta terapêutica. Algumas das mutações identificadas neste estudo estão em genes conhecidos por seu papel como supressores tumorais, como PTEN e CDKN2A. Curiosamente, ambos os genes se encontram em regiões cromossômicas que foram frequentemente encontrados para ter as perdas no número de cópias na recente análise de CGH array (9p21 para CDKN2A e 10q23.3 para PTEN) a uma taxa de 80% para cada um. Portanto, foi realizada CGH nas amostras que contêm mutações em PTEN e CDKN2A e encontraram perda cromossómica em cada loci nas respectivas amostras. Curiosamente, 33% das amostras testadas no Le et ai. coleção encontrada perda completa de ambas as cópias do CDKN2A – argumentando que seja um ponto de mutação no CDKN2A ou perda cópia completa do CDKN2A pode levar a LOH neste locus [24]. Nós portanto inferir que a perda de heterozigotia (LOH) nestes loci pode ser potencialmente um evento tumorigénico para o desenvolvimento de cordoma.

SMARCB1 é uma subunidade da cromatina dependente de ATP remodelação complexo SWI /SNF, um poderoso epigenética supressor de tumor, que antagoniza directamente a metiltransferase histona EZH2. Mutações nos membros SWI /SNF estão cada vez mais sendo reconhecido em malignidades onde eles estão agora pensado por alguns grupos a ser mais comum do que a inativação de mutações em p53 [30], [31]. SMARCB1 também regula o ciclo celular, ativando CDKN2A, e sua perda leva a regulação positiva de EZH2 uma molécula que está sendo alvo de vários inibidores que estão actualmente submetidos a testes clínicos [32] – [34]. SMARCB1 é conhecido por ser interrompido em tumores malignos, sarcomas rabdóides tecidos moles células redondas (a maioria eram um subconjunto de tumores que se assemelham condrossarcoma mixóide extraesquelético com características rabdóides, sarcomas epitelióides e schwannomatosis [34] – [38].

Estes tumores, como chordomas, são grupos de neoplasias raras, para as quais nenhuma terapia eficaz é conhecida. Mobley et al. observaram que em chordomas pouco diferenciadas, expressão de SMARCB1 também está faltando. Eles usaram FISH para avaliar o locus SMARCB1 no cromossomo 22q e supressão encontrada em três amostras de 4 [38]. por isso, também se inferir que quando as mutações SMARCB1 coincidem em áreas de perda cromossómica, perda de heterozigosidade também pode ser um evento tumorigénico.

várias das mutações encontradas no nosso estudo , tal como ALK, PIK3CA, e CTNNB1, cada um tem os inibidores que são ou comercialmente disponíveis, tais como o inibidor da ALK XALKORI (crizotinibe), ou têm vários inibidores actualmente em desenvolvimento clínico, activo [39] – [44]. Observações como o nosso sugerem a utilidade clínica de realização de um genótipo dirigido ensaio clínico para testar novos inibidores da quinase nesta população doença.

em conclusão, observou-se cordomas com mutações pontuais em genes supressores de tumores nas zonas da perda cromossómica em frequentes e com oncogenes Os inibidores disponíveis comercialmente. O primeiro sugere possíveis mecanismos de tumorigênese cordoma, este último sugere possibilidades de novas terapias. Mais estudos precisam ser feitas, a fim de estabelecer esses genes como biomarcadores importantes ou alvos em cordoma. O estudo ideal seria um esforço de sequenciamento do genoma completo que envolve muitos mais amostras cordoma. Esperamos que este sinal inicial de genotipagem bem sucedida na maior coleção de amostras de tumores cordoma humanos até à data podem inflamar entusiasmo para novas investigações sobre a patologia molecular da doença, que atualmente não tem nenhum tratamento médico eficaz.