Abstract

Fundo

Uma isoleucina mutação de metionina na posição 148 no gene PNPLA3 (p.I148M, rs738409) foi recentemente identificada como um factor de susceptibilidade de danos no fígado em esteato-hepatite. Aqui, nós estudamos se o

PNPLA3

rs738409 polimorfismo afeta também predisposição para carcinoma hepatocelular (HCC).

Métodos

Foram comparadas as distribuições de

PNPLA3

genótipos em 80 e 81 pacientes caucasianos com vírus alcoólica e hepatite C (HCV) -associated HCC 80 e 81 pacientes da mesma idade e sexo com relacionadas com o álcool e relacionadas com o HCV cirrose sem HCC, respectivamente.

PNPLA3

genótipos em 190 indivíduos saudáveis ​​da mesma população serviu como referência. Possíveis fatores de confusão obesidade, diabetes, genótipo HCV e co-infecção pelo HBV foram controladas por meio de regressão logística univariada e multivariada com seleção de variáveis ​​para a frente.

Resultados

PNPLA3

genótipos estavam em Hardy equilíbrio -Weinberg para todos os grupos de estudo. A frequência do alelo 148m foi significativamente (p 0,001) aumentou em cirrose alcoólica com (53,7%) e sem HCC (36,2%), mas não foi diferente entre controles saudáveis ​​(22,9%) e pacientes com cirrose (25,3%; p = 0,545) e HCC (30,2%; p = 0,071), devido à hepatite C. risco HCC foi maior em 148m /M pacientes homozigotos com doença hepática alcoólica (odds ratio (OR) 16,8 versus controles saudáveis; 95% intervalo de confiança (IC) 6,68 -42,43, P 0,001). Finalmente, a regressão multivariada confirmou 148m /M homozigose (OR 2,8; 95% -CI: 1,24-6,42; p = 0,013) como fator de risco HCC na cirrose alcoólica. Na cirrose relacionada ao HCV única genótipo 1 foi confirmado como um fator de risco HCC (OR 4,2; 95% -CI: 1,50-11,52; p = 0,006).

Conclusão

O

PNPLA3

variante 148m é um fator de risco importante para HCC em pacientes com cirrose alcoólica, sendo que os seus efeitos são insignificantes em pacientes com cirrose por VHC. Este polimorfismo fornece uma ferramenta útil para identificar indivíduos com risco particularmente elevado HCC em pacientes com doença hepática alcoólica que deve ser levado em consideração nos estudos de prevenção HCC futuros

Citation:. Nischalke HD, Berger C, Luda C, Berg T, T Müller, Grünhage F, et al. (2011) O

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rs738409 148m /M genótipo é um fator de risco para o cancro do fígado em alcoólica Cirrose mas Mostra Não ou associação fraca na Hepatite C Cirrose. PLoS ONE 6 (11): e27087. doi: 10.1371 /journal.pone.0027087

editor: Yujin Hoshida, Instituto Broad do Massachusetts Institute of Technology e da Universidade de Harvard, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de julho de 2011; Aceito: 10 de outubro de 2011; Publicação: 07 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Nischalke et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Krebshilfe (concessão 107.865 para HDN e US, https://www.krebshilfe.de/english.html) eo SFB TR57 TP01 TP12 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (https://www.dfg.de/en/index.jsp) para FL, JN e dos Estados Unidos. CK foi apoiado por uma bolsa do BMBF Rede “Susceptbility e Resistência à Hepatite C” para os EUA e JN (concessão 01KI0792, https://www.bmbf.de/en/index.php). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O carcinoma hepatocelular (CHC) é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1], [2]. HCC é atribuído principalmente à hepatites virais crônicas B e C nos países em desenvolvimento [3], ao passo que na Europa e América do Norte aproximadamente 45% do HCC são causados ​​pelo aumento do consumo de álcool [4].

Grande interesse veio de um estudo de associação do genoma, que identificou um polimorfismo de nucleotídeo único (rs738409C /G) no

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gene no cromossomo 22, que codifica uma isoleucina → substituição metionina (p.I148M) da fosfolipase patatina-como A3, também denominado adiponutrin como fator de risco de esteato-hepatite e cirrose hepática em esteatose hepática alcoólica e não alcoólica [5], [6]. Adiponutrin é uma proteína transmembranar expressa no tecido adiposo humano e de fígado. Embora a sua precisão em função in vivo ainda seja desconhecida, os dados actuais indicam um papel crucial na homeostase de lípidos. expressão Adiponutrin é regulada durante o jejum e é induzida durante a ingestão de alto teor calórico, porque a atividade dos genes é regulada para cima em resposta à glicose, insulina e hormonas da tiróide. Assim, adiponutrin é um regulador importante do metabolismo de lípidos hepática durante excesso nutricional [6], [7]. No entanto, esta variante genética não se correlacionou com índice de massa corporal, teor de gordura visceral ou subcutânea, a sensibilidade à insulina ou níveis de lípidos no sangue periférico [8], [9]. Além disso, é inversamente correlacionado com a espessura da íntima da artéria carótida, sugerindo que o polimorfismo I148M afecta selectivamente a deposição de gordura no fígado, mas não está ligada a uma desordem metabólica geral [6], [10], [11]. No entanto, a variante de 148m foi correlacionada com os níveis séricos de alanina aminotransferase levantadas [12], [13], [14] elevado conteúdo hepático de gordura e aumento das taxas de fibrose na doença hepática gordurosa bebidas alcoólicas e não-alcoólicas [15], [16]. Aqui, nós estudamos se o alelo adiponutrin 148m teve qualquer efeito sobre o risco de desenvolvimento de HCC entre os pacientes cirróticos com doença hepática alcoólica, em comparação com hepatite C viral crônica, um fator de risco forte alternativa para o HCC.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

os estudos relatados foram aprovados pelos Institutional Review Boards de Comitês de Ética em Bonn e da Universidade de Berlim. consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes antes da coleta da amostra. As amostras foram codificadas e os dados armazenados de forma anónima.

Os grupos de estudo

Foram recrutados 161 pacientes com carcinoma hepatocelular (HCC) no Bonn e da Universidade de Berlim Departamentos de Gastroenterologia entre 2005 e 2009. Em 80 pacientes HCC estava relacionada com cirrose alcoólica e em 81 pacientes a hepatite crônica C. Estes pacientes HCC foram comparados a 80 e 81 do sexo e idade (± 3 anos), pacientes -matched com cirrose alcoólica e cirrose associada ao HCV, que não tiveram câncer de fígado. pacientes cirróticos sem câncer de fígado tiveram pelo menos um ano de follow-up para se proteger contra a possibilidade de malignidade oculta. 190 voluntários saudáveis ​​da mesma população fundo serviu como uma referência. Os pacientes foram considerados como tendo cirrose alcoólica, se sua história indicou o consumo médio de álcool para exceder 300 g de etanol por semana. Pacientes com infecção mista HCV e aumento do consumo de álcool ( 300 g /semana) foram excluídos deste estudo. A distribuição dos genótipos do HCV foi de 90,0% genótipo 1, 1,3% genótipo 2, 7,5% genótipo 3, 1,3% genótipo 4 em pacientes com câncer de fígado e 61,7% genótipo 1, 22,2% genótipo 2, 8,6% genótipo 3, 7,4% genótipo 4 em HCV-infectados pacientes cirróticos sem HCC. Todos os sujeitos deste estudo foram caucasianos. Outras características demográficas e clínicas estão listadas na tabela 1.

Todos os pacientes foram submetidos a exame clínico cuidadoso, testes laboratoriais padrão e ultra-sonografia abdominal. hepatite virai crónica foi diagnosticada por testes de rotina para o antigénio de superfície da hepatite B, HBV-ADN, ARN-VHC e anticorpos de HCV, respectivamente. Os níveis séricos de ferritina, saturação de transferrina, se necessário testes genéticos HFE, bem como imunoglobulinas quantitativas e auto-anticorpos foram determinados para excluir outras etiologias da doença hepática. A cirrose foi diagnosticado quer por biópsia hepática, a elastografia transitória (rigidez 15 kPa) e sinais de hipertensão portal (esplenomegalia, varizes esofágicas, ascite). O diagnóstico de HCC foi feita por contraste de ressonância magnética e tomografia computadorizada de acordo com os critérios de diagnóstico estabelecidos recentemente [EASL 2009 und AASLD 2010 orientações].

Determinação de alelos p.I148M rs738409

Genomic o DNA foi extraído a partir de 200 mL de EDTA-sangue utilizando o QIAamp sangue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Determinação da

PNPLA3

rs738409 polimorfismo foi realizada por PCR em tempo real LightCycler (Roche, Mannheim, Alemanha), utilizando um ensaio comercial LightSNiP (SimpleProbe) da TIB-MolBiol (Berlim, Alemanha) de acordo com as recomendações do fabricante.

a análise estatística

as freqüências genotípicas foram determinadas e testado para a coerência com o equilíbrio de Hardy-Weinberg usando um teste exato. Freqüências alélicas e genotípicas foram comparados entre casos e controles por chi goodness-of-fit de Pearson

2 de teste e teste de tendência de Armitage, respectivamente (https://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1. pl). Diferenças entre os grupos foram analisadas pelo teste t e teste de Mann-Whitney-U, conforme apropriado.

Os cálculos de energia foram feitas usando Lenth, RV (2006-9) Applets Java para o poder e tamanho da amostra [software Computer], recuperados 25 de agosto de 2011 a partir https://www.stat.uiowa.edu/~rlenth/Power. cálculo de potência foi alvo de assegurar 80% de poder estatístico em erro alfa de 5%.

Para ter em conta ainda os potenciais fatores de risco de confusão de câncer de fígado os efeitos do HCV-genótipo, infecção por HBV, diabetes e obesidade foram avaliadas por comparações univariadas (ANOVA e chi

2-estatísticas), seguido de regressão logística multivariada com seleção de variáveis ​​para a frente. Esta análise foi realizada separadamente em pacientes com doença hepática álcool e relacionadas com o HCV. Parâmetros com efeitos em p 0,1 foram utilizadas na análise multivariada com P 0,05 para a inclusão e p 0.1 de exclusão como critério de seleção para parâmetros nos modelos estatísticos finais

A análise estatística foi realizada com SPSS 18.0 (. SPSS, Munique, Alemanha). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão, salvo indicação contrária.

Resultados

População do estudo

A obesidade e diabetes ocorreram mais frequentemente em cirrose alcoólica sem HCC do que em pacientes alcoólicos com HCC (tabela 1; p 0,05). Os valores significativamente mais elevados GGT onde observadas nos dois grupos com doença hepática alcoólica do que em pacientes com infecção por HCV (p 0,05), enquanto os níveis de ALT foram significativamente mais elevados nos pacientes com hepatite C (p 0,01 cada). Em pacientes com distribuição de cirrose hepática associada ao HCV de classes de Child-Pugh foi equivalente entre pacientes com e sem HCC. Em contrapartida, as classes de Child-Pugh B e C prevaleceu no grupo controle com cirrose induzida pelo álcool sem HCC (p 0,001).

PNPLA3 (r

s738409) polimorfismo do gene e câncer de fígado

a distribuição de

PNPLA3

alelos p.I148M foram consistentes com o equilíbrio de Hardy Weinberg em todos os grupos de estudo (tabela 2). É de notar que a distribuição de

PNPLA3

I148M alelos foi semelhante em controlos saudáveis ​​e em doentes com cirrose associada a HCV e relacionados com o VHC HCC dando origem a 22,9%, 25,3% (p = 0,545) e 30,2% (p = 0,071) freqüências do alelo 148m, respectivamente. Em contraste, a prevalência de pacientes portadores de uma

PNPLA3

variante 148m foi aumentado significativamente nos dois grupos com doença hepática alcoólica e atingiu freqüências alélicas de 53,7% (p 0,001 versus controles saudáveis) e 36,2% (p = 0,033 versus controles saudáveis) em pacientes com e sem carcinoma hepatocelular, respectivamente (figura 1).

Esta figura ilustra as frequências do 148I (parte cinzenta de colunas) e 148m (parte escura colunas) alelos do

PNPLA3

(rs738409) polimorfismo em pacientes com e associado-HCV HCC relacionados com o álcool, os pacientes com cirrose alcoólica e relacionadas com o HCV, que não têm câncer de fígado e controles saudáveis, respectivamente. As diferenças entre os grupos foram comparados por chi

2-estatísticas

A distribuição de

PNPLA3

genótipos p.I148M estão resumidos na tabela 2:. Pacientes com álcool HCC -relacionados composta significativamente mais 148I /M heterozigotos e homozigotos 148m /M do que os controles saudáveis ​​e os dois grupos de pacientes com cirrose alcoólica sem câncer de fígado. A frequência do

PNPLA3

alelo 148m foi aumentado tanto em cirrose induzida pelo álcool (OR = 1,92; 95% -CI: 1,28-2,86; p 0,002) e câncer de fígado associada ao álcool (OR = 4,37; 95% -CI: 2,97-6,43; p 0,001), em comparação com controlos saudáveis. Em pacientes com cirrose alcoólica o risco de HCC foi particularmente ligada à 148m homozigótica /M genótipo (OR = 16,84; 95% -CI: 6,68-42,43; p 0,001). Quando comparamos o risco de o polimorfismo PNPLA3 I148M entre pacientes alcoólicos com e sem HCC, as diferenças na freqüência do alelo (OR = 2,28; 95% -CI: 1,47-3,55; p 0,001), e a frequência da 148m homozigoto /M genótipo (OR = 4,33; 95% -CI: 1,68-11,16; p 0,002) ainda indicou um efeito significativo do alelo 148m na progressão da cirrose hepática alcoólica no sentido do cancro do fígado. Nós não conseguimos encontrar associações significativas entre o polimorfismo e níveis séricos PNPLA3 I148M de enzimas hepáticas ou marcadores da síndrome metabólica (obesidade, diabetes mellitus ou lipídeos séricos) (dados não mostrados).

Para excluir a possibilidade de que as diferenças observadas na distribuição das classes de Child-Pugh pode ter afetado nossa análise, estratificada pacientes em duas classes a /B contra C. Então, nós combinamos nossos pacientes alcoólicas para sexo, idade e da criança dicotomizada – classe Pugh. Após o cruzamento 42 pares permaneceu disponível para uma análise complementar: Nestes pares de pacientes alcoólicos com e sem carcinoma hepatocelular as freqüências alélicas PNPLA3 148m foram 53,6% vs. 31,0% (OR = 2,57; 95% -CI: 1,37-4,84; p = 0,003), respectivamente. Da mesma forma, as frequências do 148m homozigoto /M genótipo foram 31,0% vs 9,5% em pacientes compatíveis com e sem HCC (OR = 6,50; 95% -CI: 1,68-25,16; p = 0,004).

Finalmente, assinalado se o

PNPLA3

polimorfismo p.I148M permaneceu como um fator de risco independente HCC quando outros fatores de risco conhecidos de HCC, como a obesidade, diabetes e infecção por HBV também foram levados em conta. Incluindo todos os pacientes com doença hepática induzida por álcool e HCV, respectivamente, calculou-se modelos de regressão de Cox separadas para identificar os factores de risco de HCC em pacientes com cirrose alcoólica (Tabela 3) e cirrose associada-HCV (Tabela 4). Homozigoto

PNPLA3

148m /M genótipo (OR 2,83; 95% -CI: 1,24-6,42; p = 0,013) foi confirmado como um fator de risco de HCC em cirrose alcoólica. Além disso, genótipo 1 (OR 4,16; 95% -CI: 1,50-11,52; p = 0,006) foi confirmado como um fator de risco de HCC na cirrose associada ao HCV

Discussão

a hepatite C crônica eo consumo de álcool são as principais causas para HCC em populações europeias. Aqui, foi realizada uma análise transversal para estudar o papel potencial do

PNPLA3

variante p.I148M no cancro do fígado associado com doença hepática alcoólica, em comparação com pacientes com HCC induzida pelo HCV. Encontramos uma prevalência cada vez maior do alelo 148m em pacientes com cirrose alcoólica (36,2%) e HCC associado ao álcool (53,7%) em comparação com controles saudáveis ​​(22,9%), enquanto que diferenças na prevalência desta variante genética entre controles saudáveis e cirrose associada ao HCV (25,3%) e HCC relacionado com o HCV (30,2%) eram menores e não é estatisticamente significativa. Esses achados estão de acordo com observações anteriores na doença hepática alcoólica e reforça o conceito de que a variante PNPLA3 148m está associada a danos no fígado mais severa e cirrose em doença hepática alcoólica [17], [18]. Aqui, podemos adicionar a nova observação de que esta variante genética é também um forte factor de risco genético associado para HCC-álcool, o que contribui para uma aproximadamente 4 vezes maior risco de portadores homozigóticos do alelo 148m, mesmo na presença de cirrose estabelecida. Esta ideia é reforçada pelo nosso modelo de regressão multivariada, que confirmou

PNPLA3

148m homozygosity como fatores de risco independentes para HCC entre nossos pacientes com doença hepática alcoólica. Por outro lado, o

PNPLA3

variante 148m teve apenas efeitos menores no risco de HCC em cirrose associada com hepatite C crónica sugerindo que esta variante genética não é um gene do tumor por si só, mas actua apenas em combinação com álcool substancial exposição e acumulação de lípidos hepática.

Dois estudos recentes de Itália relataram efeitos fortes da

PNPLA3

variante 148m também sobre o risco de HCC na hepatite C crónica [19], [20], enquanto um terceiro estudo italiano sugeriu que este alelo foi predominantemente associada à cirrose metabólica [21]. Em linha com este último relatório, encontramos apenas um pequeno efeito da

PNPLA3

variante 148m sobre o risco de HCC nos nossos pacientes com infecção pelo HCV, em quem viés do consumo concomitante de álcool haviam sido excluídos com muito cuidado. Em nossos pacientes infectados pelo VHC

PNPLA3

148m /M homozygosity revelou odds ratio de 1,666 para o risco de câncer de fígado (tabela 4), que não atingiu significância estatística com o tamanho da amostra. cálculo de alimentação indicado a necessidade de 670 pacientes por grupo de estudo, de modo a detectar a significância estatística (p 0,05) para esta associação putativo. Por outro lado as discrepâncias observadas entre os vários estudos podem refletir diferenças na dieta inadvertidas entre as populações de estudo ou, provavelmente, o fato de que pacientes com infecção pelo HCV combinados e ingestão de álcool ( 300 g /semana) não tinha sido suficientemente tidos em conta. Esta explicação estaria em linha com o conceito de que a acumulação de lípidos hepática na hepatite C crónica genótipo 1 está ligada à presença de outros factores metabólicos adicionais, tais como diabetes e obesidade [22]. É importante ressaltar que o efeito atribuível ao

PNPLA3

polimorfismo p.I138M na cirrose nutricional não se correlacionou com a idade, sexo, índice de massa corporal ou diabetes, de acordo com relatórios anteriores [8].

Finalmente , houve um desequilíbrio acentuado na gravidade da doença hepática entre doentes com e sem HCC em cirrose induzida por álcool. Este desequilíbrio possivelmente reflete o fato de que os pacientes com cirrose induzida pelo álcool precoce (Child-Pugh classe A) só raramente presente em serviços hospitalares, se HCC está ausente. Assim, os pacientes do grupo de controle relacionados com o álcool sem HCC tinham cirrose significativamente mais avançados do que os pacientes com cirrose induzida pelo álcool e HCC. Para verificar se esta constatação tinha tendenciosa nossa análise, nós também analisamos o subgrupo de pacientes, que poderiam ser combinados para as classes de Child-Pugh, além de sexo e idade. Em linha com a nossa hipótese de esta análise complementar confirmou uma associação significativa entre o

PNPLA3

alelo 148m – e em particular a

PNPLA3

148m /M genótipo – e HCC (OR = 6,50; 95% – IC:. 1,68-25,16; p = 0,004)

o papel fisiológico da proteína PNPLA3 ainda não é clara. O

PNPLA3

gene codifica para uma enzima que exibe tanto hidrolase triglicérides e atividade transacylation in vitro [23]. A substituição da metionina na posição 148 interrompe a actividade de hidrolase de triglicéridos [24], mas PNPLA3 ablação em duas estirpes diferentes de rato não teve como consequência a acumulação de lípidos hepática e lesão hepática sob uma variedade de dietas diferentes [25]. Por outro lado sobre-expressão de

PNPLA3

148m em ratos aumentou o teor de lipídio hepático favorecendo uma mutação de ganho de função [24]. Além disso, uma variedade de outras interacções intracelulares também são discutidos como alternativas potenciais mecanismos patogénicos [26]. No contexto da esteatohepatite não alcoólica

PNPLA3

alelo de risco promove a acumulação de lípidos hepática e gravidade da fibrose [6], [8], [10], [27], [28]. Da mesma forma, o consumo regular de álcool causa danos ao fígado via esteato-hepatite. Há também evidências de que biópsias hepáticas de portadores de um

PNPLA3

alelo 148m, em particular os indivíduos homozigotos 148m, apresentam maior dano inflamação hepática e do fígado do que os pacientes com o gene do tipo selvagem na mesma extensão da deposição de lipídios [27 ]. Assim, pode ser aumentada a actividade inflamatória e da fibrose hepática em resposta à acumulação de lípidos, a qual está associada com o

PNPLA3

variante 148m que aumenta o risco de carcinoma hepatocelular na cirrose alcoólica.

Qualquer que seja a base subjacente mecanismos, a ligação entre o polimorfismo PNPLA3 e HCC na doença hepática alcoólica parece forte o suficiente para suportar as consequências práticas: a presença de um

PNPLA3

alelo 148m e, especialmente,

PNPLA3

148m homozigose, pode fornecer uma ferramenta fácil de identificar os indivíduos em risco especial de HCC em todas as fases de lesão hepática alcoólica. Assim, as estratégias de prevenção e tratamento HCC futuros também deve levar em conta o efeito combinado do

PNPLA3

polimorfismo p.I148M e álcool em pacientes com doença hepática crônica.