Abstract

Os estudos epidemiológicos têm mostrado que o uso regular de drogas não esteróides anti-inflamatórias (NSAIDs) está associado a um risco reduzido de vários cancros. Além disso, in vitro e experiências em modelos de ratos demonstraram que a iniciação do tumor AINEs diminuição e /ou progressão de vários cancros. No entanto, existem estudos pré-clínicos limitados investigando os efeitos dos AINEs em câncer de ovário. Aqui, temos estudado os efeitos de dois AINEs, o diclofenac e indometacina, em linhas celulares de cancro do ovário e em um rato modelo de xenotransplante. Diclofenac e indometacina tratamento diminuiu o crescimento das células através da indução de paragem do ciclo celular e apoptose. Além disso, o diclofenac e indometacina reduziu o volume tumoral num modelo de xenoenxerto de cancro do ovário. Para identificar possíveis vias moleculares que medeiam os efeitos do tratamento com AINE em cancro do ovário, foi realizada a análise de microarray de células cancerosas do ovário, tratadas com indometacina ou diclofenac. Curiosamente, vários dos genes encontrados downregulated seguinte diclofenac ou indometacina tratamento são genes alvo transcricional de E2F1. E2F1 foi regulada negativamente ao nível do ARNm e da proteína por tratamento com diclofenac e indometacina, e a sobre-expressão de células de E2F1 resgatados os efeitos inibidores do crescimento de diclofenac e indometacina. Em conclusão, os AINE diclofenac e indometacina exercer um efeito anti-proliferativo em cancro do ovário in vitro e in vivo e os efeitos dos AINEs, pode ser mediada, em parte, pela regulação negativa de E2F1

citação:. Valle BL, D ‘Souza T, Becker KG, Madeira WH III, Zhang Y, Wersto RP, et al. (2013) não-esteróides anti-inflamatórios Diminuir E2F1 Expressão e inibir o crescimento celular em células de câncer de ovário. PLoS ONE 8 (4): e61836. doi: 10.1371 /journal.pone.0061836

editor: Resham Bhattacharya, Clínica Mayo, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Janeiro, 2013; Aceito: 25 de fevereiro de 2013; Publicação: 24 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Valle et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi suportado inteiramente pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional sobre Envelhecimento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas. Quando detectado precocemente, a taxa de sobrevida em 5 anos é tão alta quanto 90%, mas, infelizmente, a grande maioria dos casos são diagnosticados como doença em estágio final, que é muitas vezes resistentes à quimioterapia convencional. Consequentemente, a taxa de sobrevida em 5 anos global de cancro do ovário é de aproximadamente 30-40%. Portanto, é imperativo para investigar novas abordagens para o tratamento e gestão desta doença mortal.

Os estudos epidemiológicos têm sugerido que o uso regular de não-esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) está associada com um risco reduzido de vários cancros, incluindo o colorrectal, da mama, do pulmão e do ovário [1], [2], [3]. Além disso, estudos in vitro e em animais mostraram que os AINE podem diminuir a iniciação e /ou progressão de vários cancros [4], [5], [6]. Por exemplo, a indometacina AINE inibiu o crescimento de cancros do cólon induzidos quimicamente em ratos [7], [8]. Além disso, a indometacina reduziu o crescimento dos tumores mamários espontâneos novos e estabelecidos [9]. O diclofenaco NSAID diminuiu o crescimento do pâncreas e não-pequenas xenoenxertos de cancro de pulmão de células [10], [11]. No entanto, existem estudos pré-clínicos limitados investigando os efeitos e mecanismos de ação do diclofenaco e indometacina no cancro do ovário [12], [13]. A este respeito, Zerbini et. ai. informou que o diclofenaco diminuição do volume do tumor em ratos SCID com células de cancro do ovário SKOV-3 xenotransplantes por ~ 20% [12]. No entanto, outro estudo relatou que a indometacina não teve efeito sobre o crescimento do sarcoma de células reticulares ovário M5076 [13].

Para o nosso conhecimento, não há relatos sobre os efeitos da indometacina especificamente em câncer epitelial de ovário, que compreende a maioria dos cancros do ovário (aproximadamente 90%). Neste estudo, foram investigados os efeitos da indometacina e de diclofenac AINEs em células de cancro do ovário. Relatamos AINEs que reduziu significativamente o crescimento de células de cancro do ovário in vitro e in vivo, e, usando a análise de micromatriz, identificou-se o factor de transcrição E2F1 como mediador do efeito. É importante salientar que descobriram que a expressão ectópica E2F1 reverteu os efeitos inibidores do crescimento de NSAIDs que sugerem que NSAIDs poderia atuar em parte através de um mecanismo que envolve E2F1 regulação baixa em células de cancro do ovário.

declaração de Ética Materiais e Métodos

Todos os procedimentos realizados em camundongos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal do Instituto Nacional sobre Envelhecimento. Este estudo foi realizado de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health.

Reagentes

O diclofenaco e indometacina foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). Os anticorpos anti-E2F1, E2F4-anti, anti-MCM2 e anti-MCM4 foram adquiridos a Proteintech (Chicago, IL). Os anticorpos de Abcam (Cambridge, MA) reconhecido GAPDH, e os anticorpos de Cell Signaling (Danvers, MA) reconhecido Rb. E2F1 e eGFP plasmídeos de expressão foram a partir GeneCopoeia (Rockville, MD). Rb siRNA (sc-29468) foi de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Cultura celular e transfecções

As linhas de células de adenocarcinoma de ovário seroso HEY, OVCAR5 e UCI-101 foram gentilmente fornecidas as seguintes: Hey células por Dr. Robert C. Bast [14], as células OVCAR5 por Dr. Thomas C. Hamilton [15] e células UCI-101 por Dr. Michael J. Birrer [16]. As células foram cultivadas em meio de cultura de McCoy 5A suplementado com soro bovino fetal a 10% e Pen /Strep (100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina), e incubou-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 . Todas as experiências foram realizadas em meios contendo soro

Para as transfecções, ei células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

4 células em placas de 12 poços e transientemente transfectadas com eGFP E2F1 ou como controlo.; ou Rb ou ARNsi de controlo durante 24 horas, utilizando Gene X-treme 9 ADN Transfection Reagent (Roche) ou Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. As células foram então novamente plaqueadas a densidades de 5 × 10

3 células em placas de 6 poços e tratados durante 24-48 horas com 300 uM de diclofenac ou indometacina. As células foram então lisadas e analisadas por immunoblotting ou lavados e utilizados em ensaios clonog�icas.

MTS e ensaios clonog�icas

Para MTS ensaios de viabilidade (Promega), HEY, OVCAR5 ou UCI-101 células foram semeadas a uma densidade de 7 x 10

3 células em placas de 96 poços e tratadas durante 48 horas com 300 uM de diclofenac ou indometacina. As células foram então incubadas com reagentes de MTS e a absorvância a 490 nm foi medida após incubação 1-4 h a 37 ° C. Para os ensaios de viabilidade de dose-dependência, as células foram tratadas durante 24 horas com concentrações crescentes de diclofenac ou indometacina (50, 100, 250, e 500 uM). Para os ensaios clonogénicos, ei, OVCAR5 ou UCI-101 células foram semeadas a uma densidade de 3 x 10

3 células em placas de 6 poços e tratadas durante 48 horas com 300 uM de diclofenac ou indometacina, lavou-se e deixou-se crescer durante 10 dias. As colónias foram então visualizadas através de coloração com violeta de cristal (0,5% de violeta cristal em 50% de metanol).

ciclo celular e apoptose análise

e tratou-se durante 24 ou 48 horas com 300 uM de diclofenac ou indometacina . As células foram marcadas com iodeto de propidio e analisadas num FACS Calibre Citómetro de fluxo (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Para a análise da apoptose, as células foram tratadas durante 48 ou 96 horas, com 300