Abstract
A célula-tronco do câncer teoria (CSC) prevê que uma pequena fração de células cancerosas possuem atividade auto-renovação única e mediar a iniciação do tumor e propagação. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos na regulação do CSC permanece incerto, interferindo com a segmentação eficaz de CSCs na terapia do cancro. Aqui nós investigamos a hipótese de que Rac1, uma Rho GTPase implicada na proliferação de células cancerosas e a invasão, é essencial para a iniciação do tumor e metástases de adenocarcinoma do pulmão de células não pequenas humano (NSCLA). Rac1 knockdown por shRNA suprimiu as actividades tumorigénicas de linhas celulares e espécimes humanos NSCLA NSCLA paciente primárias, incluindo efeitos sobre a invasão, proliferação, crescimento independente de ancoragem, a formação de esfera e colonização pulmonar. população isolado lado (SP), as células que representam CSCs putativos de células NSCLA humanos continham níveis elevados de Rac1-GTP, reforçada
in vitro
migração, invasão, aumentado
In vivo
tumorais iniciar e pulmão colonizadoras atividades em ratinhos xenoenxertados. No entanto, a actividade de CSC também foi detectada dentro da população não-SP, sugerindo a importância de direccionamento terapêutico de todas as células dentro de um tumor. Além disso, a segmentação farmacológica ou shRNA de Rac1 inibiu as atividades tumorigênicos de ambas as células SP e não-SP NSCLA. Estes estudos indicam que Rac1 representa um alvo útil na NSCLA, e o bloqueio pode ter valor terapêutico em suprimir a proliferação CSC e metástase
citação:. Akunuru S, J Palumbo, Zhai QJ, Zheng Y (2011) Targeting Rac1 suprime humano não-pequenas células do cancro do pulmão Adenocarcinoma Stem atividade das células. PLoS ONE 6 (2): e16951. doi: 10.1371 /journal.pone.0016951
Edição: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil
Recebido: 13 Agosto, 2010; Aceito: 18 de janeiro de 2011; Publicação: 09 de fevereiro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Akunuru et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH R01 CA141341 e T32 HL091805. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo. A doença é amplamente classificados em dois grupos histopatológicos – cancro de células pequenas do pulmão (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), com o grupo mais tarde representando ~ 80% dos casos de cancro do pulmão. Os adenocarcinomas ocorrer em cerca de 55% do NSCLC e 40% de todos os cancros do pulmão. Apesar do desenvolvimento contínuo do cancro terapêutica, atualmente a taxa de sobrevivência de cinco anos em geral para pacientes com câncer de pulmão é inferior a 15% [1]. Muitas vezes, quimioterapia, radioterapia ou cirurgia existente pode apenas parcialmente remover a carga tumoral, deixando para trás as células cancerosas resistentes a terapias que podem regenerar o tumor no sítio primário e /ou metástase para sites secundários para iniciar novos tumores.
Publicações recentes têm relatado a identificação de cancro iniciar ou cancro de células estaminais (CSCs) a partir de sangue [2], cérebro [3], da mama [4], do cólon [5], [6], hepática [7], do pâncreas [8] , prostrados [9], [10], bem como cancros do pulmão [11], [12], [13]. Os CSCs são identificadas quer por propriedades das células únicas, tais como exclusão de corante Hoechst (Hoechst populacionais lado dye-baixo) ou por expressão de marcadores de superfície específicos, tais como CD133, ALDH, ou CD24 /CD44, e eles são frequentemente associados à quimioterapia e radioterapia resistência. CSCs são definidas pela sua capacidade como células estaminais auto-renovação, a sua capacidade de se diferenciarem em tipos de células que constituem a maior parte do tumor, e para iniciar tumores a uma dosagem significativamente reduzida em estudos de xenoenxerto de ratinho [7], [14]. células NSCLC iniciadores foram isolados a partir de linhas celulares de cancro do pulmão humano baseado no aumento da actividade de efluxo de corante Hoechst 33342 [12]. A população de baixa lado Hoechst corante células (SP) são enriquecidos para a atividade iniciando tumor em comparação com a população não-side (NSP) células e expressar ABCG2 elevada e outros transportadores de resistência multi-droga que pode mediar resistência terapêutica.
A o avanço da teoria células estaminais cancro levou à proposta de que a segmentação do CSC pode levar à erradicação de células de tumor resistentes em pacientes de terapia residual. Recentemente Gupta
et al
sugeriu que induzir a diferenciação de CSC usando salinomicina, um ionóforo de potássio seletiva pode bloquear a atividade mamária CSC e metástase [15]. No entanto, vários relatórios recentes têm mostrado que os CSCs e não-CSCs pode ser de plástico e inter-convertíveis na natureza [16] – [17]. Por exemplo, as células negativas JARID1 foram mostrados para representar uma população transitória ciclismo lento não-CSC que podem dar origem a ciclagem rápida JARID1 CSCs positivos em pacientes com melanoma (13). Há evidências de que não CSCs pode converter a CSCs através da interacção com a matriz extracelular e outros estímulos ambientais (14). Isto levanta a possibilidade de que se aproxima unicamente segmentação CSCs não são suficientes para a terapia do cancro, porque o restante não-CSCs podem ser reprogramadas de modo a CSCs para reiniciar a tumorigénese.
Rac1 é um interruptor molecular intracelular que transduz sinais em uma variedade de vias oncogênicos. É frequentemente encontrado é para ser elevada na expressão e /ou actividade numa variedade de células tumorais e regular os processos celulares importantes, relevantes para o comportamento de células de cancro, incluindo expressão de genes, a proliferação celular, o citoesqueleto de actina pode ser notada e é essencial para a migração direccional de células e a adesão. actividade Rac1 pode influenciar a progressão do ciclo celular e sobrevivência, e demonstrou-se ser necessário no crescimento do tumor de pulmão mediada K-ras em um modelo de cancro de pulmão de murino espontânea [18]. No entanto, se Rac1 contribui para o crescimento do tumor NSCLA humano e /ou metástase, especialmente se Rac1 desempenha um papel na CSCs regulam, requer uma investigação mais aprofundada. No presente trabalho que mostram que Rac1 é criticamente envolvidos na NSCLA migração celular, invasão e metástases do pulmão de células SP, portanto, servir como um alvo terapêutico útil através da inibição da iniciação do tumor e metástases da população de CSC NSCLA.
materiais e Métodos
cultura celular
A549, H23, H1299 e células H441 foram cultivadas de acordo com as diretrizes da ATCC. células epiteliais brônquicas humanas (HBEC) foram generosa oferta do Dr. Jeffery Whitsett (do Cincinnati Children Hospital Medical Center). amostras de adenocarcinoma de pulmão de pacientes primários foram obtidos com o consentimento por escrito dos pacientes no âmbito de um protocolo Instituição Review Board aprovado pela Universidade de Cincinnati Comitê de Revisão Científica (IRB # 01-09-27-07), e foram usados nas experiências de acordo com o Hospital Infantil de Cincinnati Medical centro Comitê de revisão Científica (IRB # 07-06-57) que a identidade dos pacientes permanece anônimo. Os tumores foram picadas e ressuspensas em DMEM contendo 0,5 mg /ml de Liberase (Roche) e 1% de penicilina e estreptomicina. Após 45 minutos de incubação, suspensão de células foi passada através do filtro de 100 micron e células totais foram lavadas, colocadas em placas em soro fetal bovino a 10% contendo meio de crescimento. células cancerosas epiteliais foram enriquecidos por células crescendo em condições esfera da cultura.
A549, células H23, H1299, H441, HBEC ou adenocarcinoma primário foram infectadas com lentivírus expressando YFP com tag mexidos shRNA (SCR) ou Rac1 shRNA1 ou Rac1 shRNA2 descrito previamente [19]. construto shRNA mexidos foi generosa oferta do Dr. Lee Grimes (do Cincinnati Children Hospital Medical Center) e Rac1 shRNA construções foram generosa oferta do Dr. Jim Mulloy (do Cincinnati Children Hospital Medical Center). Após 72 horas de infecção, as células positivas YFP foram classificados utilizando FACS e utilizado para experiências diferentes.
Para as experiências de salvamento mutantes Rac1, quatro mutações pontuais de desadaptação foram feitas em sítios de ligação de ADNc Rac1 shRNA no vector utilizando MIEG3 kit de mutagénese dirigida ao local (Stratagene tecnologias, Agilent) conforme as instruções do fabricante. As células A549 foram infectadas com retrovírus que expressam Rac1 mutante e, após 72 horas, as células positivas para GFP foram separadas usando FACS. As células foram subsequentemente infectadas com lentivírus expressando SCR shRNA ou Rac1 shRNA. Após 72 horas, GFP
+ YFP
+ células foram usadas para realizar vários ensaios funcionais.
ensaios de proliferação celular
As células foram cultivadas (2000 células /poço) em 96 poços placa em triplicado. Número de células vivas em cada dia foi determinada por ensaio não radioactivo de proliferação MTS (Promega).
Para o ensaio de incorporação de BrdU, de BrdU (10 ug /ml) foi adicionado às células a 60% de confluência durante 2 horas a 37 ° C. As células foram colhidas, fixadas, coradas e análise FACS foi realizada como descrito anteriormente [20]. Para detectar células positivas para BrdU em CD133
+ e CD133
– populações, as células foram coradas com anticorpo CD133 /2-APC (Miltenyi Biotechnologies Inc.), após coloração BrdU. As células positivas para BrdU foram fechado de ambos CD133
+ e CD133
-. Células
Macio formação de colónias de agar ensaio
As células foram semeadas (10.000 células /poço) em 0,3% de agarose de baixo ponto de fusão feita em meio de crescimento contendo soro fetal bovino a 10% e em camadas em cima de 0,6% de agarose num meio de crescimento. Número de colónias formadas após uma 2 semanas (A549, H1299) ou 3 semanas (H441, H23) foi contado em microscópio de luz.
Sphere ensaio de formação de
As células (10.000 células /ml) foram plaqueadas em condições de cultura de suspensão em esfera isento de soro meios (DMEM: F12 contendo 0,4% de BSA, 10 ug /ml de insulina, 10 ng /mL de EGF, 10 ng /ml de FGF) em placas de 6 poços pré-revestidas com 1% de agarose para evitar ligação de células. O meio foi substituído a cada 2-3 dias e o número de esferas formadas em 2 semanas foi contado ao microscópio de luz.
Ensaio de aderência de
As placas foram revestidas com 50 ug /ml de f ibronectina durante a noite a 4 ° C e bloqueadas com BSA a 2% durante 2 horas a 37 ° C. Após o bloqueio, as células foram plaqueadas (10000 células /poço) e incubou-se a 37 ° C durante 60 minutos. As células não aderentes foram aspirados e as placas foram lavadas três vezes com PBS. Número de células ligados aos poços após lavagens foram determinadas usando ensaio MTS proliferação não-radioativo.
ensaios de migração e invasão
Para o ensaio de migração trans-bem, 50.000 células foram adicionadas à câmara superior em meio isento de soro e migração a 37 ° C no sentido de FBS a 10% contendo meio de crescimento foi determinada quer após 24 horas (A549, H1299, H23) ou 48 horas (H441). Células que migraram através da membrana foram fixadas, coradas com corante Giemsa (Sigma) e contadas sob microscópio de luz.
Para o ensaio de invasão, as câmaras inferiores da invasão Matrigel placas revestidas foram revestidas com 10 ug /ml de f ibronectina durante a noite a 4 ° C e as células invasoras através de Matrigel foram fixadas e coradas quer após 48 horas (células A549) ou 72 horas (H441) células semelhantes ao ensaio de migração.
imuno-coloração
As células foram plaqueadas em fibronectina lâminas revestidas e depois de 18-20 células horas foram fixadas usando 3,7% de formaldeído. As células foram coradas para citoesqueleto de actina (rodamina-faloidina, Invitrogen), núcleos (DAPI, Invitrogen), utilizando os métodos de imuno-coloração padrão descrito anteriormente [21]. Alternativamente, as células foram coradas quer com fosfo-FAK (Cinase de Adesão Focal, Millipore) ou vinculina (Sigma) ou fosfo-paxilina (Cell signaling Technologies).
Side-população, coloração de células CD133 e isolamento
As células são tripsinizadas e lavadas com PBS. As células são coradas com Hoechst 33342 tampão de coloração, tal como descrito anteriormente, a uma concentração final de 5 ug /ml de Hoechst 33342 [22] para a população lateral (SP), ou com anticorpo anti-CD133 CD133 de células positivas. As células foram analisados ou classificadas para SP /CD133
+ células por citometria de fluxo.
Para obter Rac1 knockdown em SP ou CD133
+ células, as células foram infectadas com lentivírus expressando YFP marcado scr ou Rac1 shRNA e após 72 horas as células foram coradas para a população lado ou CD133. células YFP SP positivo ou não-SP, foram ordenados para qualquer análise de Western ou ensaios funcionais.
Rac1-GTP suspenso ensaio
Para executar Rac1 puxar para baixo os ensaios, as células foram lisadas pela adição de lise tampão contendo 20 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 100 mM, MgCl 10 mM, 1% de Triton X-100, 0,2% de SDS, de protease e inibidores de fosfatase directamente para as células aderentes. lisados celulares contendo quantidades iguais de proteína foram incubados com esferas de glutationa conjugado com GST-PAK1 contendo domínio interagindo Rac1 ativa e processado como descrito anteriormente [23].
Lung ensaio de colonização
O uso de ratos como anfitriões xenoenxerto foi aprovado pelo comitê IACUC na casa de Cincinnati Children Hospital Medical Center (Protocolo # 8D06052). número especificado de células foram suspensas em PBS e injectadas por via intravenosa em imunológico comprometido NOD /SCID /yc – /- ratos (NSG) por injecção na veia da cauda. No final do estudo, os pulmões foram fixados em solução de Bouin para contar o número de tumores
xenoenxerto subcutâneo ensaio
número especificado de células são suspensas em 200 ul de PBS:. Mistura Matrigel (1 :1 volume) e injectado subcutaneamente nos flancos de imunitário comprometido NOD /SCID /γ – /- (ratinhos) NSG. Depois de 3-4 semanas de tamanho do tumor injeção foi medido semanalmente usando pinças e o volume do tumor foi determinado por meio da fórmula 0.52XLXW
2 cm3.
Tumor homing célula de ensaio
Células expressando YFP foram injectadas intravenosamente em ratinhos NSG. Após 24 horas, os pulmões foram isolados após perfusão com PBS. células pulmonares totais foram isolados por digestão Liberase e contagem total de células foi determinado por contador de células Hemavet. Percentagem de células positivas YFP foi determinada por análise de citometria de fluxo de células pulmonares totais. Índice homing foi determinada pelo cálculo percentual YFP células positivas hospedadas para pulmão normalizada para controlar células.
Resultados
Rac1 segmentação proliferação prejudica e formação de colónias de células NSCLA humanos
Para investigar o papel da GTPase Rac1 no crescimento celular NSCLA, A549, H441, H1299, e as células H23 foram infectadas com lentivírus ou SCR que codifica Rac1 shRNA (shRNA1, 2). A análise por Western blot revelou knockdown eficiente da proteína Rac1 com ambos shRNA constrói (50% e 90% respectivamente, em comparação com SCR) em células A549 (Fig. 1A). Rac1shRNA1 expressão reduzida parcialmente a proliferação das células do cancro do pulmão, enquanto Rac1shRNA2 crescimento celular mais potentemente inibida (Fig. 1B) e provocou uma redução significativa do número de colónias que cresceram no ensaio de formação de colónias em agar mole (Fig. 1C). Além disso, a análise do ciclo celular realizada por coloração BrdU e análise FACS revelou uma diminuição na fase S e um aumento correspondente na fase G0 /G1 do ciclo celular após Rac1 direccionamento (Fig. 1D). Em células H441, Rac1 shRNA2 levou à redução -75% da proteína Rac1 (Fig. S1A), e um efeito menor em relação sobre a proliferação (Fig. S1B). Em células H1299 e H23, Rac1 knockdown causou uma redução significativa na proliferação (Fig. S1C, S1E) e a formação de colónias em agar mole (FIG. S1D, S1F). Para determinar se os efeitos sobre a proliferação knockdown Rac1 e crescimento em agar mole são específicos para Rac1, realizamos-resistentes shRNA ADNc Rac1 experiências salvamento mutante nas células knockdown. Expressando um cDNA mutante resistente Rac1 shRNA poderia principalmente resgatar a proliferação de Rac1 derrubado em células A549 sem um efeito detectável na scr shRNA trataram células de controlo (Fig. 1E). Da mesma forma, observamos um resgate da formação de colónias em agar mole, expressando-resistente shRNA mutante cDNA Rac1 (Fig. 1F). Juntos, estes resultados indicam que Rac1 é necessária para o potencial proliferativo de células NSCLA.
(A) Os lisados celulares recolhidos a partir de qualquer mexidos shRNA (SCR) ou shRNA Rac1 (shRNA1, shRNA2) células A549 foram submetidos a Rac1 A análise de western blot. GAPDH foi usada como controlo de carga. (B) As células infectadas foram seleccionadas e plaqueadas no ensaio em placa e a proliferação de 96 poços foi realizada usando o reagente MTS. O ensaio foi realizado em triplicado e acima é um representativos de três experiências independentes. (C) As células infectadas foram classificados, plaqueadas para o ensaio de colónias de agar mole e colónias por campo foram contados após 2 semanas. O ensaio foi realizado em triplicado e acima é um representativos de três experiências independentes. (D) As células infectadas foram classificados e incubadas com BrdU na fase logarítmica do crescimento celular. As células são trypisinized, coradas com anticorpo BrdU, 7AAD e análise do ciclo celular foi efectuada utilizando citometria de fluxo. O ensaio foi realizado em triplicado e acima é um representativos de quatro experiências independentes. As barras de erro representam DP. (E) As células de controlo ou células que expressam shRNA mutante resistente Rac1 foram infectadas com o SCR ou shRNAs Rac1, classificados e plaqueadas em placas de 96 poços. ensaio de proliferação foi realizada utilizando o reagente de MTS. O ensaio foi realizado em triplicado e acima é um representativos de duas experiências independentes. (F) As células infectadas foram classificados, plaqueadas para o ensaio de colónias de agar mole e as colónias foram contadas após 10 dias. Ensaio foi realizado em triplicado e acima é um representante de dois experimentos independentes.
Rac1 knockdown resultados na diminuição da adesão, migração e invasão de células NSCLA
De acordo com o papel conhecido de Rac1 na regulação do citoesqueleto, Rac1 knockdown em ambas as células A549 e H441 resultou na organização do citoesqueleto de actina alterada (dados não apresentados). Supressão de Rac1 em células A549 causada diminuiu a formação do complexo de adesão focal, com células de controlo que exibem complexos de adesão focais robustos visualizadas por imunocoloração para as proteínas de adesão focal P-FAK, vinculina, e p-paxilina enquanto as células Rac1shRNA2 infectados formação do complexo reduzida adesão focal demonstrado (Fig. 2A). Observou-se também diminuiu p-FAK, p-paxilina e p-MLC em células knockdown Rac1 em comparação com células de controlo por análise de Western blot (Fig. S2A). Consistente com os complexos de adesão diminuída em células infectadas Rac1shRNA, adesão à fibronectina foi reduzida nestas células em comparação com células de controlo (Fig. 2B). Semelhante ao efeito sobre a proliferação, Rac1 knockdown parcial em células H441 resultou num efeito relativamente menor na adesão à fibronectina em comparação com células A549 (Fig. S2B). Além disso, Rac1 knockdown em ambas as células A549 e H441 resultou numa diminuição da actividade migração e invasão trans bem em comparação com células de controlo (Figuras 2C, 2D, . A Fig. S2C, Fig S2D.). Da mesma forma, Rac1 knockdown no H1299 ou H23 células diminuiu drasticamente migração em comparação com células de controlo (Fig. S2E, Fig. S2F). Expressando um mutante resistente shRNA ADNc Rac1 foi capaz de resgatar o fenótipo completamente a migração de Rac1 knockdown em células A549 (Fig. 2E). Estes dados demonstram a importância da Rac1 em NSCLA adesão de células de cancro, migração e invasão.
células A549 infectadas (A) foram classificadas, semeadas em lâminas revestidas com fibronectina e coradas quer com p-FAK (painel superior) ou vinculina (painel do meio) ou p-Paxillin (painel inferior) e DAPI. As imagens foram coletados por meio de microscópio de fluorescência em 40X. Imagens acima são representativas de diversas imagens obtidas a partir de duas experiências independentes. (B) As células A549 foram semeadas em classificados fibronectina revestido placa de 96 poços para
In vitro
ensaio de adesão e células ligadas à placa depois de 1 hora foi determinada utilizando reagente de MTS. ensaio de adesão foi efectuado com cinco réplicas e os dados são representativos de três experiências independentes. (C) As células seleccionadas foram plaqueadas em placas bem trans-migração e a migração de células para 10% de FBS foi medida durante a noite. O ensaio foi realizado em replicados e os dados acima foi representativos de três experiências independentes. (D) As células A549 foram semeadas em ordenadas Matrigel placas revestidas invasão e a migração de células para 10% de FBS e 10 ng /ml de fibronectina foi medida após 48 horas. O ensaio foi realizado em triplicado e a acima é um representativos de três experiências independentes. As barras de erro representam DP. (E) de controle ou células que expressam mutante resistente Rac1shRNA foram infectados com Rac1 shRNA e ordenados. As células foram plaqueadas em placas bem trans-migração e a migração de células para 10% de FBS foi medida durante a noite. Ensaio foi realizado em triplicado e, acima de dados foi representativos de duas experiências independentes.
Rac1 knockdown previne a colonização de pulmão de células NSCLA em camundongos
Em seguida, examinaram o efeito da Rac1 knockdown em tumorigénese e comportamento metastático de células de adenocarcinoma de pulmão. Rac1 knockdown ou células de controlo foram injectados por via intravenosa em ratinhos imunodeficientes NSG em um modelo de colonização pulmonar. Tanto a A549 (Fig. 3A) e células H441 (Fig. S3A) que expressam Scr (500.000 células /rato) causou a formação de tumores nos pulmões, enquanto as células de knockdown Rac1 (500.000 células /ratinho) não conseguiu formar tumores nos pulmões 8 semanas pós injecção. Como esperado, Rac1shRNA1 células que mostraram uma proteína Rac1 parcial knockdown formado número de tumores infectados reduzida. Para determinar se o efeito sobre a colonização pulmonar está relacionada com um defeito das células homing Rac1 knockdown no pulmão, foi testada a capacidade das células tumorais para casa para o tecido pulmonar de 48 horas após a injecção na veia da cauda. A análise de citometria de fluxo revelou que a YFP
células knockdown + Rac1 indicadas diminuiu significativamente a actividade homing pulmão em comparação com a YFP
+ Scr células (Fig. 3B). Além disso, xenoenxerto subcutânea de células tumorais (500.000 células /ratinho) em ratinhos NSG estabelecido que as células de knockdown Rac1 tinha atrasado o desenvolvimento do tumor e o volume do tumor reduzido em comparação com as células de controlo (Fig. 3C). Curiosamente, esfera formação de células H441, que se correlaciona com o tumor potencial de início, também foi comprometida após Rac1 knockdown (Fig. S3B), enquanto que nenhum efeito foi observado por Rac1 knockdown sobre a actividade de formação esfera das células de controlo não transformar HBEC (Fig. S3C ). Assim, é provável que a colonização pulmonar de células tumorais efeitos Rac1 knockdown, crescimento devido a um efeito combinado sobre a homing proliferação de células de cancro e no pulmão.
(A), 5 × 10
5 células A549 foram injectadas na veia da cauda de ratinhos NSG (n = 6 por condição), e os pulmões foram dissecados após 8 semanas. Pulmão foram corados com uma solução de Bouins e descoradas em etanol a 70%. A quantificação dos dados de colonização pulmonar foi mostrado no painel da direita. barra de erro representa SE. Representada é uma representativos de duas experiências independentes. ensaio (B) homing célula tumoral foi efectuada tal como descrito nos métodos (n = 6 por estado em cada experiência). índice Homing foi medida como percentagem de células positivas YFP detectados em pulmão, normalizadas para controlar. Representada é uma representativos de três experiências independentes. (C) 5 × 10
células infectadas 5 SCR ou Rac1 shRNA foram injectados por via subcutânea nos flancos de NOD /SCID e volume do tumor foi medido semanalmente durante 7 semanas. barra de erro representa SE.
células população Side contêm elevados Rac1-GTP e aumento das atividades de migração, invasão e colonização pulmonar
A teoria de células-tronco do câncer sugere que uma fração do câncer população de células é enriquecido para capacidades de iniciação do tumor, o que requer a segmentação preferencial para alcançar benefícios terapêuticos. população lateral é um dos marcadores de células estaminais que tem sido usado para isolar células estaminais cancro do pulmão [12]. Isolamos células SP por citometria de fluxo a partir de células A549 (Fig. 4A) e confirmada por RT-PCR que eles expressam aumentado ABCG2 transportador (Fig. S4A). Interessantemente, as células SP continha um aumento da actividade Rac1 (Fig. 4B) e mostraram aumento da migração em comparação com células não-SP ou células parentais (Fig. 4C). A inibição da actividade Rac1 usando um inibidor de molécula pequena Rac, NSC23766, resultou numa diminuição da migração e invasão de células de SP (Fig. S4B, S4C), sugerindo elevada Rac1-GTP nas células SP, contribui para estes comportamentos de células de tumor. Além disso, as células SP mostraram aumento da capacidade de colonização pulmonar
in vivo
em comparação aos não-SP ou células parentais (Fig. 4D). Curiosamente, apesar atividades distintas iniciar tumorais
in vivo
, células SP e não-SP proliferaram a uma taxa semelhante à das células parentais
in vitro
(Fig. S4D). No entanto, as células SP apresentou aumento da atividade a formação de colónias quando a crescer em agar suave em comparação com não-SP e células parentais (Fig. S4E). A actividade tumorigénica residual exibida pelas células não-SP não foi devido à impureza destas células, porque a análise de FACS paralelo encontrado mais de 99,9% de enriquecimento para células não-SP do corante Hoechst 33342 triagem (dados não mostrados). Por isso, é provável que uma plasticidade das células não-SP lhes permite dar origem a células do cancro, resultando na tumorigenicidade residual observada de iniciação.
(A) As células A549 foram coradas com corante Hoechst 33342 e analisados por citometria de fluxo para população lado (painel da esquerda). As células foram tratadas com 10? M para o controlo inibidor Fumitremorgen (painel da direita). Retratado é um representante de várias SP analisa. Os lisados (B) de células colhida a partir de células SP-SP e não ordenadas foram submetidos a GST-PAK puxar para baixo ensaio e processadas para análise por Western blot Rac1 para determinar a actividade Rac1. blot Rac1 total foi utilizado como um controlo. Retratado é um representante de três ensaios suspensos atividade Rac1 independentes. células (C) escolhidas A549 foram plaqueadas para o ensaio de migração trans-poço e as células migraram em direcção durante a noite a 10% de FBS foram coradas e contadas. Acima é um representante de três barras de experiências e de erro independentes representa SD. (D) 5 × 10
4 e células SP-SP não ordenadas foram injectados na veia da cauda de ratinhos NSG (n = 4 para cada condição). Os pulmões foram dissecados no final de 12 semanas. O painel direito mostra a quantificação dos dados de colonização pulmonar. barra de erro representa SE. Acima é um representativos de três experiências independentes
células SP também foram detectados em H441 células em um percentual menor do que as células A549 (Fig S4F;. 0,5-2% vs. 4-10%).. Semelhante a células A549 SP, células H441 SP apresentou aumento da colonização pulmonar em ratinhos imunocomprometidos em relação a células não-SP (Fig. S4G), e formou mais colónias em agar mole em comparação com não-SP e células parentais (Fig. S4H).
Estes resultados nos levam a concluir que as células SP da NSCLA representam uma subpopulação de células tumorais a granel que contêm elevados atividade Rac1, aumento da migração, invasão, as atividades de crescimento independente de ancoragem, e são enriquecidas para células que são capazes de colonização pulmonar. Eles também sugerem que as células não-SP poderia permanecer tumorigénicas, embora com actividade reduzida CSC, para dar origem a tumores.
Rac1 knockdown suprime adesão, migração e invasão de células tanto SP como não-SP
Para examinar o efeito do Rac1 knockdown em células SP, células A549 foram infectadas com lentivírus contendo os scr ou Rac1 shRNA, e células SP e não-SP foram isoladas por citometria de fluxo. A análise Western blot confirmou a eficácia de Rac1 knockdown em tanto SP como células não-SP (Fig. S5a). De acordo com os nossos dados anteriores sobre células parentais, Rac1 knockdown alterou a organização do citoesqueleto de ambos os SP e não-SP células (Fig. S5b), e reduziu complexos de adesão focal como visualizado por p-FAK imunocoloração das células tanto SP e não-SP (Fig. 5A). Consistentemente, a actividade de adesão de células tanto SP como não-SP à fibronectina também foi diminuída (Fig. 5B). Além disso, Rac1 knockdown diminuiu migração e invasão de tanto SP como células não-SP (Fig. 5C, 5D). Assim, Rac1 segmentação pode suprimir a migração e invasão de ambas as células cancerosas não-SP e.
As células seleccionadas (A) foram semeadas em lâminas revestidas com fibronectina, fixo e submetido a imunocoloração com anticorpo p-FAK. imagens de células foram coletadas em 40X de ampliação usando o microscópio fluorescente. Acima descrita são representativos de várias imagens recolhidas. (B, C, D) de células A549 foram classificados quer plaqueadas em fibronectina revestido placa de 96 poços para
In vitro
invasão ensaio de ades (B), em placas de poços para trans ensaio de migração (C) ou revestido com matrigel placas de ensaio de invasão (D). Todos os ensaios foram realizados em triplicado e as barras de erro representam DP. Descritos são representativos de três experiências independentes.
Rac1 segmentação diminui a proliferação e colonização pulmonar de ambas as células SP e não-SP
Para examinar se a inibição observada da proliferação do câncer global população de células por Rac1 knockdown é devido a um efeito específico sobre os CSCs, nós próxima testaram as propriedades de crescimento de células SP isoladas e não-SP antes e após a transdução de shRNA específica-Rac1. A proliferação de células SP e NSP
in vitro
apareceu semelhante em condições de cultura de tecidos, e Rac1 knockdown bloqueada
in vitro
proliferação de ambos SP e não-SP células à medida semelhante (Fig . 6A). rotulagem BrdU demonstrou que ambas as células SP-SP e não foram inibidas na transição da fase S com um aumento correspondente na fase G0 /G1 do ciclo de fase de células após Rac1 knockdown (Fig. 6B). Enquanto mexidos ARN não afectou o aumento da actividade de formação de colónias de células SP num ensaio de agar mole em comparação com células não-SP, nem no soro reduzida ou em condições de soro normal (Fig 6C;. Dados não mostrados), Rac1 shRNA foi capaz de reduzir significativamente a formação de colónias, tanto de células A549 não-SP e. Em camundongos injetados NSG-veia da cauda, a colonização do pulmão de células Rac1 shRNA SP foi drasticamente diminuída em comparação com células SCR e as correspondentes células não-SP mostrou nenhuma atividade de colonização tumor (Fig. 6D). Estes resultados proporcionam forte evidência de que Rac1 direccionamento é eficaz na inibição da proliferação e metástase de ambas as células SP e não-SP. Para testar se os efeitos Rac1 knockdown sobre a proliferação são aplicáveis a células-tronco cancerosas marcadas por CD133, um ensaio de incorporação de BrdU foi realizada no qual as células positivas para BrdU foram fechado em CD133
+ ou CD133
– população de ambos scr e Rac1 shRNA células tratadas. Observou-se uma diminuição na BrdU
+ células, tanto CD133
+ e CD133
– subpopulações sobre Rac1 knockdown (Fig. 6E). Assim, Rac1 é necessário para a proliferação da população CSC.
As células seleccionadas (A) foram plaqueadas em placas de ensaio e a proliferação de 96 poços foi realizada usando o reagente MTS. O ensaio foi realizado em triplicado e as barras de erro representam DP. Representada é uma representativos de três experiências independentes. (B) As células A549 foram classificados incubadas com BrdU e análise do ciclo celular foi realizada por coloração BrdU e análise flowcytometric. O ensaio foi realizado em triplicado e as barras de erro representam DP. Acima é um representativos de duas experiências independentes. (C) escolhidas de células foram directamente plaqueadas para o ensaio de formação de colónias em agar mole e o número de colónias formadas foram contadas depois de 2-3 semanas. O ensaio foi realizado em triplicado e as barras de erro representam DP.