Abstract

Cancro iniciar células (CICs) representam uma população única célula essencial para a manutenção e crescimento de tumores. A maioria

in vivo

estudos de CICs utilizar xenoenxertos de tumores humanos em ratinhos imunodeficientes. Estes modelos fornecem informação limitada sobre a interação de CICs com o sistema imune do hospedeiro e são de valor limitado na avaliação CICs terapias enfocadas, especialmente terapias de base imunológica. Para avaliar isso, é necessário um modelo de câncer singênica. Foi examinada a capacidade de formação de esfera de treze linhas celulares de cancro de pulmão de murino e identificado TC-1 e um subclone metastático de carcinoma de pulmão de Lewis (LLC-HM) na forma de linhas celulares que prontamente formados e mantidos esferas mais passagens múltiplas. TC-1 tumorspheres não foram enriquecidas para a expressão de CD133 ou CD44, marcadores CIC putativos, nem eles demonstram Hoechst 33342 lado coloração população ou a actividade Aldefluor comparação com células aderentes TC-1. No entanto, na cultura tumorsphere, estas células apresentaram auto-renovação a longo prazo e capacidade de divisão simétrica e expresso mais Oct-4 em comparação com as células aderentes. HM-LLC células derivadas da esfera apresentaram maior Oct-4, CD133 e expressão de CD44, demonstrou uma Hoechst população 33342 lado e atividade Aldefluor comparação com células aderentes ou uma baixa subclone metastático do LLC (LM-LLC). Em ratinhos singeneicos, HM-LLC células derivadas de esfera necessária menor quantidade de células para iniciar a tumorigénese em comparação com células aderentes ou LM-LLC. Da mesma forma TC-1 derivadas de células tumorigénicas esfera foram mais do que as células aderentes em ratinhos singénicos. Em contraste, em ratinhos imunocomprometidos, menos do que 500 células aderentes ou esfera TC-1 e menos do que 1,000 esfera ou células LLC aderentes foram necessários para iniciar um tumor. Sugerimos que nenhum marcador fenotípico pode identificar CICs em linhas celulares de cancro murino pulmonares. Tumorsphere cultura pode proporcionar uma abordagem alternativa para identificar e enriquecer para os AIC de pulmão de murino. Além disso, propomos que a avaliação tumorigenicidade de CICs pulmão murino em ratinhos singeneicos melhores modelos da interação de CICs com o sistema imune do hospedeiro

Citation:. Morrison BJ, Aço JC, Morris JC (2012) Sphere cultura de Murino Lung linhas celulares de cancro são enriquecidos com câncer Iniciando Cells. PLoS ONE 7 (11): e49752. doi: 10.1371 /journal.pone.0049752

editor: Giuseppe Viglietto, Universidade Magna Grécia, Itália |

Recebido: 12 Julho, 2012; Aceito: 15 de outubro de 2012; Publicação: 13 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Morrison et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Hematologia-Oncologia da Universidade de Cincinnati. BJM foi apoiada por uma Universidade de Cincinnati, Conselho de Pesquisa da Universidade, bolsa de Pós-Doutorado Programa Research Fellow. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a causa de quase 20% de todas as mortes por câncer nos Estados Unidos [1]. É responsável por mais mortes do que os próximos quatro cancros mais comuns combinadas. Apesar das melhorias no diagnóstico e tratamento, a sobrevida global em 5 anos para todos os pacientes com câncer de pulmão é um lúgubre 15%, e isso diminui para menos de 2% em pacientes com doença metastática [2]. Assim, o cancro do pulmão é um grande problema de saúde pública, e uma melhor compreensão da biologia da doença e melhorias no tratamento são bastante necessárias.

A evidência crescente apoia o conceito de uma população especializada de células dentro de tumores de câncer denominado células iniciar (CICs), alternativamente, “células-tronco cancerosas” ou células iniciadoras de tumores. Estas células são pensados ​​para ser responsável pela origem do tumor, a manutenção, a progressão, e resistência à terapia. CIC apresentar características funcionais das células estaminais, tais como a capacidade de auto-renovação e a capacidade para dar origem a progenia diferenciada. CIC putativos foram identificados na leucemia mielóide [3], e tumores do cérebro [5], [6] e da mama [7]. Mais recentemente, os AIC pulmonares foram isolados a partir de linhas de células humanas e amostras de pacientes [8] – [15]. Investigando pulmão CICs pode aumentar a compreensão da origem do cancro do pulmão e pode levar a novas abordagens terapêuticas dirigidas a estas células.

CICs foram mostrados para formar esferas tridimensionais multicelulares

in vitro

quando cultivada em condições isentas de soro não aderentes [6], [16]. Sob estas condições, a maioria das células de tumor submetidos a anoikis, uma forma de morte celular programada, ao passo que os CICs raras se dividem para gerar esferóides tumorais. O ensaio de esfera e uma interpretação matemática recentemente proposto permitir a avaliação da taxa de expansão divisão simétrica de células semelhantes a células estaminais maligna, e a avaliação dos efeitos do tratamento sobre a auto-renovação e actividade proliferativa destas células [17]. Este ensaio é uma ferramenta poderosa para avaliar as propriedades funcionais e fenotípicas associadas com AIC. Em um estudo utilizando amostras de cancro do pulmão do paciente, formação de esfera foi encontrada em sete dos 19 tumores analisados ​​[10]. Estas células foram encontrados para ter

in vitro

e

in vivo

propriedades de CICs incluindo a auto-renovação, capacidade proliferativa e diferenciação, expressão de CD133, de enriquecimento para a população lado células (SP), expressão das embrionárias genes “stemness” Out-4 e NANOG, resistência à quimioterapia, e de tumorigenicidade. cultura Sphere foi usado para enriquecer populações câncer de pulmão CIC [8], [9], [13], [14].

Fotomicrografias (10x) de passagem 2 dias 7 esfera culturas de (A) TC esferas -1, (B) HM-LLC esferas e (C) LM LLC-cultura esfera midiática. Barra = 100 um. (D) a expansão total dobra e frequência divisão simétrica (E) ao longo de oito passagens para TC-1 esferas (vermelho) e HM-LLC esferas (preto), e duas passagens para LM-LLC esfera meios de cultura (cinza) mostra diferenças significativas; * P 0,001. (F-G) Dobre expansão ao longo de sete passagens para TC-1 esferas (vermelho) e HM-LLC esferas (preto). (H) Passagem 2 esferas foram cultivados e contados para o número total de células nos dias imediata. Prova repetida duas vezes, resultados representativos mostrado. No dia 1, o número total de células em cultura é reduzida. As células cancerosas iniciar mitogen-responsive sobreviventes são responsáveis ​​pela proliferação celular e gerando esferas multi-celulares frescos que podem ser colhidas no dia 7. Bares: ± erro padrão da média (SEM)

câncer de pulmão murino não foi bem caracterizada pela presença e frequência de CICs. A maioria dos estudos de CICs pulmonares usaram linhas de células humanas ou amostras de tumor primário, com tumorigenicidade examinadas apenas em modelos imunocomprometidos do mouse. Importante, as interacções entre o sistema imunitário e o microambiente do tumor ter sido demonstrado desempenhar um papel na resposta à terapia. Na verdade, o câncer de pulmão e muitos outros tumores que ocorrem na comportam hospedeiro imunocomprometido de forma mais agressiva, respondem mal ao tratamento, e ter resultados mais pobres [18], [19]. Portanto, para modelar com mais precisão as interacções imunes envolvidos no estabelecimento de tumores por CICs, nós investigamos células de tumor de pulmão de murino enriquecido para CIC num animal imunocompetente singeneicos. O presente estudo relata a identificação e caracterização de CICs pulmão murino utilizando métodos esfera da cultura e da avaliação comparativa destas células em singênica e modelos imunocomprometidos do mouse.

Materiais e Métodos

Células

de murino parental células de carcinoma de pulmão de Lewis (LLC) TC-1 e foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA). A alta metastático (HM-LLC) e baixa metastático (LM-LLC) subclones de LLC [20], [21] eram dons do Dr. Zhongyun Dong (Universidade de Cincinnati, Cincinnati, OH), e foram cultivadas como células aderentes em meios de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 1% de penicilina G-estreptomicina (Invitrogen). As linhas celulares 18948, 18955 Aderente, 18955-flutuante (um clone não aderente de 18955 células), e 18959 células são

novo

câncer de murino de pulmão de pequenas células (CPPC) linhas de células e foram um presente do Dr. . Kathryn Wikenheiser-Brokamp (Centro infantil de Cincinnati Medical, Cincinnati, OH). Estas linhas celulares foram estudados em A Universidade de aprovação da Comissão de Cuidados e Uso de Animais Institucional Cincinnati (Protocolo nº 11-03-21-01). Murino pulmonares linhas de células de tumor e MLE12 MLE15 [22], derivadas de ratinhos transgénicos que albergam o vírus símio 40 (SV40), o antigénio tumoral grande sob o controlo transcricional do surfactante de proteína C humana (SP-C) promotor, foram presentes da Dr. Jeffrey Whitsett (Centro Médico infantil de Cincinnati). linhas de células SCLC e células MLE12 MLE15 e foram cultivadas em meios HITES [23]. linhas celulares de cancro de pulmão de adenocarcinoma murino 393P, 344P e 344SQ [24] derivado de Kras

La1 /+ p53

camundongos R172HΔG foram um presente de Jonathan M. Kurie (The University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston , TX) e foram cultivadas em DMEM com 10% de FCS.

Animais e Ética Declaração

camundongos C57BL /6 foram obtidos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) e NOD-SCIDγ (NSG , NOD.Cg-

Prkdc

scid IL2RG

tm1Wjl

/SZJ) ratos de uma colônia de reprodução criada no Centro Médico infantil de Cincinnati. A Universidade de Cincinnati Institutional Animal Care e do Comitê Use concedida a aprovação para este trabalho (Protocolo No. 11-03-21-01). Todos os procedimentos estavam em conformidade com as orientações bem-estar animal institucional, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

em tempo real quantificação PCR foi feito para Oct-4, um gene associado com células-tronco auto-renovação, a expressão do mRNA. TC-1 esferas (A) e HM-esferas LLC (B) mostram um aumento Oct-4 expressão em comparação com as células aderentes combinados; * P≤0.001. células HM-LLC expressa significativamente mais Oct-4 do que as células aderentes LM-LLC; ** P = 0,005. Parcelas representar dados de 2-4 repetições biológicas, cada um com três repetições técnicas combinadas. células TC-1 (vermelho); LM-LLC aderente (cinza); células HM-LLC (preto). Bares:. ± SEM

(A-B) parcelas representativas que apresentam coloração Aldefluor (azul) e coloração de controle DEAB (vermelho) para a HM-LLC, LM-LLC e-1 TC células aderentes em comparação com passagem 2, dias 1 e 7 células derivadas da esfera. Aldefluor células alta que expressam (caixa retangular) são significativamente maiores em frequência (C) e (D) uma intensidade média de fluorescência (IMF) de Aldefluor dentro HM-LLC esferas comparado com LM-LLC ou HM-LLC células aderentes, e HM-LLC aderente células expressam mais do que Aldefluor células aderentes LM-LLC; frequência (C) * p≤0.001; MFI (D) * P≤0.002. Em comparação com a coloração DEAB, Aldefluor positividade (a caixa não rectangular) foi encontrado para ser significativamente maior no TC-1 células aderentes em comparação com esferas (E); * P≤0.004. MFI de Aldefluor dentro dos grupos TC-1 (F) não foi encontrado para ser significativamente diferente. No elevada população Aldefluor foi anotado para TC-1 esferas ou células aderentes. Parcelas representam combinados dados de duas repetições biológicas com três repetições técnicas cada. Bares:. ± SEM

parcelas SP representativos para células LLC (A) e (B) células TC-1 que compararam células aderentes combinados à passagem 2, dias 1 e 7 células derivadas da esfera. Hoechst 33342 coloração foi confirmado com bloqueio verapamil. (C) frequência SP foi significativamente aumentada no HM-LLC esferas em comparação com células aderentes; * P 0,001; ** P≤0.012. células aderentes HM-LLC e LM-LLC não foram significativamente diferentes para frequência SP. (D) SP não foi encontrado para ser regulada positivamente em células TC-1 derivadas de esfera em comparação com células aderentes combinados. Dia 1 células derivadas de esfera tinha uma frequência significativamente mais baixa de células SP comparação com as células aderentes e 7 dias as células derivadas da esfera; * P = 0,03. Parcelas representar dados de três repetições biológicas com três repetições técnicas cada combinados. Bares:. ± SEM

(A) fluxo Representante citometria de parcelas para CD133 (eixo Y) e CD44 (eixo X) co-coloração. (B e D) A intensidade de fluorescência média (IFM) de CD44 é mostrado corrigido para a intensidade de coloração do isotipo de LLC e as células CT-1. (B) HM-LLC esferas e as células aderentes, bem como células LLC (ATCC) expressam maiores quantidades de CD44 em comparação com células LM-LLC. células derivadas de esfera foram encontrados a ter um MFI inferior para CD44 em comparação com células aderentes HM-LLC. D7 células derivadas de esfera tinha um MFI inferior para CD44 em comparação com células D1; * P 0,001. (D) Dia 1 TC-1 células derivadas da esfera expressar menos CD44 do que o dia 7 ou células aderentes; * P≤0.002. (C) CD133 frequência de células positivas é maior em HM-LLC esferas comparado com as células aderentes LM-LLC; * P≤0.043. expressão CD133 não foi significativamente diferente entre as células aderentes HM-LLC e esferas ou entre os três células aderentes LLC diferentes. (E) Não houve diferença significativa na expressão CD133 entre as condições de cultura TC-1. Experiência feita em triplicado, resultados representativos mostrado. Barras:. ± SEM

Confiança trama intervalo de análise de diluição limitante é mostrado com o eixo y são visualizadas a frequência estimada de células cancerosas iniciador (CIC). (A) uma diluição limitante das células TC-1 (120000, 80000, 40000, 10000, 5000, e 1000) foram injectados subcutaneamente em ratinhos C57BL /6 singeneicos ratinhos (n = 4-8). células derivadas esfera foram encontrados para ser mais tumorigénico do que as células aderentes; * P≤0.001; ** P 0,02. Dia 1 células derivadas da esfera eram mais tumorigénico do que o dia 7; *** P = 0,04. Uma diluição limitante (10000, 1000, e 500 células) (n = 6 a 8) dos mesmos três grupos foram injectados em ratinhos NSG e frequência CIC foi encontrado para ser inferior a 1/500 para todos os grupos. (B) Análise de LLC limitando experimento tumor singeneico para diluição (80,000, 40,000, 20,000, e 10.000 células) e os ratinhos imunocomprometidos (NSG) (80.000, 40.000, 10.000 e 1.000 células) (n = 4-9). Não houve diferença significativa observada; No entanto, as células derivadas da esfera tenderam no sentido de ser mais do que HM tumorigénicas ou LM células aderentes em ratinhos C57BL /6. eram necessárias menor número de células implantadas para iniciar tumores em animais imunocomprometidos que em animais singeneicos com a frequência CIC estimado seguinte 1/1000 para todos os grupos LLC.

Tumorsphere Assays

As células foram cultivadas como tumorspheres em DMEM /F12 (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) contendo 20 ng /mL rhEGF (R D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng /mL rhbFGF (R D Systems), 4 ug /ml de sulfato de heparina (Sigma, St. Louis, MO), 0,15% de albumina de soro de bovino (Sigma), e 1% de penicilina-estreptomicina G [25]. Esfera capacidade de formar (SFC) foi determinada pela capacidade para formar esferóides tridimensionais em cultura ao longo de um período de cinco a nove dias. Para avaliar a proliferação a longo prazo e dobrar expansão (FE), as esferas foram dissociado e passadas a cada 7 dias, utilizando 0,05% de tripsina-EDTA (Invitrogen). As células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2. Esfera culturas foram cultivadas em frascos de baixo-aderente (Nunc, Penfield, NY). As células foram contadas utilizando um contador de células automatizado condessa ™ (Invitrogen). Fold expansão e por Divisão de Frequência simétrica [17] foram avaliados para cada linha de células, bem como a capacidade para as células de cultura como esferóides durante mais de três passagens.

A coloração da superfície celular e Aldefluor Ensaio

Para a análise de marcadores de superfície, ficoeritrina (PE) anti-ratinho marcado com CD133 (clone 13A4, eBioscience, Inc. San Diego, CA) foi utilizado a uma diluição de 1:33 e isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com anti-humano /ratinho CD44 (clone IM7, eBioscience) foi utilizado a uma diluição 1:100. de rato marcado com FITC IgG2bκ foi utilizado como um controlo de isotipo (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Um kit de ensaio de Aldefluor foi utilizado para detectar a enzima aldeído desidrogenase 1 (ALDH1; StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC). Resumidamente, as células foram incubadas durante 60 minutos a 37 ° C na presença de reagente de Aldefluor, sozinho ou com a adição de um dietilaminobenzaldeído (DEAB) solução molecular contendo blocos de actividade que ALDH1. Os dados foram coletados por meio de um fluxo Epics XL-MCL citômetro (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). As células não viáveis ​​foram excluídos da análise usando coloração com iodeto de propídio (Sigma). Atividade foi avaliada usando amostras de controlo correspondentes deab. Os dados foram analisados ​​usando o software FlowJo (Árvore Star, Inc., Ashland, OR).

Hoechst 33342 População lado (SP)

Hoechst análise de coloração SP 33342 corante foi realizada utilizando métodos adaptados de Goodell et ai. [26]. Resumidamente, um milhão de células foram incubadas com 10 ug /ml de Hoechst 33342 (Sigma) durante 90 minutos a 37 ° C. Confirmação de células SP foi realizado utilizando 50 pM de verapamil (Sigma) para bloquear o efluxo de corante. Os dados foram coletados usando um LSRII citômetro de fluxo (BD Biosciences). As células não viáveis ​​foram excluídos da análise.

em tempo real Transcrição Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)

O ARN total foi extraído utilizando PureLink ™ RNA mini-kit (Invitrogen). O ARN foi transcrito de forma inversa em 20 ul usando o kit de cDNA Verso (Thermo Fisher Scientific, Surrey, Reino Unido) e o Sistema de PCR GeneAmp 9700 termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA). Análise de expressão Oct-4 foi efectuada utilizando Plexor® Sistema de qPCR (Promega, Madison, WI) reagentes e pares de iniciadores StemElite ™ Mus-Pou5f1 /ACTB (Promega) contendo iniciadores para ambos Oct-4 e o gene β-actina. Os dados foram coletados utilizando o RT-Sistema Bio-Rad CFX96 ™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) e analisados ​​utilizando software de análise Plexor®. Todos os resultados em tempo real RT-PCR foram compilados utilizando três a seis repetições técnicos para cada repetição biológica e de duas a quatro repetições biológicas foram feitas para cada amostra – combinado células aderentes e passagem 2 (P2) dia 1 (D1) e no dia 7 ( D7) células derivadas de esfera. Os dados foram normalizados para endógena β-actina para cada amostra. As amostras foram padronizadas para a utilização de células aderentes TC-1 ou HM-LLC para comparar os níveis de expressão entre as amostras.

In vivo Tumor Initiation

A diluição limitante do TC-1 (120.000, 80.000, 40.000 , 10000, 5000, ou 1000) de células derivadas de D1 esfera aderente e P2 correspondente ou D7 culturas foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos C57BL /6 (n = 4-8). Outra diluição limitante das células (10000, 1000, e 500 células) para os mesmos três condições também foram injectadas em ratinhos NSG (n = 6 a 8). Do mesmo modo, para as células LLC foi conduzida uma experiência de diluição limitante de 80.000, 40.000, 20.000, 10.000 ou células de ratinhos C57BL /6 e 80.000, 40.000, 10.000, ou 1.000 células para ratinhos NSG (n = 4-9). Os ratinhos foram monitorizados duas vezes por semana para a formação de tempo-de-tumoral. sobrevida livre de tumor até ao dia 65 foi avaliada.

Análise Estatística

SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc., Chicago, IL) foi utilizado para a análise estatística. Student

t

-test foi utilizado para comparar os grupos. Para

in vivo

formação de tumores, a análise de diluição limitante estimar diferenças de células-tronco /câncer que iniciam frequência de células entre as amostras foi realizada utilizando Limitando software extrema Análise de diluição (ELDA) como descrito anteriormente [27]. O nível de significância estatística foi fixado em 0,05.

Resultados

Sphere Formando Capacidade

SFC foi examinada em 13 linhas de células de câncer de pulmão de murino ou subclones de linhas celulares derivadas de várias fundos genéticos de murino (Tabela 1). SFC foi anotado para nove dessas linhas celulares. No entanto, SFC nem sempre se correlacionam com a capacidade de cultura como esferas mais passagens em série. Dos nove linhas de células que formavam esferas e foram testados para a capacidade de cultura a longo prazo, apenas dois, TC-1 e HM-LLC demonstrou crescimento sustentado ao longo passagens em série. células TC-1 e HM-LLC foram capazes de formar esferóides tridimensionais em cultura (Figuras 1A e 1B). células LM-LLC (Figura 1C) e células LLC parentais não formam esferas e eram incapazes de passagem prolongada na cultura esfera. TC-1 e HM-esferas LLC exibiu um potencial FE 1 ao longo de várias passagens (Figura 1D). culturas esfera de TC-1 e HM-LLC exibiram uma frequência de células-tronco do câncer positiva /CIC simétrica divisão, enquanto que as células LM-LLC não (Figura 1E). Isto indica que as condições de cultura esfera media pode identificar CICs putativos para estas duas linhas celulares. FE foi relativamente estável ao longo do número de passagens para o TC-1 (Figura 1F) e esferas HM-LLC (Figura 1G). Dentro de 24 horas de passagem de aproximadamente 30% (HM-LLC) ou 54% (TC-1) células sofrem anoikis /morte celular (Figura 1H). As células mitogen-responsive restantes em D1 passou a formar esferas de D7. Colocámos a hipótese de que as células foram enriquecidas para D1 AIC em comparação com células D7, como as células D7 foram mais propensos a ser composta por cerca de CIC e um maior número de células tumorais diferenciadas.

Oct-4 Expressão de ARNm é reforçada na área células -derived

a expressão de Oct-4, um gene envolvido em células estaminais auto-renovação e de um regulador chave da pluripotência que podem sozinhos reprogramar células para pluripotência [28], foi avaliada em correspondência aderente e passagem 2, D1 e D7 células esfera para TC-1 e HM-LLC, e as células LM-LLC aderentes. Os dados foram normalizados para a expressão de β-actina e padronizado para níveis de ambos TC-1 (Figura 2A) ou HM-LLC células aderentes (Figura 2B) de expressão. células derivadas da esfera expressas significativamente maior mRNA Oct-4 do que as células aderentes alinhados; P≤0.001. TC-1 esfera células cultivadas a partir de qualquer D1 ou D7 expressa aproximadamente 6 vezes mais Oct-4 em comparação com as células aderentes. HM-LLC esferas de ambos D1 ou D7 expressa mais de 1,7 vezes mais Oct-4 do que as células aderentes. LM-LLC células aderentes expressavam Oct-4, aproximadamente 60% os níveis de células aderentes HM-LLC. Expressão de SOX2 e NANOG que são associados com a auto-renovação e stemness, não foram encontrados como sendo significativamente diferente expressos entre as esferas e as células aderentes (dados não mostrados).

Aldefluor A actividade é melhorada em HM-LLC mas não no TC-1 Esferas

expressão ALDH1 ea atividade tem sido correlacionada com a atividade CIC eo aumento da agressividade dos tumores de pulmão [12]. Nós examinamos a atividade ALDH1 em culturas aderentes e esfera combinados. lotes representativos são mostrados para HM-aderente LLC e LM-LLC em comparação com P2, D1 e células cultivadas esfera D7 (Figura 3A) e para células aderentes TC-1 em comparação com P2, D1 e células cultivadas esfera D7 (Figura 3B). Para LLC HM-esferas, um subconjunto de células que expressam Aldefluor elevados foram encontrados para ser significativamente aumentada em células cultivadas esfera em comparação com HM-LLC ou LM-LLC células aderentes (Figura 3A); P≤0.001 para frequência e P≤0.002 de intensidade de fluorescência média (IFM) (Figura 3C e 3D). TC-1 e as células aderentes derivadas de esfera expressou níveis baixos de actividade Aldefluor (Figura 3B). Aderente TC-1 demonstrou células mais células Aldefluor-positivos em comparação com as células derivadas de esfera (Figura 3E); P≤0.004. Estes níveis não foram significativamente diferentes quando analisados ​​para MFI (Figura 3F).

SP é reforçada no HM-LLC, mas não no TC-1 Esferas

Foram examinados combinado células aderentes, e P2, culturas D1 e D7 esfera com Hoechst 33342 para SP. Como um controlo, o verapamil foi utilizado para destruir a actividade do transportador de Hoechst 33342. SP foi definida como a população de células diminuída na presença de verapamil. Exemplos de perfis de células LLC (Figura 4A) e as células CT-1 (Figura 4B) são mostrados. frequência SP foi encontrada para ser aumentada dentro de esferas de HM-LLC em comparação com células aderentes de qualquer HM-LLC ou LM-LLC; P≤0.012 para esferas D1 e P 0,001 para esferas D7 (Figura 4C). A fração média de células SP por três repetições biológicas para HM-LLC P2, esferas D1 foi de 1 ± 0,5%, para P2, esferas D7 2 ± 0,7%, para HM-LLC células aderentes 0,4 ± 0,4% e para LM-LLC aderente células de 0,4 ± 0,3%. TC-1 aderentes e esfera-culturas expressa baixas frequências de células SP. frequência SP não foi encontrado para ser melhorado para esfera cultivadas em comparação com aderente TC-1 (Figura 4D). Dia 1 células derivadas de esfera foram encontrados para ter uma diminuição na frequência de células SP comparação com as células aderentes ou células derivadas de esfera D7; P = 0,03.

CD133 expressão está aumentada em HM-LLC Esferas e CD44 expressão é reforçada no HM-Cells LLC comparação com LM-Cells LLC

Além de avaliar as características funcionais de CICs tal como actividade ALDH1 e corante Hoechst 33342 efluxo, que também procurou caracterizar as células CT-1 e LLC para a expressão de CD44 e CD133, putativos marcadores de superfície celular CIC. lotes representativos para CD44 e CD133 são mostrados (Figura 5A). Entre as células CT-1 e LLC, todas as células expressaram CD44. a expressão de CD44 para HM-LLC esferas comparado com as células aderentes HM-LLC demonstraram uma diminuição na expressão de esferas geral (Figuras 5A e 5B). a expressão de CD44 foi variável entre as linhas de células e condições de cultura LLC (Figuras 5A e 5B). linhas de células aderentes exibida uma expressão mais homogénea de CD44, enquanto que as células esfera-cultivadas exibiu uma expressão mais heterogêneo com algumas células que expressam diminuição da quantidade de CD44, enquanto a maioria permaneceu CD44 brilhante. expressão de CD44 MFI foi encontrada para diminuir entre as células D1 e D7; P 0,001 (Figura 5B). células LM em LLC apresentada a coloração intensa menos para CD44 em comparação com todos os outros tipos de células e condições de cultura LLC; P 0,001 (Figura 5A). Nenhuma diferença foi detectada para a expressão de CD133 entre células aderentes HM-LLC e P2, células esfera cultura D1 e D7; no entanto, houve um aumento significativo na frequência de CD133 de positividade entre HM-LLC esferas, tanto D1 e D7 células de cultura em comparação com as células LM-LLC (Figura 5C).

a expressão de CD44 foi diminuída em P2, D1 células derivadas de esfera para as células CT-1, em comparação com as células aderentes e P2, células D7 (Figura 5D). Não houve diferença na expressão de CD44 foi observada para P2, D7 TC-1 em comparação com células aderentes células TC-1. Não foram observadas diferenças significativas na expressão de CD133 entre as condições de cultura TC-1 celular (Figura 5E).

Células Sphere derivados apresentam uma maior tumorigenicidade em camundongos Singênico comparação com células aderentes

Foram avaliadas a tumorigenicidade de D1 e D7 esferas em comparação com as células aderentes. Também examinou a tumorigenicidade destas células em ratinhos singénicos imunocompetentes em comparação com camundongos NSG imunocomprometidos, a fim de atender melhor o modelo CIC nestes dois ambientes diferentes de rato [29]. Utilizando uma análise de diluição limitante, a CT-1 foram encontrados esferas para ser significativamente mais tumorigénico em ratinhos singeneicos, em comparação com 1 de CT-células aderentes; P≤0.001 para P2, células D1 e P = 0,0158 para P2, D7 células (Figura 6A). D1 TC-1 foram mais esferas esferas tumorigénico de D7; P = 0,04. TC-1 P2, esferas D1 foram estimados para ter uma frequência CIC de 1 célula por 9.533 células. P2, esferas D7 foram o próximo mais tumorigénica com uma frequência estimada CIC de 1 célula por 21,918 células, e as células aderentes foram encontrados para ser o menos tumorigénica com uma frequência estimada de 1 célula por 62,129 células. Para as células LLC implantadas em ratinhos singeneicos, houve uma tendência para menor frequência CIC entre esferas (células D1, 1 por 29.694 células e células D7 1 por 35.949 células) comparar com células aderentes (HM-LLC 1 por 46.989 células e LM-LLC 1 por 49.686 células), mas esta tendência não atingiu significância (Figura 6B). Em ratinhos NSG todas as diluições de cada linha de células e condições de cultura testados foi capaz de formar tumores em 100% dos ratinhos. Quando testada, a menos de 500 células para TC-1 e menos de 1000 células para células LLC foram suficientes para estabelecer tumores em ratinhos NSG (Figura 6A e 6B).

Discussão

A maioria dos estudos de CICs ter usado material derivado de paciente ou linhas de células tumorais humanas estabelecidas inoculados em ratinhos imunocomprometidos. Embora esses estudos de xenoenxerto de permitir a identificação de uma sub-população de células capazes de recapitular um tumor em um rato imunocomprometidos, eles podem não apresentar uma imagem precisa das características dos verdadeiros CICs. A fim de formar um tumor num ser humano, potenciais AIC deve interagir com o sistema imunológico para evitar o reconhecimento do tumor e eliminação. Como evidência para isso, nós mostramos que camundongos imunocompetentes singénicos requerem significativamente mais células para iniciar um tumor do que os ratos imunocomprometidos. A partir desta, pode ser postulado que há uma grande população de células capazes de crescer tumores em ratinhos imunocomprometidos que não podem iniciar tumores nos seus homólogos singénicos, e que as verdadeiras CIC podem representar uma população muito mais raro do que o determinado em modelos xenograph.

a aplicação da cultura esfera para detectar CIC putativos foi usado para vários tumores [10], [16], [17], [30]. Para nosso conhecimento, esta é a primeira vez que um painel de linhas celulares de cancro de pulmão de murino foi sistematicamente examinada por esfera e a capacidade de enriquecimento de CIC (Tabela 1) formando. Em particular, TC-1 e HM-LLC esferas eram capazes de crescimento sustentado na cultura. Na passagem, um número substancial de células morrem nas primeiras 24 horas. Isto indica que no interior de culturas esfera existe uma sub-população de células capazes de auto-renovação e proliferação, CICs putativos. No entanto, nem todas as linhas de células eram capazes de crescimento sustentado como esferas. Sete das nove linhas de células que formaram esferas e foram testadas para a capacidade de cultura a longo prazo tinham uma EF abaixo ou dentro de um desvio padrão de 1 (Tabela 1). A FE abaixo de 1 indica que outras células com uma capacidade de proliferação limitada além verdadeiros CICs pode formar esferas, ou que os verdadeiros CICs pode assimetricamente dividir ao longo do tempo em células diferenciadas não capazes de cultura em condições esfera. Assim, a formação de esfera, durante uma ou duas passagens não é tão útil para a identificação de CICs como é prolongada cultura esfera ao longo de várias passagens e a aplicação de um modelo matemático para avaliar CIC frequência divisão simétrica [17].

Em contraste com LLC parental e células LM em LLC, células LLC-HM são capazes de formar esferas que podem ser várias passagens maior do que oito vezes, e exibiu uma expansão dobra robusta e por divisão de frequência simétrica. Além disso, a formação de esfera foi anotado para os metastáticos linhas de adenocarcinoma murino pulmonares 344P e 344SQ, mas não para a linha de células 393P não metastático. Estes três linhas de células foram previamente relatado para formar esferas tridimensionais de cultura em Matrigel e as linhas de metástases propensas têm sido caracterizados como capaz de sofrer uma transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) [24]. Tem sido sugerido que pode haver uma ligação directa entre o EMT de células e a aquisição de uma haste celular como fenótipo /CIC [31]. Os nossos resultados sugerem que as células metastáticas têm uma capacidade enriquecido à cultura como esferóides não-aderentes, e que as células metastáticas são enriquecidos para CIC. Futuros estudos são necessários para resolver esta questão.

Nós demonstramos que a frequência dos CICs muda ao longo de uma passagem para tumorspheres câncer de pulmão de murino.