Abstract

O câncer de pulmão é causada por combinações de diversas mutações genéticas. Aqui, para compreender a importância dos receptores nucleares (NRs) na patogénese do cancro do pulmão associado-oncogene, nós investigamos o perfil do conjunto 48 NR membros expressão por meio de análise de QPCR em um painel de células epiteliais brônquicas humanas (HBECs), que incluiu pré-cancerosa e HBECs tumorigênicos abrigar oncogênicos

K ras-

V12

e /ou

alterações p53

. A análise do perfil revelou que alterações oncogénicas acompanhada alterações na expressão da transcrição de 19 NRs em HBECs pré-cancerosas e 15 NRs de acordo com a progressão maligna de HBECs. Entre estes, peroxissoma do receptor gama activado por proliferador (PPAR), um NR escolhido como um estudo de prova de princípio, mostraram a expressão aumentada em HBECs pré-cancerosas, que foi surpreendentemente revertida quando estes HBECs adquirida completo

In vivo

tumorigenicidade . Notavelmente, a activação de PPARy por tratamento tiazolidinodiona (TZD) reverteu a expressão aumentada de ciclooxigenase pró-inflamatória 2 (COX2) em HBECs pré-cancerosas. Em HBECs totalmente tumorigénicas com expressão indutível de PPARy, tratamentos TZD inibiu o crescimento do tumor de células, clonogenecity, e a migração de células de um modo dependente de PPARy-sumoilação. Mecanisticamente, a sumoilação de liganded-PPARy diminuição da expressão de COX2 e o aumento da expressão da desidrogenase de 15-hydroxyprostaglandin. Isto sugere que sumoilação mediada pelo ligando de PPAR desempenha um papel importante na patogénese do cancro do pulmão através da modulação do metabolismo de prostaglandinas

citação:. Kim J., Sato H, Choi JW, Kim HW, Yeh BI, Larsen JE, et ai . (2015) a expressão do receptor nuclear e função em Câncer de Pulmão Humano Patogênese. PLoS ONE 10 (8): e0134842. doi: 10.1371 /journal.pone.0134842

editor: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Coréia, República da

Recebido: 04 de fevereiro de 2015; Aceito: 15 de julho de 2015; Publicação: 05 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. a Fundação de Pesquisa Nacional da Coreia financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (NRF-2013R1A1A1A05005075 para YJ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o receptor nuclear compreende 48 membros da superfamília de factores de transcrição que são principalmente ligando-activados e desempenham um papel crucial em diversos processos fisiológicos, incluindo o metabolismo, desenvolvimento e diferenciação no corpo. Desregulação das vias NR provoca doenças crónicas graves, como diabetes [1-3], aterosclerose [4, 5], e vários tipos de câncer [6-8]. A expressão de toda a superfamília de NR foi investigada em várias condições fisiológicas e patológicas, incluindo modelos celulares de diferenciação [9-12], sistemas de rato anatómicas [1], do painel NCI60 de linhas celulares de cancro humano, [6], e linhas celulares de cancro do pulmão humano e amostras de pacientes [7, 8]. Estes estudos revelaram que os subconjuntos de NRs não são apenas associados com a fisiologia do tecido especificado, mas também são relevantes para a diferenciação funcional em linhagens celulares específicas [13, 14]. Além disso, a assinatura genética da superfamília de NR ou de membros NR individuais é um biomarcador de prognóstico para o câncer de pulmão, e alguns NRs são alvos druggable que podem ser farmacologicamente desenvolvidos em tratamentos de câncer potenciais [6-8, 15-19]. Na verdade, várias linhas de evidência indicam que NRs individuais estão associados com o aparecimento e desenvolvimento, bem como o tratamento ou quimioprevenção de cancro. Por exemplo, alfa superexpressão do receptor alfa do ácido retinóico (RARa) devido à sua fusão com PML (RARa /PML) e estrogênio receptor (ERa) expressão causa aparecimento de leucemia e progressão do câncer de mama, respectivamente [20-22]. Segmentação ERa utilizando o modulador do receptor de estrogénio selectivo (SERM), tamoxifeno ou raloxifeno e o bloqueio ou a ablação de di-hidrotestosterona (DHT), que é o mais forte ligando endógeno para o receptor de androgénio (AR), são bem conhecidos regimes terapêuticos no cancro clínicas para o tratamento do cancros correspondentes [19, 23-25]. Enquanto SERMs têm sido amplamente utilizados para o tratamento de cancro da mama ou mesmo clinicamente avaliados como agentes quimiopreventivos contra a incidência de cancro da mama, um elevado risco de cancro uterino e incidência endométrio tem sido relatada anteriormente [26, 27]. Da mesma forma, embora as TZDs drogas anti-diabéticos estão em ensaios clínicos para o tratamento do cancro do pulmão, função molecular de o PPAR TZD-activado não foi claramente definido ainda como um fator anti-tumorigénico em câncer de pulmão, ou mesmo argumentar como um indutor de tumores fator em outros tipos de cânceres, ou seja, câncer de mama e câncer de próstata [28-30].

Nós desenvolvemos um modelo pré-clínico envolvendo células humanas normais imortalizadas brônquicas epiteliais (HBECs) que podem ser geneticamente manipuladas com as mudanças oncogênicos específicos para estudar patogênese do câncer pulmonar e do desenvolvimento de novas abordagens direcionados para o diagnóstico precoce, prevenção e tratamento de câncer de pulmão. Recentemente, temos sido capazes de desenvolver modelos totalmente progrediu e tumorigênicos com HBECs com base na manipulação da p53, KRAS e c-myc [31]. Esses modelos pré-cancerosas e totalmente tumorigênicos fornecer um sistema ideal para estudar o papel das NRs na patogénese do cancro do pulmão incluindo preneoplasia e formação de tumor.

Neste estudo, nós perfilado a expressão de mRNA de todos os 48 NRs neste HBEC oncogene- modelo induzida pulmão patogênese do câncer [32, 33]. Isto permitiu-nos identificar um papel fundamental de PPARy na patogénese do cancro do pulmão. Num estudo mecanicista de prova de princípio, verificou-se que PPARy sumoilação é importante para o efeito anti-tumorigénico de TZD na patogénese do cancro do pulmão. Este estudo fornece uma visão sobre uma modificação bioquímica de PPARy, que é útil para a compreensão da patogénese do cancro do pulmão e também indica a potência do presente sistema de pré-clínico para estudar o papel de NRs na patogénese do cancro do pulmão e estes resultados devem ser de valor translacional clínica.

Materiais e Métodos

cultura celular

Como relatado anteriormente, as células epiteliais brônquicas humanas normais foram imortalizadas por CDK4 e hTERT (HBEC-KT), seguido pela introdução mais estável de alterações oncogênicos incluindo K-ras

superexpressão v12, knockdown de p53, ou ambos [31-33]. Uma série de HBEC-KTs incluídos HBEC-KT, HBEC-KTZ, HBEC-KT + pSRZ + pLenti-

K-ras

v12

(HBEC-KTR

L ), HBEC KT + pSRZ-

p53

shRNA + pLenti-

LacZ

(HBEC-KT53) e HBEC KT + pSRZ-

p53

shRNA + pLenti-

K-ras

v12

(HBEC-KTR

L53), onde pSRZ e Plenti representam vetores shRNA e lentivirais estáveis, respectivamente [31]. HBECs imortalizadas e clones HBEC tumorigénicas (C1 e C5) foram cultivadas em K-SFM (Gibco, Gaithersburg, MD, EUA) suplementado com 50 ug /ml de pituitária de bovino Extracto sem factor de crescimento epidérmico (EGF) e meio RPMI suplementado com 10% de fetal de soro de bovino, respectivamente.

a clonagem molecular e a linha celular estável

Ambos os genes de PPARy e reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) flanqueadas por local de entrada ribossomal interna foram construídas de um modo bicistr�ico sob o controlo de tetraciclina induzivel (Tet /Na) promotor de citomegalovírus de vector lentiviral (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). mutações dirigida ao local foram introduzidos em ambos os sites SUMOilação (K79R e K367R para PPARγ1; K107R e K395R para PPARγ2) em PPAR. Os lentivírus e foram produzidos em linhas celulares transduzidas HBEC-C1 tumorigénicas. Além disso processo de triagem foi realizada para selecionar um clone HBEC-C1-PPAR em que tanto o PPARy e expressão EGFP são rigidamente regulados mediante tratamento tetraciclina.

Immunoblot análise

Um painel de linhas celulares imortalizadas HBEC foi cultivadas na presença ou ausência de PPARy troglitazona agonista ou pioglitazona durante 48 horas e os lisados ​​celulares totais foram, em seguida, preparado como descrito anteriormente [7]. Os anticorpos primários para a sinalização celular incluído para anticorpos contra p53 (SC-126, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), K-ras (SC-30, Santa Cruz), fosfo-MEK1 /2 (# 9121, Cell Signaling tecnologia, Beverly, MA, EUA), MEK1 /2 (# 9122, Cell Signaling), COX2 (SC-19999, Santa Cruz), fosfo-ERK1 /2 (# 9101, Cell Signaling), ERK1 /2 (# 9102, Cell Signaling), β-actina (Ab6276, Abcam, Cambridge, Cambridge, Reino Unido), lamina A /C (sc-7292, Santa Cruz), e PPARy (# 2435, a sinalização celular). Os anticorpos primários para a progressão do ciclo celular incluídos anticorpos contra cyclinD1 (# 2926, Cell Signaling), ciclina A (SC-239, Santa Cruz), p16

INK (SC-468, Santa Cruz) e p21

WAF1 ( OP64, Calbiochem, La Jolla, CA, EUA).

crescimento celular e ensaio de formação de colónias

ensaio a contagem de células foi realizada para medir as respostas de crescimento celular. Para o ensaio de contagem de células, duas centenas de HBECs foram semeadas em placas de 96 poços num volume final de mídia de 100 uL por cavidade, seguido por tratamento com troglitazona, a concentrações de 3 uM, na presença de 100 nM do ligando RXR sintético LG268. O número de células foi contado em cinco dias pós-tratamento. O crescimento relativo foi normalizado% para cada dose por tratamento com veículo. Para o ensaio de formação de colónias, cinco milhares de células foram HBEC dividida em placas de 6 poços e tratadas com os ligandos de PPARa ou PPARy. Colónias foram coradas com azul de metileno após 7 a 10 dias de tratamento ligando.

A migração celular ensaio

HBECs com expressão induzível de wt-PPARy ou SUMO-PPAR foram semeadas em placas de 6 poços e totalmente cultivadas com 100% de confluência, seguido por tratamento com mitomicina C para suprimir a proliferação de células. A ferida foi formado por arranhar camada de células com ponta de pipeta estéril. As células foram então incubadas em meio RPMI 1640 contendo 5% de soro fetal de bovino, com ou sem indução de tetraciclina para a expressão do receptor, e seguido por tratamento ligando. A migração celular foi medida após 24 horas de tratamento ligando de PPARy pela contagem do número de células que migraram nas áreas feridas.

relatório Luciferase Assay

células HEK 293 foram co-transfectadas com a quantidade equivalente (15 ng ) de qualquer um dos plasmídeos de expressão ou plasmídeos de controlo de tipo selvagem (wt-PPARy) ou mutante sumoilação (SUMO-PPARy) de PPARy em combinação com um plasmídeo repórter de luciferase de PPAR elemento de resposta (TK-PPRE3x-Luc, 50 ng) e um beta- plasmídeo galactosidase (β-Gal, 20 ng) para a normalização da eficácia de transfecção. As células foram então tratadas com veículo (EtOH), 1 uM de pioglitazona ou troglitazona e ensaiadas quanto à actividade de luciferase.

A transcrição reversa e a QPCR ensaio

Todos os ARNs foram preparados usando o kit Qiagen e reversa transcrito em cDNA por QPCR ensaio (método TaqMan) como anteriormente descrito [12]. A transcrição reversa de 2 ug de ARN total, em 100 ul de volume de reacção foi ajustado para um volume de 200 uL finais. O software SDS versão 2.1 foi utilizado para detectar a real-time PCR reacção realizada no sistema ABI 7900HT. ensaios de curva padrão corrigidos por eficiência foram otimizados para nonbiased, comparação multiplate como descrito anteriormente [8].

dados QPCR análise

A Macro foi criada para analisar os dados brutos importados para Microsoft Excel. A eficiência da PCR (e), foi calculado como E = 10

[- 1 /inclinação], onde a inclinação é obtida a partir da curva padrão por SDS 2,1 software, para a referência e NR 18S de interesse. A macro incluídos os seguintes cálculos estatísticos. A quantidade média (. Avg) para cada amostra, foi derivado de quantidade relativa média de triplicados, onde a quantidade é igual ae

-Ct (ou seja,

quantidade

= (10

[- 1 /inclinação])

-Ct). O coeficiente de variação (CV) pode ainda ser obtido dividindo o desvio padrão da média (DP) pela quantidade média (AVG.), CV = DP /média. O ponto outlier estatístico foi excluída se que era 17% CV. Ao utilizar essas quantidades para ambos 18S e NR de interesse, o valor normalizado para cada expressão NR foi ainda calculado a partir da divisão da NR quantidade média por quantidade de referência avg. (Isto é, valor normalizado = NR quantidade avg /referência quantidade média). Além disso, o desvio padrão para o valor normalizado foi calculado como S.D. = (Valor normalizado) X {(CV de referência)

2 + (CV de NR)

2}

1/2.

Resultados

Caracterização de imortalizado HBECs

O esquema geral para a geração de HBECs imortalizadas e tumorigénicas é mostrada na Fig 1A. Para entender o efeito de alterações oncogênicos sobre o potencial tumorigénico de células epiteliais brônquicas, que anteriormente gerado um painel de HBECs imortalizadas abrigar tanto

K-ras

V12

expressão, knockdown p53, ou ambas as mudanças, que são grandes mutações no cancro do pulmão [32, 33]. Usando um modelo de xenoenxerto de ratinho, os clones HBEC, C1 e C5, foram identificados como sendo tumorigénico e caracterizado. knockdown estável de p53 foi confirmada tanto para ARNm e a expressão de proteína utilizando o ensaio de QPCR e análise de imunotransferência, respectivamente (Figura 1B e Fig S1). A atividade de oncogênico

K-ras

V12

introduzido de forma estável nas linhas de células imortalizadas HBEC foi confirmada por fosforilação de MEK, uma quinase alvo a jusante do K-ras (Fig 1B) . Estas alterações genéticas induzidas claramente uma mudança morfológica celular vacúolo-like que parecia ser a senescência celular, o que é consistente com os resultados de um relatório anterior [31] (Figura 1C).

Esquema (A) para gerar um painel células de HBEC. (B, C)

In vitro

caracterização de HBECs. (B) Os ensaios de imunotransferência foram realizadas para a expressão de K-ras

V12, p53, pMEK, total de MEK, e beta-actina em células HBEC. (C) A visão microscópica das células HBEC (ampliação, 1x). Note-se que HBEC-KT está para linhas celulares HBEC imortalizado por

CDK4

mais

hTERT

; KTR

L, KT mais oncogênicos

K-ras

V12

; KT53, KT mais

p53

knock-down; KTR

L53, KTR

L mais

p53

knock-down.

expressão NR no painel

HBEC

Uma vez que demonstraram recentemente que a padrão de expressão para os 48 NRs é um biomarcador de prognóstico definido, bem como potencialmente sendo alvos terapêuticos para o cancro do pulmão [6-8], que se perguntou se alguma NRs estão associados a patogênese do câncer de pulmão. Portanto, para explorar se a introdução de

K-ras

V12 Comprar e

p53

mudanças oncogênicos afetou a expressão de NRs no pulmão humano células epiteliais brônquicas, nós primeiro perfilado a expressão de ARNm de todos os 48 membros da superfamília NR por qPCR no painel HBEC isogénica que é oncogenicamente bem definida e composta de linhas geneticamente idênticos epiteliais brônquicas celulares (Fig 2 e Fig S2). Encontramos 31 de 50 NRs (incluindo PPARδ2 e PPARγ2, isoformas de PPARô e PPAR, respectivamente) para não apresentam diferenças no painel isogênico (ou teve nenhuma expressão ou nenhuma mudança na expressão) (S2 Fig). Em contraste, 19 NRs mostrou padrões de expressão distintos através dos painéis HBEC isogênicos, que caíram em três grupos diferentes. O primeiro grupo (p53 dependente) incluiu dois membros, o factor de transcrição a montante do promotor-ovalbumina de galinha (COUP-TF) α, receptor de estrogénio (ER) β, NRs mostrando um padrão de expressão dependente de p53 (Fig 2A). O segundo grupo foi representado por NRs com um K-ras

padrão de expressão dependente do V12 incluindo Coup-TFβ,-estrogénio relacionados receptor (ERR) α, fator nuclear de células germinativas (GCNF), o crescimento do nervo fator induzida gene B (NGFIB ) 3, receptor órfão derivados do neurônio 1 (NOR1), PPARa, PPARô, PPARδ2, inverta-erb (Rev-erb) α e receptor órfão relacionado com o ácido retinóico (ROR) α, receptor da hormona da tiróide (TR) β (Fig 2B). O terceiro grupo (K-ras

V12 e dependente de p53) foram ERa, factor nuclear de hepatócitos 4 (HNF4) γ, factor relacionado com o nur 1 (Nurr1), PPARy, receptor de ácido retinoico (RAR) β, órfão relacionados com RAR receptor (ROR) β, que foram NRs com um padrão de expressão dependente do oncogene dupla (Figura 2C). Em linha com os resultados do nosso relatório anterior em que a expressão NR foi altamente associados com a progressão do câncer de pulmão [7], este resultado apoia a noção de que os subconjuntos de NRs também poderia estar envolvido na patogênese do câncer pulmonar induzida por

K-ras

V12

superexpressão e /ou perda de função p53.

o ensaio QPCR foi realizada para a expressão de mRNA de toda a superfamília NR no painel HBEC imortalizado. (A)

p53

expressão knockdown-dependente. (B) Oncogênicos

K-ras

V12

dependente de expressão. (C)

p53

knockdown e

K-ras

V12

dependente de expressão. Note-se que HBEC-KT está para linhas celulares HBEC imortalizado por

CDK4

mais

hTERT

; KTZ, KT mais plasmídeo de controlo com o marcador de selecção de zeocina; KTR

L, KT mais oncogênicos

K-ras

V12

; KT53Z, KTZ mais

p53

knock-down; KTR

L53, KTR

L mais

p53

knockdown. Os dados representam a média ± SD (n = 3). Asteriscos mostram pontos estatisticamente significativas avaliada pela

ANOVA

. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001 em comparação com HBEC-KT.

ativação PPAR reverteu a oncogênico

K-ras

V12

induzida por expressão da proteína COX2

Uma vez que o PPAR foi relativamente bem estudados entre outras NRs em diversas funções fisiológicas (por exemplo, a diferenciação dos adipócitos, controle da inflamação) e seus TZDs ligando disponíveis na clínica de diabetes tipo II, o próximo decidiu investigar o estudo molecular de PPAR , como uma prova de conceito-, dos 48 NRs na patogénese molecular de cancro do pulmão [11, 34, 35]. Consistente com relatórios anteriores que mostram que a expressão de COX2 está associada com a progressão do câncer de pulmão [36, 37], observou-se um aumento dramático na expressão COX2 em HBECs modificado para conter oncogênico

K-ras

V12

(Figura 3A e 3B). Enquanto PPARy ARNm aumentada em paralelo com a expressão de COX2, expressão de proteínas de PPARy eram comparáveis ​​em todos os 4 células HBEC sugerindo regulação pós-transcrição de mRNA de PPARy (Fig 3B). Dado que PPARy desempenha um papel significativo na resposta anti-inflamatória [34, 35], quisemos testar se a activação de PPARy inibe a expressão de pró-inflamatória no modelo de COX2 patogénese do cancro do pulmão. Com efeito, o agonista de PPARy troglitazona inverteu a expressão aumentada de ARNm e proteína de COX2 (Fig 3A e 3B). Juntamente com a inibição da proliferação de PPARy cancro do pulmão como descrito anteriormente [38, 39], este resultado sugere que a supressão da expressão de PPARy COX2 pode ser importante na modulação da transformação maligna induzida pelo oncogene de HBECs para o cancro do pulmão. Com a perda da função p53, a expressão da proteína ciclina D1, um fator chave na progressão do ciclo celular de G1 para a fase S, diminuiu em HBECs com knockdown p53 e diminuiu ainda mais em HBECs com dual

p53 Comprar e

K-ras

V12

alterações oncogênicos, juntamente com o uso de troglitazona (Fig 3B). Em contraste, a ciclina D1 não exibiram nenhuma alteração na HBECs com apenas K-ras

V12 expressão com ou sem a troglitazona. Estes dados sugerem que durante a lesões pré-cancerosas (tipificada pelas células HBEC com

perda de p53

e

K-ras

mudanças V12

), PPARy é expresso e sua a activação dependente do ligando pode conduzir a alterações dramáticas em COX-2 e expressão da ciclina D1 (figura 3A e 3B). No entanto, o tratamento com troglitazona apresentaram igual a inibição da proliferação HBEC-KT ao longo do painel isogénica (Fig 3C). Isto sugere que factores adicionais, juntamente com a COX-2 e ciclina D1, pode estar envolvido na supressão do crescimento de PPARy mediada por células HBEC.

(A) o PPARy e a expressão de ARNm de COX2 foi medida utilizando um ensaio de QPCR em linhas HBEC com ou sem o uso de troglitazona. (B) As imunotransferências usando anticorpos contra COX2, ciclina D1, PPARy ou beta-actina foram usadas para medir a expressão da proteína correspondente no painel HBEC quando tratado ou não tratado com 1 uM de troglitazona. (C) Reacção de crescimento de linhas celulares HBEC-KT para o tratamento combinado de PPARy ligando troglitazona (3 uM) e de RXR LG268 ligando (100 nM). Os dados representam a média ± SD (n = 3). Asteriscos mostram pontos estatisticamente significativas avaliada pela

ANOVA

. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001 em relação ao controle HBEC-KT,

###

P Art 0,001 em comparação com K-ras

controle V12,

+++

P Art 0,001 em comparação com K-ras

V12 + controle p53shRNA.

Caracterização de clones HBEC tumorigênicos

Uma vez que diferentes níveis de expressão de PPARy refletida nenhuma diferença na inibição do crescimento da não-tumorigénico HBECs quando tratados com troglitazona (Fig 3C), nós saber se os HBECs transformadas mostram uma resposta diferente ao tratamento ligando de PPARy e padrões de expressão distintos de outros NRs em comparação com os HBECs pré-cancerosas. Em primeiro lugar, os dois clones caracterizado tumorigénicas, HBEC-C1-C5 e, a nível celular e tecidual. Caracterização histológica dos tumores de xenotransplante revelou, como mostrado recentemente por nós, para que HBEC-KT com knockdown p53 e K-ras

manipulação V12 expressão elevada pode levar a derivados de clones com carcinoma epidermóide histologies- diferente (SCC, HBEC-C1 ) e adenocarcinoma (ADK, HBEC-C5) [31] (Figura 4A). A análise bioquímica confirmou que ambas as alterações oncogênicos,

K-ras

atividade

V12, bem como perda de

p53

expressão, foram igualmente mantida no HBEC- tumorigênico alquilo C1-C5 e clones (figura 4B). Surpreendentemente, tanto de PPARy e COX2 expressões eram drasticamente diminuída em clones HBEC tumorigénicas (Fig 4B e Fig S3) e os clones foram consistentemente tumorigénicas resistente à inibição do crescimento de PPARy (Figura 4C). Estes dados sugerem a possibilidade de que durante a pré-malignidade impulsionado por

p53

e

K-ras oncogénicas

alterações que PPARy e COX2 podem ser alvos terapêuticos, mas que, com o desenvolvimento da malignidade total que os tumores contornar este de controlo, que em alguns casos ocorrer por regulação para baixo de PPARy. Tais descobertas seria consistente com relatos de que o uso de droga anti-inflamatória não-esteróide (AINE) pode proteger contra o desenvolvimento de cancro do pulmão em homens, enquanto a sua utilização em cancros do pulmão plenamente desenvolvidos não parece ter um efeito terapêutico [40].

(A) A análise histológica de clones tumorigênicos; tumor C1 pouco diferenciado carcinoma de grandes células sugestivos de carcinoma de células escamosas (H E, x40) (esquerda) e tumor C5 carcinoma pouco diferenciado com características de adenocarcinoma (H E, x40) (à direita). (B)

In vitro

caracterização de HBEC clones tumorigênicos C1 e C5. Os ensaios de imunotransferência foram realizadas utilizando anticorpos contra K-ras, a p53, Perk, ERK total e beta-actina em clones HBEC tumorigénicas. Usando ensaio QPCR, a expressão de mRNA de PPARy foi medida em clones tumorigênicos (fundo em B). (C) Reacção de crescimento de clones de HBEC tumorigénicas para o tratamento combinado de PPARy (3 uM troglitazona) e de RXR (100 nM) LG268 ligandos. Os dados representam a média ± SD (n = 3). Asteriscos mostram um ponto estatisticamente significativa avaliada pela

ANOVA

. *

P Art 0,001 em relação ao controle HBEC-KT.

expressão NR em clones HBEC tumorigênicos

Uma vez que a expressão PPAR foi notavelmente suprimida nos HBECs totalmente malignas, que se perguntou se quaisquer outras NRs são diferentemente expressa com a mesma progressão tumorigénico. Assim, concluímos o perfil de expressão de ARNm de toda a superfamília NR no painel de não-tumorigénico HBEC-KTR

L53 células e os derivados clonais tumorigénicas, incluindo linhas de células tumorigénicas estabelecidas a partir de C1 e C5 tumores, e C5 do tumor em si (Fig 5A e S4 figura). Quinze dos 50 NRs mostrou padrões de expressão potencialmente associados com a progressão maligna de HBEC-KTR

L53 células em tumores HBEC (Fig 5A). Incluído neste grupo foram AR, Coup-TFα, Coup-TFβ, hipoplasia sexo reversão-adrenal congênita região crítica sensível à dosagem no cromossoma X, o gene 1 (DAX1), ERa, ERRα, HNF4γ, receptor do fígado homólogo-1 (LRH1 ), NOR1, Nurr1, PPARy, RARp, RORα, RORβ, e VDR (Figura 5A). Curiosamente, nove dos 15 NRs (AR, Coup-TFα, DAX1, HNF4γ, LRH1, NOR1, Nurr1, RORα e RORβ) apresentaram aumento contínuo padrão de expressão mediante a progressão tumorigênico (Fig 5B). AR e DAX1 mostraram um aumento da expressão dramaticamente apenas em tumores HBEC, mas não nas linhas de células imortalizadas HBEC. ERRα e VDR mostrou diminuição da expressão durante a tumorigênese de não-oncogênicos HBEC-KT, através HBEC-KTR

L53 para HBEC tumores (Fig 5B). COUP-TFβ, ERa e RARp mostrou um padrão de expressão bifásica, em que a expressão inicial dos NRs em HBEC-KT diminuiu em HBEC-KTR

L53, mas recuperaram em tumores HBEC, que é oposta à perda completa de PPARy expressão em tumores HBEC (Fig 5B). Mais interessante, do tipo adenocarcinoma de células HBEC-C5 e de tumor, mas não é o carcinoma de células escamosas HBEC-C1, mostraram um aumento da expressão de COUP-TFα e β, e a diminuição da expressão de ERRα e VDR, sugerindo que estes quatro NRs pode ser especificamente envolvido na tipo específico adenocarcinoma patogénese do cancro do pulmão.

o ensaio QPCR foi realizada para a expressão de mRNA de toda a NR superfamília na não-tumorigénico HBEC-KTR

L53 células com

p53 Comprar e

K-ras

V12

mudanças, dois clones tumorigênicos C1 e C5, e tecido de tumor xenoenxerto C5. (A) de mRNA Quantitative perfis dos subgrupos NR com padrão de expressão distinta através do painel de expressão. Note-se que o resto do perfil de NR foi mostrado na Fig S4. (B) Síntese de expressão NR a partir do painel A e Fig 2 mostra a cascatas de expressão NR correlacionados com a progressão tumorigénico. Os dados representam a média ± SD (n = 3). Asteriscos mostram pontos estatisticamente significativas avaliada pela

ANOVA

. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001 em comparação com HBEC-KTR

L53.

PPAR inibição dependente da sumoylation do crescimento HBEC tumorigénico e migração

Como mediada pelo ligando PPAR sumoylation suprime a expressão de óxido nítrico induzível acredita-sintase (iNOS), uma enzima pró-inflamatório bem conhecido que gera óxido nítrico, e o papel anti-inflamatória de PPARy para contribuir para a sua função supressora de tumores de que o receptor [34], foi testado se o PPARy sumoilação é crítica para o anti -tumorigenic função desse receptor na série progressão HBEC. Para fazer isso, estabelecemos linhas celulares estáveis ​​tumorigénicas (HBEC-C1) que expressam o tipo selvagem (WT-PPARy) ou mutante sumoilação (SUMO-PPARy) forma de PPARy para estudar se o ganho-de-função das diferentes formas de PPARy ( wt-PPAR vs. SUMO-PPAR) poderia reverter a resistência ao crescimento do tumorigênico HBEC-C1 ao ligando tratamento. Identificou-se que ambas as formas de PPARy não mostrou nenhuma diferença em função de trans-activação mediada pelo ligando para a expressão do gene alvo, utilizando um ensaio de luciferase (Fig 6A). células HBEC-C1 fortemente regulada a expressão de p-PPARy ou SUMO-PPARy sob o controlo do promotor operacional induzível por tetraciclina (Tet /EM) (Fig 6B). células HBEC-C1 com a expressão induzida de WT-PPARy mostrou inibição significativa do crescimento de mais de 50% quando tratado com troglitazona ou pioglitazona (TZDs) (Figura 7A). No entanto, esta resposta inibidora de crescimento foi muito diminuída em células HBEC-C1 com expressão indutível de SUMO-PPARy sob as mesmas condições de tratamento das células HBEC-C1 correspondentes que expressam WT-PPARy (Figura 7A e 7B). Do mesmo modo, o ensaio de formação de colónias de líquido mostrou que clonogenecity PPARy tratamentos ligando inibida de HBECs expressar WT-PPARy e outras linhas celulares de cancro do pulmão, tais como Calu6 e H2347 expressa endogenouse PPARy, mas não de um com SUMO-PPARy (Figura 7B e 7C). No entanto, o tratamento de ligando de PPARa WY-14643 mostrou nenhum efeito em ambos colonogenic WT-PPARy e SUMO-PPARy expressando HBECs (Fig 7C). Isto sugere que o efeito inibitório de TZDs é especificamente dependente de PPARy sumoilação. activação de PPARy também inibiram a migração de células de um modo dependente-sumoilação (Figura 7D). Consistente com isto, a expressão de ambos ciclina A e ciclina D1 diminuiu em células HBEC-C1 expressar WT-PPARy, mas não foi alterado em células HBEC-C1 expressando SUMO-PPARy, quando tratados com TZDs (Fig 8A e S5A FIG). Note-se que a expressão de ciclina-dependente cinase, inibidores de p16 e p21, não foram significativamente alteradas nas mesmas condições de tratamento (Fig 8A e S5A FIG). Além disso, foram investigadas várias vias de sinalização inflamatórios envolvidos na produção de óxido nítrico, prostaglandinas bioquímica, e transdução de sinal de TNFa. Curiosamente, verificou-se que a activação de TZD WT-PPARy diminuiu a expressão de COX2 pró-inflamatória por três vezes, ao passo que a activação de PPARy-SUMO, nomeadamente, o aumento da expressão da proteína COX2 por seis vezes em células HBEC-C1 (Fig 8B). Além disso, a expressão da desidrogenase de 15-hydroxyprostaglandin (HPGD), uma enzima que metaboliza prostaglandina, foi dramaticamente induzida por dezoito vezes quando o WT-PPARy foi activada por TZD. No entanto, as células HBEC-C1-SUMO-PPARy induzida a expressão HPGD significativamente menos (cinco a sete vezes maior) quando tratados com TZD. activação de PPARy também suprimiu significativamente a expressão de TNFa, mas não com outros factores de sinalização de NFkB, de um modo dependente-sumoilação (Fig S5B). Note-se que iNOS não foi expressa em clones HBEC tumorigênicos (S5C FIG). Tomados em conjunto, isto sugere que sumoilação PPARy induzida pelo ligando está especificamente envolvido na supressão de COX2 inflamatória e TNFa vias de sinalização, mas não a via da iNOS, na patogénese do cancro do pulmão.

(A) Ensaio de repórter de luciferase de tipo selvagem e plasmídeos sumoilação mutante PPARy. RLU, unidade relativa de luciferase. (B) a expressão induzida pela tetraciclina da proteína PPARy e EGFP no clone HBEC-C1-WT-PPAR transfectado de forma estável. A visão microscópica de expressão EFGP induzida por tetraciclina (no topo B). Os ensaios de immunoblot para a expressão de lamina A /C e PPARy induzida por tetraciclina (inferior em B). Um construto bicistr�ica de PPARy e EGFP foi introduzido estavelmente num clone HBEC tumorigénico para gerar linhas de células HBEC-C1-PPARy como descrito em Materiais e Métodos. Os dados representam a média ± SD (n = 3). Asteriscos mostram pontos estatisticamente significativas avaliada pela

ANOVA

. *

P Art 0,001 em relação ao controle HBEC-KT.

Reacção de crescimento e migração de células de câncer de pulmão foram analisados ​​ao tratamento com ligantes PPAR. resposta (A) o crescimento celular. *

P Art *

P Art *

P Art