Abstract

níveis CCL5 Aumento são marcadores de um resultado desfavorável em pacientes com melanoma, mama, colo do útero, próstata, estômago ou do pâncreas. Aqui, nós avaliamos o papel desempenhado pelas interações CCL5 /CCR5 no desenvolvimento de câncer de cólon. Para fazer isso, nós examinamos uma série de amostras clínicas de carcinoma colorectal humanos e encontrou CCL5 e seus receptores sobre-expressos dentro primário, bem como fígado e metástases pulmonares de pacientes em comparação com os tecidos saudáveis. In vitro, CCL5 aumentou o crescimento e as respostas migratórias de células cancerígenas do cólon de ambas as origens humanas e mouse. Além disso, o tratamento sistémico de ratos com anticorpos dirigidos-CCL5 reduziu a extensão do desenvolvimento de tumores de cólon, subcutâneas de metástases do fígado e de carcinose peritoneal. Consistentemente, que foi encontrado um aumento dos números de células CD45-imunorreactivo dentro do estroma da restante das lesões, bem como na interface com o tecido saudável. Em contraste, a segmentação seletiva de CCR5 através da administração de TAK-779, um antagonista do CCR5, apenas parcialmente comprometida a progressão do câncer de cólon. Além disso, CCL5 neutralização prestados os tumores mais sensíveis a uma estratégia dirigida-PDGFRβ em camundongos, este regime de combinação que oferece a maior proteção contra metástases hepáticas e suprimindo carcinose peritoneal macroscópica. Coletivamente, nossos dados demonstram o envolvimento de CCL5 na patogênese do carcinoma colorectal e apontar para o seu valor potencial como alvo terapêutico

Citation:. Cambien B, Richard-Fiardo P, Karimdjee BF, Martini V, Ferrua B , Pitard B, et al. (2011) Crescimento Cancer CCL5 neutralização Restringe e potencializa o direcionamento de PDGFRβ no carcinoma colorectal. PLoS ONE 6 (12): e28842. doi: 10.1371 /journal.pone.0028842

editor: Vladislav V. Glinskii, Universidade de Missouri-Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de junho de 2011; Aceito: 16 de novembro de 2011; Publicação: 20 de dezembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Cambien et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale e pela Association pour la Recherche sur le Câncer (Grant 3707). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:. De Bruno Pitard possui ações de In-Cell-Art Co., que desenvolve 704 para aplicações de vacinas. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

interações tumor-estroma são reconhecidos como componentes críticos da invasão tumoral e potencial metastático de cólon carcinoma de [1]. Estroma, células inflamatórias e câncer comunicar entre si directamente através do contato célula, mas também, indirectamente, através de sinais parácrinos [2], [3]. Tais sinais favorecer o desenvolvimento do tumor de várias maneiras: eles agem como fatores de crescimento, estimular a angiogênese, modular a matriz extracelular, induzir o recrutamento de células do estroma adicionais e tomar parte nos mecanismos de evasão imune de câncer. Como consequência, a identificação de fatores promotores de tumor de cancro terapêutica tornou-se de grande interesse para conceber estratégias anti-tumorais para ser aplicado como tratamento de monoterapia ou como terapia de combinação no caso em que os tumores não respondem à monoterapia. Vários factores foram identificados até agora como promotores da progressão do cancro do cólon, o mais comum dos quais são os da família do VEGF (factor de crescimento endotelial vascular), o FGF (factor de crescimento de fibroblastos) familiar e o PDGF (factor de crescimento derivado de plaquetas) a família, os seus produção dentro da neoplasia correlacionando-se com o grau do tumor e sobrevida do paciente mais curto [4] – [8]. Mais recentemente, tem havido cada vez mais evidências de vários estudos, incluindo a nossa, que as quimiocinas produzidas dentro do microambiente do tumor também podem desempenhar um papel crucial na patogênese da CRC (carcinoma colorectal) [9] – [12].

Entre as quimiocinas pensado para promover fortemente carcinogénese e é stromagenesis CCL5 /RANTES (ligando de quimiocina CC 5 /Regulada após activação, normal, de células T-expressas e segregadas), que foi inicialmente descrita por seu papel chave em doenças inflamatórias. De fato, a evidência clínica revelou que níveis elevados de tecido ou CCL5 plasma são marcadores de um resultado desfavorável em pacientes com melanoma, mama, colo do útero, próstata, cancro, quer gástrica ou pancreática [13] – [20]. No cancro da mama,

in vivo

CCL5 neutralização ou antagonismo CCR5 foram mostrados para revogar a metástases induzida por MSC de células cancerosas, implicando, assim, CCL5 /CCR5 como um eixo fundamental neste malignidade [21]. direccionamento selectivo da sinalização CCR5 /CCL5 também levou a um crescimento de tumor reduzido no adenocarcinoma do pâncreas experimental através da ruptura do recrutamento dependente de CCR5 das células T reguladoras em tumores [22]. Anibamine, um novo antagonista do CCR5 também suprimiu as propriedades invasivo e metastático de células de câncer de próstata em ratos [23]. progressão Finalmente, o bloqueio CCL5 significativamente comprometida gástrica câncer [20]. Curiosamente, CCL5 foi recentemente relatado para ser expresso em carcinoma colorrectal, predominantemente na frente invasiva de tumores primários [24]. Com base nas observações clínicas acima mencionadas em vários cancros, é tentador especular que CCL5 e seus receptores pode ter um papel importante na progressão CRC e pode, assim, representar um alvo interessante para o tratamento desta malignidade. Até à data, no entanto, nenhum destes aspectos foram abordados

in vivo

.

O estudo aqui descrito, precisamente, para obter novos insights sobre o papel desempenhado pelas interações CCL5 /CCR5 no desenvolvimento de carcinoma colorrectal. Para fazer isso, nós examinamos uma série de espécimes clínicos cancerígenas do cólon humano e encontrou CCL5 e seus receptores sobre-expressos dentro primário, bem como fígado e metástases pulmonares de pacientes com CCR em comparação com os tecidos saudáveis. Para avaliar a relevância de neutralização CCL5 /CCR5 no carcinoma do cólon, temos usado modelos experimentais sing�icos de ortotópico (fígado) e ectópica (subcutâneo) cancro do cólon em ratos imunocompetentes. Examinámos o efeito de CCL5- ou CCR5-bloqueadores administrados como agentes isolados ou em combinação com um tratamento dirigido a PDGFRβ murino, sendo actualmente em avaliação clínica para o tratamento de cancros CRC esta estratégia. Este relatório fornece a primeira evidência pré-clínico para um papel de CCL5 no carcinoma do cólon e demonstra que o bloqueio CCL5 tem o potencial de reduzir a progressão do cancro do cólon e melhorar a resposta terapêutica em regime multidroga.

Materiais e Métodos

reagente

a seguir reagente (TAK-779) foi obtida através da AIDS Research NIH e do Programa de reagente de referência, Divisão de Aids do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, NIH.

linhas de células de tumor e Animais experimentais

HT29 humano e de ratinho de carcinoma do cólon CT26 células foram adquiridas de ATCC e mantidas em meio DMEM suplementado com FBS inactivado por calor a 10% tal como previamente descrito [11]. ratinhos SCID fêmea e BALB /c, de 6 a 8 semanas de idade, foram adquiridos de Harlan (Gannat, França).

Ética

dez conjuntos de tumores de cancro do cólon primários e metastáticos tecidos da mesma pacientes, bem como emparelhados biópsias de cólon “saudáveis” foram coletadas de pacientes com adenocarcinomas invasivos, que foram submetidos a biópsias cirúrgicas ou cirurgia inicial no Institut Paoli-Calmettes (IPC, Marselha, França), entre 1987 e 2007. Cada paciente deram seu consentimento informado e o estudo foi aprovado pelo IPC “Comité d’Orientação Stratégique”. Todos os procedimentos envolvendo animais de laboratório e seus cuidados foram aprovados pelo conselho de revisão institucional (número Permit # A06-088-14).

TaqMan em tempo real experiências de PCR

O RNA total de colorectal humana cancro do cólon e saudável, a partir de tecidos de rato saudável e tumorais, bem como linhas celulares de carcinoma de cólon foi extraído utilizando o estojo RNeasy (Qiagen, Courtaboeuf, França) e transcrito em cDNA usando a enzima Superscript III (Invitrogen, Cergy Pontoise, França), como anteriormente descrito [11]. PCR em tempo real foi realizada em um ABI PRISM 7900HT e realizada utilizando ensaios de expressão gênica TaqMan® para amostras humanas (hCCR1: hs 00174298m1, hCCR3: hs 00356601m1, hCCR5 Hs 00152917m1, hCCL5: Hs 00174575m1) (Applied Biosystem, Courtaboeuf, França ), ou SYBR® ensaios de expressão de genes de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystem). As sequências dos iniciadores para CCL5 rato foram: para a frente, 5′- TGCCCACGTCAAGGAGTATTTC-3 ‘; e reverso, 5’- AACCCACTTCTTCTCTGGGTTG-3 ‘, por CCR1 mouse: para a frente, 5′- AGGCCCAGTGGGAGTTCAC-3′; e reverso, 5’- TCTTCCACTGCTTCAGGCTCTT-3 ‘, por CCR3 mouse: para a frente, 5′- AAGCTTTGAGACCACACCCTATG-3′; e reverso, 5’-GACCCCAGCTCTTTGATTCTGA-3 ‘; para CCR5 rato, frente 5’TTATCTCTCAGTGTTCTTCCGAAAAC-3 ‘e reverter, 5′- TTCTCCTGTGGATCGGGTATAGA-3’. Níveis relativos de expressão de ARNm foram determinados utilizando ôc

T valores obtidos subtraindo C

controlo T (actina humana ou de rato) de C

gene alvo T medido na mesma preparação de ARN. nível comparativo da expressão de mRNA entre saudável (

X

) e tecidos metastáticos utilizando (

Y

) foi calculada a fórmula Δ

C

T

Y

–

Sc

T

X

e expressos como vezes ao longo saudável (2ΔΔ

C

T). Murino tecidos saudáveis ​​do cólon foram utilizados para analisar tumores de ratos e amostras de cólon saudáveis ​​humanos foram utilizados para analisar tumores humanos e amostras HT-29.

In vitro

proliferação ensaio

Resumidamente , células de cancro do cólon pré-tratados ou não com o TAK-779 ou anticorpos anti-CCL5 (nas concentrações indicadas) foram semeadas a uma densidade de 10

4 células /cm

2 e incubadas em meio enriquecido com soro ou em meio de base (contendo 0,1% de Albumina de soro bovino) suplementado ou não com várias concentrações de CCL5 recombinante (Peprotech, Neuilly-sur-Seine, França) durante 5 dias antes de serem recolhidos e enumerado individual por tripsina tal como descrito anteriormente [11].

In vitro

ensaio de quimiotaxia

respostas Quimiotáticos de células de câncer de cólon foram avaliadas por meio de 24 poços câmaras de quimiotaxia e polietileno tereftalato insere com 8 mm poros (Becton Dickinson, San Jose, CA ) revestidas com 6,5 ug /mL de fibronectina (Sigma, Lyon, França) ou com colagénio /ml 50 ug (Becton Dickinson) para as células CT26 ou as células HT29, respectivamente [11]. células de cancro do cólon, pré-tratados ou não com o TAK-779 ou anticorpos anti-CCL5 (nas concentrações indicadas), foram colocados no poço superior (

5 x 10 4 células) foram adicionados e várias concentrações de CCL5 recombinante (Peprotech) para os poços inferiores. Após incubação das placas durante 18 horas (células CT26) ou durante 40 horas (células HT29) a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera, as células que não migraram foram removidos a partir do poço superior e as células que migraram recolhido em o lado inferior do inserto foram coradas usando corante de violeta de cristal e enumeradas. índice de migração foi calculada como a razão entre o número de células migradas em poços contendo quimioatractivas dividido pelo número de células que migraram para a base médio sozinho.

PDGFRβ vector de expressão do gene

ADN que codifica mPDGFRβ foi clonado e inserido no vector de expressão eucariótico pTOPO-cDNA3 (Invitrogen). Identidades dos sentidos (pcDNA3-PDGFRβ) e antisense (vector de controlo) produtos foram confirmadas por sequenciação.

preparação plasmídeo e formulação

O plasmídeo vacina de DNA (pcDNA3-PDGFRβ) e o vetor de controle correspondente foram usadas como antigénios. Todos os plasmídeos foram purificados usando colunas de purificação de plasmídeo EndoFree (Qiagen) e foram confirmadas como sendo livre de contaminação com endotoxinas (endotoxina 0,1 DNA de plasmídeo /ug UE) pelo ensaio de amebócitos de limulus (Lonza, Le Perray en Yvelines, França). O copolímero em bloco anfifílico tetrafunctionalized 704 (MW 5500) foi fornecido pela In-Cell-Arte (Nantes, França). As soluções stock foram preparadas em 20% (w /v) em água e armazenado a 4 ° C. As formulações de DNA com 704 (concentração final 0,3%) foram preparadas imediatamente antes da injecção intramuscular por mistura de copolímeros equivolumetric em água com uma solução de DNA de plasmídeo como anteriormente descrito [25], [26]. doses administradas de DNA são indicadas em todo o estudo.

A transfecção com o vector de expressão do gene PDGFRβ

A expressão correcta do mPDGFRβ foi verificada por meio de transfecção transitória de células CHO com o vector de controlo e o plasmídeo de vacina de ADN ( pcDNA3-PDGFRβ) usando Amaxa Biosystems (Lonza). Vinte e quatro horas após a transfecção, os lisados ​​celulares a partir de células de CHO foram preparadas como previamente descrito [27], antes de serem submetidas a SDS-PAGE. Western blot foi realizada quer com anticorpos de cabra anti-ratinho PDGFRβ (Santa Cruz Biotechnology, Le Perray-en-Yvelines, França) ou com soro diluído obtido a partir de ratinhos PDGFRβ-vaccinated-. A detecção foi feita tanto por anticorpo de coelho anti-cabra Abs- ou por ratinho de cabra-anti Abs- conjugado com peroxidase de rábano (Dako, Trappes, França). As bandas foram visualizadas por reacção de quimioluminescência aumentada (Amersham, Les Ulis, França).

modelos de rato

modelos

subcutâneas, fígado e metástase pulmonar.

Para a indução da subcutânea e tumores hepáticos, células CT26 (5 × 10

4) ou células HT29 (3 x 10

6) foram injectadas no flanco ou sob a cápsula do fígado de ratinhos BALB /c ou ratinhos SCID, respectivamente. Para a indução de metástases pulmonares, células CT26 (3 × 10

4) ou células HT29 (2 × 10

6) foram entregues por injecção intravenosa na cauda BALB /c ou ratinhos SCID, respectivamente. No momento do sacrifício, foram realizados completos exames post mortem. Subcutâneo e tumores hepáticos foram excisadas, pesados ​​e medidos com pinças nos dois eixos perpendiculares (

a

e

b

). o volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula

ab

2π /6.

DNA intramuscular vacinação.

Depois de uma configuração profilática, os ratos anestesiados foram vacinados 3 vezes no 3 semanas de intervalo (dias 0, 21 e 42) através de injecções intramusculares de formulações de ADN-polímero em ambos

tibial anterior

músculos como descrito anteriormente [25], [26]. Três semanas após o último reforço (dia 66), os ratinhos foram infectados por injecção de 5 × 10

4 de murino CT26 células de carcinoma do cólon sob a cápsula do fígado.

Mouse tratamentos.

Anti -CCL5 ou de controlo anticorpos do isotipo IgG (32 ug por ratinho, Peprotech) foram injectados no peritoneu de ratinhos BALB /c 72 h após implantação do tumor e duas vezes por semana durante a duração dos testes (a partir do dia 69 a 87). TAK-779, o receptor de quimiocina CC pequena molécula 5 (CCR5) inibidor de [28], [29] foi injectada em ratinhos (150 ug /ratinho) 72 h após as células tumorais a inoculação, e depois diariamente até ao sacrifício (a partir do dia 69-87 ).

No momento do sacrifício (dia 87), tumores hepáticos foram extirpados e pesados. Incidência de carcinose peritoneal em ratos foi expressa como percentagem de animais portadores de carcinose em cada grupo.

A determinação dos níveis séricos de Abs específicos de mPDGFRβ por ELISA

O soro foi recolhido por sangrias retro-orbitais em diferentes pontos de tempo após a vacinação de ratinhos imunizados. As placas de ELISA foram revestidas com 2 ng /ml de anticorpos anti-rato PDGFRβ (Santa Cruz) em 100 ul de PBS durante a noite a 4 ° C. Na manhã seguinte, as placas foram lavadas duas vezes com PBS /Tween 20 (PBST), saturada durante 30 minutos com tampão de fosfato contendo 1% de leite desnatado e 0,12% de Triton X-100 (tampão de ensaio), lavou-se novamente duas vezes antes de ser incubada durante 18 h à temperatura ambiente com PDGFRβ de pequeno rato recombinante. Após lavagens repetidas, diluições em série de amostras de soro de ratos imunizados foram adicionadas ao poço em duplicado. As placas foram ainda incubadas durante 2 h, lavou-se quatro vezes com PBST, e a actividade ligada a enzima foi revelado com uma solução de substrato cromogénico de OPD e medido a 490 nm.

Histologia /imuno-histoquímica

Formalina -Fixed, secções embebidas em parafina de câncer de cólon tecidos metastáticos foram coradas com hematoxilina /eosina para avaliação morfológica. A imunocoloração de CD45 foi realizada com anti-ratinho CD45 mAb (BD Pharmingen, Le Pont de Claix, França) pelo método de imunoperoxidase complexo avidina-biotina seguinte recuperação de antigénios microondas. O anticorpo primário foi substituído com anticorpos do mesmo isotipo em secções de tecido adjacentes como controlo negativo. A expressão de CD45 no baço de rato foi utilizado como controle positivo.

A análise estatística

Os resultados são expressos como média ± S.E.M. e analisados ​​utilizando

t

teste de Student não pareado ou o teste de Kruskal-Wallis para comparações múltiplas.

Resultados

A expressão de CCL5 e seus receptores cognatos nas amostras de carcinoma colorretal ressecados

Foram analisados ​​por RT-PCR quantitativo (time-quantitativa verdadeira RT-PCR) os níveis de expressão de CCL5 humana e dos seus receptores CCR1, CCR3 e CCR5 em pedaços de ressecção cirúrgica de tumores de cólon primários humanos, de emparelhado hepática e metástases de câncer colorretal pulmonares e dos tecidos saudáveis ​​coletadas dos mesmos pacientes correspondente. Observamos um aumento dos níveis de expressão CCL5 em tumores colorrectais (6 vezes, P 0,05), as metástases do fígado (8,5 vezes, P 0,05) e metástases pulmonares (4 vezes, P 0,05) em comparação com amostras saudáveis ​​(Figura 1A, Tabela S1 ). Porque CCL5 actua através de receptores específicos, nós também olhou para esses receptores que foram expressas no seio do tumor e amostras metastáticos. padrões distintos de expressão CCRs foram medidos de acordo com o órgão alvo. Considerando que CCR1 e CCR5 foram ambos encontrados a ser significativamente sobre-expressos em tecidos malignos do fígado e pulmão, em comparação com biopsias de controlo correspondente (P 0,01 no fígado, P 0,05 em pulmões), CCR3 só foi considerada como significativamente sobre-expressos nos tumores colorectais primários em comparação com órgãos saudáveis (P 0,05) (Figura 1A, Tabela S1)

a análise dos níveis de expressão de rato (m) alvos humano (h) ou foi realizada por RT-PCR quantitativo em pedaços ressecção cirúrgica do carcinoma colo-rectal humano. (n = 10) (a), em tumores subcutâneos experimentais (n = 6), fígado (n = 6) e as metástases pulmonares (n = 6) derivada de rato CT26 células (B) ou derivada a partir de células HT29 humanas (C) em comparação com tecidos normais correspondentes (humano normal, n = 10, e cólon de rato normal, n = 6, respectivamente). Os níveis relativos de expressão foram calculados utilizando as curvas padrão e expressos como uma /ΔCt. ΔCt valores foram calculados por subtracção do Ct de normalizar a partir do gene Ct do gene alvo, medido na mesma preparação de ARN. nível comparativo da expressão de mRNA entre saudável (

X

) e tecidos metastáticos utilizando (

Y

) foi calculada a fórmula Δ

C

T

Y

– Δ

C

T

X

e expressos como vezes ao longo saudável (2ΔΔ

C

T). barras pretas: tumores de cólon primários ou subcutânea; barras traçadas: metástases hepáticas; barras pontilhadas: metástases pulmonares. * P 0,05, ** p . 0,01

A fim de avaliar melhor o papel da CCL5 /receptores eixo no cancro do cólon, nós olhamos para um modelo de carcinoma de cólon do rato relevante. Para fazer isso, temos analisado por RT-PCR quantitativo do nível de CCL5 expressão /CCR no HT29 humano e nas células cancerígenas do cólon do rato CT26 cultivadas em cultura. Observamos CCL5 e expressão de CCR5 por ambas as linhas celulares in vitro (Tabela S1). Nenhum dos outros dois receptores CCL5 (CCR1 e CCR3) foram detectados nas células HT29, enquanto que a expressão de CCR1 foi encontrado nas células CT26. Para analisar se os padrões de CCL5 expressão /receptores dentro dos tecidos malignos estavam de acordo com os observados em biópsias humanos, o próximo desenvolveu modelos experimentais de ortotópico (fígado e metástases pulmonares) e ectópica (subcutâneo) cancro do cólon em ratos imunocompetentes e imunodeficientes. células cancerígenas do cólon de rato (CT26) ou origens humanas (HT29) foram inoculadas em ratos por via subcutânea, sob a cápsula do fígado ou através de injeção na veia da cauda de gerar metástases pulmonares. No momento do sacrifício, os níveis de quimiocinas /receptores dentro dos órgãos alvo distintas foram avaliados por PCR em tempo real quantitativo utilizando iniciadores murinos para as tmors CT-26 derivadas de humanos e iniciadores para os xenoenxertos de HT-29 (Figura 1B e C). Os níveis elevados de expressão CCL5 foram detectados em todos os modelos de tumor (subcutânea, hepático e pulmonar) desenvolvidas com células CT26 de ratinho e com células HT29 humanas, excepto em lesões pulmonares derivados a partir de células CT26. Em contraste, os padrões de expressão dos receptores CCL5 eram complexos e mudou quando as células foram cultivadas in vivo em comparação com as condições de cultura. Nenhum dos dois modelos de tumor (CT26 e HT29) reflecte exactamente o padrão de expressão de receptores de quimioquinas observado nas biópsias humanas. Portanto, com base no facto de todos os três tipos de tumor CT26 (subcutânea, fígado e pulmão) expressa tanto CCL5 e CCR5 in vivo, ao passo que HT29 xenoenxertos exibiram níveis de CCR5 abaixo do limite de detecção da técnica de PCR, verificou-se mais conveniente trabalhar com os modelos CT26 para avaliar o papel desempenhado por interacção CCL5 /CCR5 em carcinoma colorrectal. Além disso, o modelo singênica CT26 que é desenvolvido em ratinhos imunocompetentes também apareceu a mais adequada para ter em conta mecanismos imunes CCL5 /dependente de CCR5 especialmente considerando que nosso objetivo final era combinar o bloqueio CCL5 com uma estratégia de vacina.

CCL5 aumenta a proliferação de células CRC e migração

in vitro

a expressão dos receptores CCL5 por células de carcinoma do cólon humano e murino levou-nos a determinar a capacidade de sua CCL5 ligando comum para estimular a sua proliferação e migração

in vitro

. Para este fim, foram examinados e quantificados crescimento celular após o plaqueamento de células CT26 e HT29, durante 5 dias a uma densidade baixa em meio base sozinho ou suplementado com várias concentrações de CCL5. Dentro de 5 dias de privação de soro, foi observado que as células de ambas as origens de CRC proliferam em resposta ao tratamento CCL5 de um modo dependente da dose (Figura 2A e C). O crescimento máximo foi observado em resposta à 50 CCL5 ng /ml. A seguir, avaliada a capacidade das células de CRC para migrar em resposta a CCL5. células CT26 e HT29 foram colhidos, colocados em câmaras de Boyden modificadas e deixada migrar para várias concentrações de CCL5. Figura 2B e D mostra que as células CRC migraram para a quimiocina comparação com meio base sozinho. Dado o papel fundamental desempenhado pelo CCR5 na mediação ações CCL5 em várias células do cancro, nós próxima tentaram interromper a ação CCL5 /CCR5 usando TAK-779, um antagonista do CCR5 não peptídico descrito anteriormente de prejudicar o desenvolvimento do tumor no câncer de pâncreas [22]. Doses crescentes de TAK-779 (variando entre 10 e 500 nM) foram testados em células CT26 de acordo com os valores de IC50 descritos na gama baixa nM de [28], [29]. Observou-se um efeito dependente da dose de TAK-779 tanto para o crescimento e as respostas das células migratórias de CRC, como representado na Figura 2E e F. A inibição mais forte foi obtida com 200 nM de TAK-779, doses mais elevadas que levam a efeitos citotóxicos sobre as células. No entanto, apenas 28% das respostas CRC foram revogados pelo bloqueio do CCR5, sugerindo o envolvimento de mecanismos independente de CCR5 em ambos os processos celulares. Várias concentrações de anticorpos anti-CCL5, que variam de 3 a 30 ug /ml, foram então aplicados a células CT26. Como mostrado na Figura 2G e H, CCL5 neutralização obtido com a dose de 10 ug /ml de anticorpos de células de CRC totalmente prejudicada migratórias e respostas de crescimento para a quimiocina. Colectivamente, estes dados sugerem que a activação de receptores /CCL5 aparece como uma característica comum das células de CRC de origens distintas e que pode mediar as propriedades relacionadas com a malignidade das células de cancro do cólon.

(A, C, E, G) a proliferação das células CT26 e HT29 foi avaliada em resposta a um tratamento de 5 dias com meio de base sozinha (BSA, barras em branco), com meio enriquecido com soro (FBS, barras tracejadas) ou com as concentrações indicadas de CCL5 recombinante ( barras a cheio), na presença ou na ausência de TAK-779 ou anticorpos anti-CCL5 (nas concentrações indicadas). (B, D, F, H) células de CRC foram ensaiadas para a quimiotaxia em resposta a basear meio sozinho (BSA, barras em branco), a forma enriquecida com soro (FBS, barras tracejadas) ou com as concentrações indicadas de CCL5 recombinante (preenchido bares ), na presença ou na ausência de anticorpos TAK-779 ou anti-CCL5. Os resultados representam a média ± S.E.M. para seis determinações. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

interações CCL5-CCRs estão envolvidos no desenvolvimento do cancro do cólon

Para investigar se a malignidade-relacionado. Propriedades de CCL5 exercida sobre o cancro do cólon células

in vitro

também têm uma relevância

in vivo

, avaliamos o impacto da neutralização CCL5 no desenvolvimento de tumores do cólon CT26 implantados subcutaneamente em imunocompetentes Balb /c ratos. No dia 0, os ratinhos foram desafiados com uma injecção subcutânea de células CT26 sob a pele. Os animais foram então tratados nos dias +7, +10, +14 e +18 com as administrações intratumorais de anti-CCL5 ou isotipo controle de anticorpos IgG. No momento do sacrifício, a extensão do desenvolvimento do tumor foi avaliada por medição das cargas tumorais. camundongos CT26-desafiados desenvolvido no prazo de 7 dias um tumor palpável média de 20 mm

3 que cresceram a um tamanho de ~336 mm

3 ao dia 21 (Figura 3A). Em contraste, os ratinhos tratados com anti-CCL5 desenvolveram tumores que cresceram com uma velocidade reduzida em comparação com tumores de controlo, sendo essa redução claramente detectável após o terceiro tratamento anti-CCL5 (redução de 40%, P 0,01). No momento do sacrifício, o seu volume atingido um tamanho médio de 202 mm

3, correspondente a uma redução de 40% comparado com o controlo dos encargos (p 0,05).

Ratos (A) por via subcutânea-estimulados com células CT26 recebido quatro injecções intratumorais de anti-CCL5 (pontos a branco) ou anticorpos do mesmo isotipo (pontos a cheio) nos tempos indicados. No momento do sacrifício, a extensão do desenvolvimento do tumor foi avaliada por medição das cargas tumorais. (B) a incidência e extensão do desenvolvimento do tumor no prazo de fígados de ratinhos desafiados CT26-tratados com anti-CCL5- ou anticorpos do mesmo isotipo. (C) Incidência de carcinose peritoneal expressos como percentagem de ratinhos portadores de carcinose. (N = 5 /grupo). * P 0,05, ** p . 0,01

Uma vez que o fígado é um órgão principal alvo na malignidade CRC e que os mais altos níveis de CCL5 expressão, CCR1 e CCR5 foram encontrados dentro de metástases hepáticas de pacientes com cancro do cólon humano, que procurada próxima para avaliar o potencial de protecção do tratamento anti-CCL5 sobre o desenvolvimento de metástases hepáticas experimentais em ratinhos imunocompetentes. Os animais foram, assim, desafiados com uma injecção de células CT26 sob a cápsula do fígado antes de ser tratado 72 horas após a inoculação e duas vezes por semana durante a duração da experiência, com administrações intraperitoneais de anticorpos anti-CCL5 na dose anteriormente demonstrado ser eficaz [20], [21]. Embora 100% dos ratinhos de ambos os grupos desenvolveram tumores hepáticos, houve uma redução significativa (30%) da carga total de tumor no fígado dos ratinhos anti-tratados com CCL5 em comparação com o grupo de controlo, tal como avaliado através da medição do peso do fígado (1,24 vs 1,78, P 0,05). (Figura 3B)

Além tumores do fígado, também se observou diferenças no grau de carcinose peritoneal macrospcopic entre os dois grupos de tratamento (Figura 3C). Considerando que a divulgação peritoneal foi encontrada em 100% dos ratinhos de controlo, apenas foi observada em 40% dos que foram tratados com os anticorpos anti-CCL5.

mPDGFRβ vacinação reduz o crescimento do carcinoma do cólon CT26 metástases

Tendo em conta que a estratégia anti-CCL5 só poderia levar a um efeito terapêutico moderada contra o cancro do cólon, o próximo procurou avaliar o potencial do bloqueio CCL5 administrado em combinação com uma estratégia anti-PDGFRβ. Com efeito, a interacção de PDGF /PDGFRβ é conhecida por desempenhar um papel-chave na promoção de várias malignidades, incluindo carcinoma colorrectal. Em particular, Wehler et al [30], mostraram que a expressão PDGFRβ correlacionada com a disseminação linfática no cancro colorectal humano. Trabalhando em 99 biópsias CRC humanos, os autores relataram por imuno-histoquímica e RT-PCR que PDGFRβ expressão ocorreu em 60% dos pacientes. Do mesmo modo, a expressão PDGFRβ foi detectado em quatro linhas de células humanas CRC: Caco-2, HT29, SW480 e SW620. Consistente com isto, observou-se níveis elevados de expressão de mPDGFRβ em metástases hepáticas CT26 derivados (Figura 4A). Como consequência, foi criada uma vacina de ADN que codifica mPDGFRβ e verificou-se a expressão correcta de mPDGFRβ por análise de Western Blot, após transfecção transitória de células CHO (Figura 4B). Em seguida, prepararam-se formulações de plasmídeos de ADN com 704 de vacina, um copolímero em bloco anfifílico tetrafunctionalized que tem sido mostrado previamente para melhorar a vacinação intramuscular de ADN, aumentando simultaneamente a expressão do transgene e activação de imunidade [25], [26]. A potência da vacina de ADN do plasmídeo-704 formulado para permitir a entrega de genes em

tibial anterior

músculos de ratinhos Balb /c de 6 semanas de idade, foi avaliada por Western blotting (Figura 4C) e confirmou a expressão muscular da administração da proteína a seguir de ADN de dose baixa (25? g). De acordo com um protocolo de imunização previamente optimizado [25], [26], os ratinhos foram infectados no dia 0, e novamente estimuladas no dia 21, e dia 42 com a vacina de ADN (50 ug) ou o vector de controlo formulado com polímero 0,3% 704. duas semanas após a imunização prime-boost, os soros de ambos os grupos de animais foram analisados ​​quanto à presença de anticorpos específicos mPDGFRβ. Tal como representado na Figura 4D, os ratinhos imunizados exibiram uma resposta humoral a proteína mPDGFRβ detectado por ELISA (P = 0,005). A presença de anticorpos mPDGFRβ específicos nos seus soros foi também confirmada testando a sua capacidade para reagir com a banda do antigénio purificado a partir das células CHO mPDGFRβ-transfectados por análise de Western blot (Figura 4E) e por reprobing blot com um anticorpo comercial específica para mPDGFRβ. A capacidade da nossa vacina baseada em DNA para induzir uma resposta imune adaptativa específica do mPDGFRβ levou-nos a examinar se esta abordagem poderia proteger camundongos CT26-desafiados. Na sequência de uma configuração profilática, administrou-se a vacina mPDGFRβ de acordo com o regime de prime-boost descrito acima, antes de inocular as células CT26 sob a cápsula do fígado (Figura 5A). Vinte e um dias após o desafio de células de tumor, comparou-se a extensão do desenvolvimento do tumor no prazo de fígados de ambos os animais de controlo e imunizados. ** P 0,01.