Abstract

Apesar do aumento da compreensão do cancro colorectal e da introdução da terapia medicamentosa alvo, a fase metastática da doença permanece refratário ao tratamento. Uma vez que a desregulação da apoptose normal, contribui para a patogénese do cancro colo-rectal, os novos análogos de nucleósido aqui foram sintetizados e avaliados quanto à sua capacidade para induzir apoptose e causar a morte das células em duas linhas de células de adeno-carcinoma colorectal, Caco-2 e HT-29. Três novos análogos de nucleósido aqui avaliadas mostraram actividade citotóxica, tal como medido pelo ensaio de MTT contra ambas as linhas celulares: as sub

50 valores IC variou entre 3 e 37 uM, com células Caco-2 a ser mais sensíveis do que as células HT-29. Em comparação com a camptotecina, o controlo positivo, os análogos de nucleósidos foram significativamente menos tóxico para os leucócitos normais não estimuladas (

P

0,05). Além disso, os nucleósidos foram capazes de induzir apoptose tal como medido por um aumento da caspase 8 e caspase 3 actividade superior à do controlo. Isto foi adicionalmente suportado pelos dados derivados de ensaios de anexina V-FITC. Apesar das mudanças marginais ao potencial de membrana mitocondrial, todos os três nucleósidos causou um aumento significativo na citosólica do citocromo c (

P

0,05), com uma diminuição correspondente na mitocondrial de citocromo c. A análise morfológica de ambas as linhas celulares mostrou o rápido aparecimento de vacúolos após exposição a dois dos nucleósidos, ao passo que uma terceira causou descolamento celular, retardada vacuolização citoplasmática e alterações nucleares. As investigações preliminares, usando o indicador monodansylcadaverine autophagic cloroquina e como controlo positivo, mostraram que dois dos nucleósidos induzida a formação de vacúolos autofágicos. Em resumo, os novos análogos de nucleósidos mostraram citotoxicidade selectiva no sentido de ambas as linhas celulares de cancro e são iniciadores eficazes de uma resposta apoptótica incomum, demonstrando o seu potencial para servir como suportes estruturais para análogos mais potentes

citação:. Harmse G, Dahan -Farkas N, Panayides JL, van Otterlo W, Penny C (2015) aberrante apoptose resposta de células de câncer colorretal a novos análogos nucleosídeos. PLoS ONE 10 (9): e0138607. doi: 10.1371 /journal.pone.0138607

editor: Ferenc Gallyas Jr., da Universidade de Pecs Medical School, HUNGRIA

Recebido: 28 de fevereiro, 2015; Aceito: 01 de setembro de 2015; Publicação: 21 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Harmse et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Todos os dados estão contidas no manuscrito e Informação de Apoio

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Áreas nichos de investigação da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) da África do Sul e da Universidade de Witwatersrand Faculdade Comité de Investigação em Ciências da Saúde da . JLP foi apoiado pelo Programa Habilidade escasso NRF para estudos no sentido de um Ph.D. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

tem havido progressos substanciais na compreensão dos mecanismos moleculares de cancro colorectal subjacente. No entanto, apesar do uso de terapia medicamentosa orientada, cancro colorectal permanece associado a um mau prognóstico. Embora drogas como bevacizumab melhoraram o período de sobrevivência para doença metastática para além de 20 meses, eles não têm sido capazes de afectar uma cura. Recentemente, os estudos clínicos demonstraram a incapacidade de inibidores da tirosina quinase, tais como sunitinib, o que causou um aumento na gravidade e a incidência de reacções adversas graves com benefício terapêutico mínimo [1]. Portanto, a busca por agentes eficazes para tratar câncer colorretal avançado continua a ser uma prioridade.

Numerosos estudos têm mostrado que o processo de apoptose normal é disfuncional no cancro colorectal [2-5]. A desregulação da apoptose contribui para o desenvolvimento de resistência à quimioterapia e um mau prognóstico [6]. A apoptose, como primeiro descrito por Kerr em 1972 [7], é caracterizado por um número de alterações morfológicas, incluindo vesiculação da membrana plasmática, condensação de cromatina, fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos. Marcas de apoptose incluem a exposição de fosfatidilserina no folheto exterior da membrana plasmática [8, 9], as alterações de permeabilidade mitocondrial membrana [10] e a libertação de citocromo c a partir do espaço inter-membrana mitocondrial, com a subsequente activação do efector caspases [11].

a apoptose é essencial para a regulação do volume de negócios de células normais do epitélio intestinal. No entanto, no cancro colo-rectal, tanto o extrínseca e as vias apoptóticas intrínsecas são comprometidos favorecendo a proliferação de células neoplásicas. No cancro colorectal, apesar de expressão de receptor FAS, as células são resistentes a apoptose mediada por ligando do FAS indicando um defeito na sinalização mediada por FAS [12]. TNF ligando (TRAIL) apoptose mediada pelo receptor indutor de apoptose relacionado normalmente é regulada em células cancerosas; No entanto, no cancro colo-rectal, resistência ao receptor de TRAIL mediada por apoptose foi observada [13]. O produto gene supressor tumoral p53 está mutado ou ausente em 85% dos cancros colorrectais. Este factor de transcrição é essencial para a activação da via intrínseca apoptótica, assim como a expressão da p21 inibidor de quinase dependente de ciclina

WAF1 /Cip1. As células que são deficientes em p53 tenham níveis diminuídos de proteínas apoptóticas, favorecendo desse modo a proliferação de células neoplásicas [14].

Os agentes quimioterapêuticos que são capazes de induzir apoptose são benéficas, uma vez que provocam a morte das células cancerosas, sem desencadeando a resposta inflamatória e a síndroma de lise tumoral associada com necrose. análogos de nucleosídeos são amplamente utilizados para tratar o cancro e gerenciar as infecções virais como herpes e HIV. Fármacos pertencentes a esta classe são conhecidos para induzir a apoptose nas cancros, onde eles são eficazes [15].

No presente estudo, a novos análogos de nucleósidos foram rastreados contra linhas de células de cancro do cólon dois, para investigar ambos os seus efeitos citotóxicos e seu potencial para induzir a apoptose. Mostrámos que, apesar de mostrar relativamente elevadas

50 valores de IC como determinado pelo ensaio de citotoxicidade de MTT, alguns análogos de nucleósidos, foram comparáveis ​​à camptotecina que diz respeito à sua capacidade para induzir apoptose. Além disso, os compostos induziram uma resposta mitocondrial incomum que pode fornecer mais pistas para as anormalidades apoptóticos subjacentes no cancro colorectal.

Materiais e Métodos

cultura celular

HT-29 (HTB -38 ™) e Caco-2 linhas celulares de cancro colorrectal humano obtidos da ATCC (HTB-37 ™), foram cultivadas em baixo teor de glucose Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) que continha 5% de soro fetal de vitela inactivado pelo calor. meio de cultura e soro fetal bovino foram obtidos a partir Highveld Biologicals, África do Sul. As células foram cultivadas em 75 cm

2 frascos de cultura e incubou-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. Ambas as linhas de células foram subcultivadas quando atingiram a confluência. Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 10 ml seguido pela adição de 4 ml de tripsina e incubação a 37 ° C durante 10 minutos. As células separadas foram re-semeadas ao mesmo balão. A camptotecina (Sigma), um conhecido indutor da apoptose, e um inibidor da topoisomerase-1, foi usada como um controlo positivo em todos os procedimentos experimentais.

A avaliação da viabilidade das células

Avaliação do teste nucleósido citotoxicidade foi realizado pelo ácido 3- (2-il-4,5-dimetiltiazol) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), ensaio (Sigma). O ensaio de exclusão com Trypan Blue (Sigma) foi utilizado para avaliar a viabilidade das células cancerosas antes do plaqueamento de células para ensaios de viabilidade celular de nucleósidos. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de células de 9 000 células /poço, deixou-se aderir à superfície de crescimento durante 4 horas e, em seguida, expostos aos nucleósidos de teste durante 48 horas a concentrações que variam entre 1 e 120 uM. O ensaio de MTT foi realizado essencialmente como descrito por Mossman [16] com a excepção de se dissolver os cristais de formazano em DMSO. Resumidamente, após a incubação com MTT, 100? L de meio foi substituído com DMSO para facilitar a solubilização dos cristais de forma zan. A absorvância dos cristais de formazano solubilizados foi medida a 540 e 690 nm com um leitor de placas Labsystems RII. Os dados foram obtidos a partir de experimentos que foram repetidos pelo menos três vezes, com os dados de cada ponto que está sendo determinada em quadruplicado. As curvas de resposta de dose sigmoidal foram construídas com GraphPad Prism, versão 5.

foi obtido

Isolamento de leucócitos periféricos humanos

A permissão para isolar leucócitos humanos de voluntários saudáveis ​​do Comitê de Ética em Seres Humanos da Faculdade de Saúde Ciências da Universidade de Witwatersrand (número de apuramento, M070519). Escrito, o consentimento informado de cada doador foi obtido para o uso experimental de seu /sua leucócitos na investigação. leucócitos periféricos de um único doador foram isoladas do sangue coletado em um tubo heparinizado. As células sanguíneas vermelhas foram lisadas selectivamente usando o Kit Blood DNA Versagene (Gentra Systems). Recentemente preparados leucócitos foram usadas para determinar a toxicidade para as células normais nucleósido. Os leucócitos foram transferidas para meio RPMI (Highveld Biologicals) meio de cultura suplementado com glutamina 2 mM (Sigma) e 10% de soro fetal de vitelo (separações). Após a colheita dos leucócitos, a sua viabilidade foi determinada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano antes de serem expostos aos nucleósidos de teste durante 24 horas.

A avaliação da apoptose

indução de caspase 3 e caspase 8 atividade.

caspase 3 e caspase 8 ensaios colorimétricos específicos, nomeadamente CPP32 e FLICE, foram usados ​​para medir a atividade da caspase de acordo com o protocolo do fabricante (BioVision Research Products). O nível de actividade da caspase em lisados ​​celulares foi directamente proporcional à absorvância de

P

-nitroanilina (pNA), medida a 405 nm num leitor de placas Multiscan Labsystems RII. As células foram semeadas em placas de 6 cavidades a uma densidade de 50 000 células por cavidade e permitiu crescer durante 18 horas antes do tratamento com nucleósidos. O teor de proteína foi normalizada em todas as amostras de teste. Caspase 3 e a actividade da caspase 8 foi medida após diferentes períodos de exposição das células aos nucleósidos de ensaio, tipicamente de 2, 4, 8, 12, e 24 horas depois da adição dos nucleósidos para as células cultivadas.

a medição do potencial de membrana mitocondrial

.

o corante catiónico 5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodeto (JC-1) é selectivo para mitocôndrias e sua fluorescência inerente torna útil para medir o gradiente eletroquímico que existe através da membrana mitocondrial. O protocolo foi seguido de acordo com as especificações do fabricante (BD Pharmingen). O corante JC-1 acumula na mitocôndria de células saudáveis ​​como agregados fluorescentes vermelhas. As células foram semeadas em placas de 6 cavidades a uma densidade de 50 000 células por cavidade e permitiu crescer até à confluência perto antes do tratamento com nucleósidos. A citometria de fluxo, com filtros de excitação /emissão de 485/540 nm (fluorescência verde) e 540/590 nm (fluorescência vermelha), foi utilizado para medir o efeito dos nucleósidos de ensaio sobre o potencial de membrana mitocondrial. As mitocôndrias contendo JC-1 agregados vermelhos em células saudáveis ​​foram detectadas no canal FL-2 (porta superior nas scattergraphs), enquanto verde de JC-1 monómeros em células apoptóticas foram detectadas no canal FL-1 (porta inferior nas scattergraphs ).

Medição da mitocondrial e citoplasmática do citocromo c.

o citocromo C humano Titerzyme imunométrico enzima de Ensaio (Assay Designs Inc.) foi usada para medir a concentração de citocromo c mitocondrial na ea fracções citoplasmáticos de células expostas aos nucleósidos de teste. As células foram semeadas em placas de 6 cavidades a uma densidade de 50 000 células por cavidade e permitiu crescer durante 18 horas antes do tratamento com nucleósidos. As células tratadas foram recolhidas e lavadas com fosfato arrefecido com gelo tampão fosfato salina. A fracção citosólica foi obtido por ressuspensão do sedimento de células com um tampão de permeabilização celular, (sacarose 250 mM, NaCl 137 mM, KCl 70 mM, Na 4,3 mM

2HPO

4, 1,4 mM K

2HPO

4, 0,2 mg /mL e 0,1% de digitonina Hydorol H) fornecido no kit de isolamento mitocondrial, (Assay Designs Inc.) que à esquerda as mitocôndrias intactas. Isto foi seguido por centrifugação para separar a fracção citosólica e para sedimentar as mitocôndrias. As mitocôndrias foram depois lisadas com tampão RIPA, consistindo em 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio e 0,1% de SDS.

Determinação de apoptose tal como medido pelo ensaio de anexina V.

a fosfatidilserina (PS) a translocação para a membrana exterior da célula foi determinada por isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com anexina V. análises de citometria de fluxo com anexina marcada com FITC V e iodeto de propidio foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante (BD Pharmingen), sobre as células expostas a 100 uM de cada um dos nucleósidos de teste ou camptotecina, durante 24 horas. As células foram semeadas em placas de 6 cavidades a uma densidade de 50 000 células por cavidade e deixadas a crescer até à confluência perto antes do tratamento com nucleósidos. A coloração de células foi avaliada utilizando Anexina V-FITC (fluorescência verde), bem como uma exclusão de corante de iodeto de propídio (PI) (negativo para a fluorescência vermelha), gravar, pelo menos, 10

4 eventos. Após a exposição aos nucleósidos de teste, as células foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo em um fluxo BD LSR II citómetro. Os dados foram representados graficamente como uma scattergraph com FITC-anexina V (fluorescência verde) representada no eixo X

relação

PI (fluorescência vermelha) no eixo dos Y.

Caspase 9 actividade.

Caspase 9 atividade foi determinada com o kit de coloração Abcam® Caspase 9 ativa FITC. A caspase 9 inibidor selectivo LEHD-FMK conjugado com FITC penetra células vivas para se ligar a caspase activa 9 de uma maneira irreversível. As células foram semeadas em lamelas estéreis (50 000 por lamela) deixadas aderir durante quatro horas e expostas aos nucleósidos de teste e camptotecina, respectivamente, durante 24 horas. Em seguida as células foram lavadas com PBS e depois incubadas com o substrato, a 37 ° C durante uma hora. As lâminas foram lavadas em PBS e visualizadas em um microscópio de epifluorescência Olympus BX41. As imagens foram capturadas com uma câmera Olympus DP72 e analisados ​​com o pacote Olympus cellSens Software. As células com activado Caspase 9 visor uma fluorescência verde brilhante.

Avaliação do HT-29 e morfologia das células Caco-2

O efeito dos nucleosídeos sobre a morfologia das células foi avaliada por contraste de fase e microscopia de fluorescência . Para a microscopia de contraste de fase, as células foram cultivadas em placas de cultura de 6 poços (50 000 células por poço), deixou-se aderir durante a noite e, em seguida, expostos a nucleósidos para vários períodos de tempo. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. As células foram observados com um microscópio invertido Olympus CKX41 e imagens foram capturadas com uma câmera Olympus DP21. A morfologia celular também foi avaliada com o Hoechst 33342 (Life Technologies) e laranja de acridina (Life Technologies) corantes fluorescentes. As células foram cultivadas em lamelas de vidro esterilizadas de calor e exposto aos nucleósidos de teste a concentrações variáveis. Utilizando os filtros apropriados, as células foram observadas com um microscópio de epifluorescência Olympus BX41. As imagens foram capturadas com uma câmera Olympus DP72 e analisados ​​com o pacote Olympus cellSens Software.

Avaliação da Bcl-2 e Bax expressão

A expressão e localização celular de ambos Bcl-2 e Bax no as linhas HT-29 e Caco-celulares foram determinados por microscopia de imunofluorescência. As células foram cultivadas em lamelas (50 000 células por lamela), deixou-se aderir durante a noite e exposto aos nucleósidos de teste e camptotecina durante 6 horas. Após lavagem com PBS, as células foram fixadas com formaldeído a 3% em PBS durante 20 minutos. As células foram lavadas e permeabilizadas durante 5 minutos, com 0,25% de Triton X100, preparadas em PBS com albumina a 0,5% de soro de bovino (BSA). Seguindo permeabilização, as células foram bloqueadas com 1% (BSA) em PBS durante 1 hora. Em seguida as células foram lavadas e incubadas durante a noite com os respectivos anticorpos primários (Bcl-2, Bax, ou em PBS com BSA a 0,5%) a 4 ° C. De ratinho anti-Bcl-2 e de ratinho anti-Bax foi obtido a partir de Biovision e utilizado a uma concentração de 10 mg /mL. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpo de espécies compatíveis Alexa-Fluor 568 (Abcam) secundário. Faloidina conjugada com FITC, (Abcam), foi usada para visualizar o citoesqueleto e os núcleos foram visualizados com Hoechst 33342 mancha, tal como descrito anteriormente. As células foram visualizados usando um microscópio de epifluorescência Olympus BX41 com os filtros apropriados para cada fluorocromo. As imagens foram capturadas com uma câmera Olympus DP72 e analisados ​​com o pacote Olympus cellSens Software.

Avaliação de células para indução de autofagia

As células foram cultivadas em lamelas estéreis em 6 bem placas 9 (50 000 células por lamela) deixadas a aderir durante a noite e tratou-se com 50 uM de nucleósidos de teste. A cloroquina (50 uM) foi usada como um controlo positivo, uma vez que é conhecido por causar a formação de grande vacúolo autophagic [17, 18]. As células foram expostas aos compostos de teste, cloroquina e camptotecina durante 3 horas, lavou-se com PBS e em seguida incubadas a 37 ° C com 50 pM monodansyl-cadaverina (MDC), (Sigma), em PBS por 15 minutos [19, 20, 21]. A camptotecina foi incluído como um controlo negativo para a formação de vacúolo, uma vez que não conseguiu provocar a formação de vacúolo nas duas linhas celulares. As lamelas foram enxaguadas com PBS e as células vivas foram visualizadas sob o microscópio de epifluorescência Olympus BX41. As imagens foram capturadas com uma câmera Olympus DP72 e analisados ​​com o pacote Olympus cellSens Software.

compostos de teste nucleosídeos

O novos derivados de nucleosídeos, nucleosídeos 1, 2 e 5 avaliadas neste estudo foram sintetizadas em a Escola de Química da Universidade de Witwatersrand, e caracterizado por 1

H e

13C RMN, IV e HRMS espectroscopia. Eles foram sintetizados a partir de uma variedade de materiais de partida adquiridos de Sigma-Aldrich de acordo com processos modificados descritos em Sproat, 1994 [22]. Nucleósidos 2 é um composto conhecido e os espectros dos outros dois compostos estão disponíveis a partir dos autores. As soluções de reserva (20 mM) dos nucleósidos de teste foram preparados em DMSO de grau de cultura de tecidos.

A análise dos dados e estatística

Todos os dados foram analisados ​​e as curvas de resposta à dose construído usando versão Graph-Pad Prism 5. as diferenças entre os controles e amostras de nucleosídeos tratados foram testadas para significância com o pacote de software Prizm3 Instat, usando análise de variância (ANOVA) eo teste t de Student com um limiar de significância de

p Art 0,05.

Resultados

análogos nucleosídeos são citotóxicos para HT-29 e células Caco-2

Três análogos de pirimidina ribonucloesídeos novos foram identificados em um procedimento de triagem de vinte e três novos nucleosídeos como possuindo actividade citotóxica contra ambas as linhas celulares HT-29 e Caco-2, quando testados a uma concentração de 100 uM. As estruturas dos três nucleósidos activos são mostrados na Fig 1A. Nucleósido 1 e 2 eram análogos de uridina e nucleósido a 5 foi um análogo de citidina. As bases de pirimidina foram ligados através de ligação -glucosídicas um

N

de carbono 1 do açúcar ribose. Todas as três moléculas foram substituídos por grupos fenilo volumosos no carbono 5 do açúcar ribose. Nucleósido 1 tinha uma ligação C-O com um grupo 4,4-dimetoxitritilo e nucleósidos 2 e 5 foram ligados a um grupo terc-butildif enilo por meio de uma ligação Si-O estável. Os nucleosídeos foram contados arbitrariamente 1-23 e teste de nucleosídeos número um, dois e cinco foram encontrados para ser ativo nos testes de rastreio iniciais.

A concentração inibitória cinquenta por cento (IC

50 ) os valores foram obtidos para as três nucleósidos activos e são mostrados na fig 1B. As duas linhagens celulares apresentaram sensibilidade diferencial para os três compostos de teste activos e à camptotecina. Células HT-29 foram mais sensíveis à camptotecina do que as células Caco-2, com um IC

50 valor de 5,7 uM em comparação com 10,6 uM, respectivamente. Nucleósido a 5 foi o mais eficaz contra células HT-29 com um IC

50 valor de 3,4 uM e demonstrou actividade semelhante para as células Caco-2 com um IC

50 valor de 4,8 uM. Em células HT-29, nucleósido 1 e 2 tinha IC

50 valores de 6,4 e 3,4 vezes maior do que o da camptotecina, exibindo IC

50 valores de 36,3 e 19,1 ^ M, respectivamente. Isto está em contraste com as células Caco-2, em que um nucleósido tinham actividade semelhante à camptotecina e os análogos nucleosídeos 2 era de 3 vezes mais activo do que a camptotecina, com um IC

50 valor de 3,5 uM. As curvas de resposta de dose representativas são mostrados na Fig S1

Exposição de leucócitos isolados de fresco a cada um dos três análogos de nucleósido e à camptotecina, respectivamente, indicou que nucleósido 2 teve o maior efeito inibitório sobre os leucócitos, causando uma diminuição de 38,5% viabilidade de leucócitos a uma concentração de 100 uM. Este foi duas vezes mais baixo do que o efeito da camptotecina nos leucócitos. Um nucleósido e os nucleósidos 5 foram menos tóxicos para os leucócitos, com a viabilidade das células a ser mantida a 82,7% e 99,9%, respectivamente (ver Figura 1C).

Nucleosides induzir a caspase 8 e a actividade da caspase 3

caspase 8 é uma caspase iniciadora que faz com que a clivagem e activação de caspases efectoras, tais como a caspase 3. a Fig 2 mostra a actividade da caspase 8 e caspase 3, determinado a vários intervalos de tempo, após a adição dos nucleósidos de teste, para ambas as linhas celulares. Os três nucleósidos causou um aumento de caspase 8 e caspase 3 actividade em ambas as linhas de células em relação ao controlo negativo. No entanto, com a excepção de nucleosídeo 2, a actividade de caspase não era tão elevada como a induzida por camptotecina. Nucleósidos 2 foi o indutor mais eficaz da actividade da caspase em ambas as linhas celulares, induzindo a caspase 8 e 3 actividade a um nível semelhante ao da camptotecina. No entanto, em ambas as linhas de células HT-29 e Caco-2, a indução de caspase 8 e 3 uma actividade máxima demoraram mais tempo a atingir (12 horas, em oposição a 2-4 horas). Importante, a actividade de ambas as caspases diminuiu a uma velocidade mais lenta do que a de células tratadas camptotecina, mantendo-se superior a camptotecina após 24 horas de exposição.

Nucleosides tem um efeito mínimo sobre o potencial de membrana mitocondrial (Δψm )

o Δψm foi medida por citometria de fluxo com o corante fluorescente catiónico de JC-1. As percentagens de Δψm no nucleósido tratada HT-29 e Caco-2 As células, em comparação com as células de controlo positivo e negativo encontram-se resumidos na Tabela 1. Em comparação com o controlo negativo, nas células HT-29, nucleósido 2 e 5 tinham uma actividade marginal ( 3%) o efeito sobre Δψm. Nucleósido um tratamento resultou em 4% das células, com uma diminuição da Δψm acima da do controlo. Em contraste, as células tratadas camptotecina tinha 34,8% de células com uma diminuição Δψm comparação com o controlo. Nas células Caco-2, nucleósidos de 1 e 5 afectados cerca de 17% de células, resultando numa diminuição da Δψm, enquanto nucleósido 2 teve um efeito marginal ( 3%) superior ao do controlo. Isto está em contraste com a camptotecina, que causou células de 34,6% com um Δψm nas células Caco-2. Scattergraphs são mostrados na complementar S2 Fig.

Nucleosídeos alterar intracelular citocromo c distribuição

Nas células, entre 90 e 100% do normalmente está localizado no interior da mitocôndria total de citocromo c celular. Figura 3A e 3B mostram que os nucleosidos de teste aumentou a fracção de citocromo c citossólico para ambas as linhas de células em relação ao controlo negativo, mas não à mesma extensão que a camptotecina. Nas células HT-29, nucleósido 2 causou a maior percentagem de citocromo c a mudar para o citosol (75,35 ± 1,15%), embora menor do que o da camptotecina (85,19 ± 1,54%). Os nucleósidos 1 e 5 causou alguma 68,22 ± 0,62% e 70,42 ± 0,62% de citocromo c a mudar para o citosol, respectivamente.

As células foram expostas a 100 uM de nucleósido 1, 2, 5 e camptotecina, respectivamente , durante 24 horas. As barras representam a média ± SEM de três ensaios de ELISA realizados para cada nucleosídeo.

Nas células Caco-2, nucleosídeo 5 causou o maior percentual de citocromo c para deslocar para o citosol (70,42 ± 1,76%), o qual é menor do que o da camptotecina (86,94 ± 1,72%). Os efeitos de nucleósidos 1 e 2 eram comparáveis ​​com o nucleósido a 5 fracções citosólicas citocromo c de 63,87 ± 2,03% e 68,23 ± 0,62%, respectivamente. Os resultados indicam, portanto, que o tratamento com os análogos nucleosídeos causou uma diminuição no citocromo c e aumento concomitante citosólica citocromo c.

aumentos de ligação anexina V em HT-29 e células Caco-2

o ensaio de citometria de fluxo para a anexina V-FITC, indica que a apoptose foi induzida após a adição dos análogos de nucleósidos activos a ambas as linhas de células, como mostrado na Tabela 2 e Fig S3. Após 24 horas de exposição aos análogos de nucleosídeos ou camptotecina, há basicamente duas populações de células: células viáveis, não-apoptosing (anexina V-FITC e PI negativo) e células que sofrem apoptose (anexina V-FITC positivo e PI negativo). Uma pequena população de células foram observadas como sendo de anexina V-FITC e PI positiva, indicando que eles estavam em apoptose em fase terminal ou necrose.

A percentagem de cada uma das subpopulações de células em ambas as linhas celulares expostas para os análogos de nucleósido é mostrado na Tabela 2. nos células HT-29, um nucleósido foi o indutor de apoptose mais eficaz, com 38,4% das células a ser detectado em apoptose precoce e 5,9% de células no final de apoptose /necrose. Embora superior a camptotecina para a apoptose precoce, o tratamento camptotecina, no entanto, causou algum 19,6% de células de mudar para o final de apoptose /necrose. Isto indica que a camptotecina foi capaz de induzir a apoptose a uma taxa mais rápida do que os nucleósidos. 2 nucleósido tratamento resultou em 20,5% de células em apoptose precoce sendo 10,6% e no fim de apoptose. Nucleósido a 5 tinha 22,2% de células em apoptose precoce e 2,3% de células no final de apoptose /necrose.

Os efeitos foram diferentes nas células Caco-2, todos os três nucleósidos mostraram uma percentagem semelhante de células viáveis, variando de 61 para 66,3%. Nucleósido a 5 foi o mais eficaz, com 30,9% de células a ser detectado em apoptose precoce e 4,8% na apoptose ou necrose tardia, enquanto que após um tratamento de nucleósido, 17,4% das células estavam em apoptose precoce e de 14,8% no final de apoptose. Alguns 21,7% das células foram detectados em apoptose precoce e 11,4% de células no final de apoptose /necrose 2 seguinte tratamento de nucleósido. Scattergraphs S3 são mostrados na Fig.

Os nucleósidos não conseguem induzir a caspase 9

actividade

A capacidade dos nucleósidos de teste para estimular a actividade da caspase 9 foi determinada após as células foram expostas a 50? M de cada nucleósido durante 24 horas. A camptotecina (20 uM) foi usada como um controlo positivo e foi capaz de estimular a actividade da caspase 9, em contraste com os três nucleósidos, como mostrado na Fig S4.

Nucleosides não afectam a expressão de Bcl-2 e Bax

de modo a obter mais informações sobre a redistribuição de citocromo C para o citoplasma sem uma alteração importante no potencial da membrana mitocondrial, foi investigada a expressão de Bcl-2 e Bax na célula HT-29 e Caco-2 linhas e sua resposta ao tratamento nucleosídeos. As células foram expostas a 50? M nucleósidos durante 6 horas.

Bcl-2 é fortemente expresso e associado com o núcleo em ambas as células HT-29 e Caco-2.

HT não tratada e tratada -29 células, Bcl-2 foi expressa com um forte sinal fluorescente e associado com o núcleo (Fig S5). Isto foi confirmado pela fusão Hoechst e Bcl-2 imagens que apresentaram uma imagem mesclada rosa indicando co-localização dos dois fluorocromos. A exposição aos nucleósidos de teste não teve qualquer efeito óbvio na Bcl-2 níveis de expressão ou a sua distribuição subcelular. Caco-2 As células de forma semelhante, que teve uma distribuição predominantemente nucleares de Bcl-2. No entanto, algumas células emitido um sinal muito mais fraco do que outros (S6 FIG). A exposição a nucleósidos 1 e 2 redistribuição causada mínimo de Bcl-2 para o espaço perinuclear que não foi observado com o tratamento de nucleósido 5.

Bax é pobremente expressa em HT-29 e células Caco-2 com uma distribuição perinuclear.

Em HT-29 células de controlo, Bax foi escassamente associada com os núcleos com uma distribuição predominantemente perinuclear (S7 Fig). Hoechst /Bax fundiu imagens apoiar a observação de que Bax tem uma distribuição perinuclear. Noteably, a intensidade fluorescente de Bax foi muito mais baixa do que a Bcl-2, indicando os niveis de expressão relativamente baixos. A exposição aos três nucleósidos mostraram um pequeno aumento no Bax fluorescência em comparação com a do controlo. Além disso, o tratamento com nucleósido a 5, causou um agrupamento nuclear polarizada de Bax (Fig S7). O Hoechst /Bax fundiu imagem mostra um aumento na fluorescência de cor, indicando um aumento da associação de Bax com o núcleo.

Expressão e distribuição celular de Bax foi semelhante em células Caco-2 (Fig S8). expressão Bax foi baixa em células Caco-2 e as imagens tiveram que ser reforçada para mostrar a distribuição subcelular. É, portanto, não foi possível determinar se os nucleósidos teve um efeito directo sobre os níveis de expressão do Bax ou a sua distribuição celular, em células Caco-2.

Efeitos dos nucleósidos sobre a morfologia celular

Hoechst coloração identifica núcleos apoptóticos.

em células HT-29, tanto nucleósidos 1 e 2 foram capazes de induzir apoptose tal como reflectido pelo padrão de coloração nuclear específica (indicado com uma seta sólida /bloco na figura 4). Os núcleos de células de controlo não tratadas foram tipicamente de forma oval, a coloração azul com uma distribuição uniforme do corante. Em contraste, as células tratadas com 5 nucleósido que permaneceu ligado à superfície de crescimento após 20 horas, demonstrou núcleos de forma irregular (Figura 4), indicando que o núcleo da célula pode ser um possível alvo. Além disso, estas células apresentaram um elevado grau de vacuolização citoplasmática (Fig 4), indicando um extenso efeito citoplasmático.

As células foram expostas a 50? M do nucleósido 1, 2 e 5 durante 24 horas e corados com Hoechst 33342 mancha . Barra de escala: 20 mm

As células não tratadas Caco-2 mostrou a estrutura nuclear oval típico com o mesmo corante distribuição quando corados com Hoechst (Fig 5)..