Abstract
Fundo
Pouco se sabe sobre as moléculas que contribuem para o crescimento de carcinomas de ovário (EOC), que permanecem o câncer ginecológico mais letal entre as mulheres. A quimiocina fractalcina /CX
3CL1 tem sido amplamente divulgado a desempenhar um papel biologicamente relevante no crescimento do tumor e se espalhar. Relatamos aqui a primeira investigação da expressão eo papel da CX
3CL1 em EOC.
Resultados
As células epiteliais da superfície do ovário e das trompas de Falópio e de benigno, borderline e tumores malignos toda manchada positivo para CX
3CL1. Em amostras de tumores de 54 mulheres que se submeteram a tratamento cirúrgico para o diagnóstico EOC, CX
3CL1 imunorreatividade foi distribuído de forma irregular nas células tumorais epiteliais, e variou de forte (33%) a ausentar (17%). Esta distribuição desigual de CX
3CL1 não refletem a heterogeneidade morfológica do EOC. Foi positivamente correlacionados com o índice de proliferação Ki-67 e com GILZ (induzida por glucocorticóides fecho de leucina), previamente identificado como um activador da proliferação de células malignas EOC. análise de agrupamento hierárquico, incluindo a idade no momento do diagnóstico, o grau do tumor, estágio FIGO, Ki-67 índice, CX
3CL1, SDF-1 /CXCL12 e dezenas imunocoloração GILZ, distinguiu dois grupos principais correspondentes a níveis baixos e altos de proliferação e diferentes em termos de GILZ e
expressão 3CL1 CX.
GILZ sobre-expressão na linha de células derivadas de carcinoma BG1 resultou em alterações paralelas em CX
3CL1 sub produtos. Por outro lado, CX
3CL1 promovido através de sua ligação ao CX
activação 3CR1 AKT e proliferação em células BG1. Em um modelo de xenoenxerto subcutâneo do rato, a sobre-expressão de
GILZ
foi associado com maior expressão de CX
3CL1 e crescimento tumoral mais rápido.
Conclusão
Nossos resultados destacam a expressão constitutiva anteriormente unappreciated de CX
3CL1 anterior tumorigênese em células epiteliais ovarianos. Juntamente com GILZ, esta quimioquina surge como um regulador da proliferação de células, que podem ser de relevância clínica potencial para a selecção do tratamento mais adequado para pacientes EOC
citação:. Gaudin F, Nasreddine S, Donnadieu AC, Emilie D, Combadiere C, Prévot S, et al. (2011) Identificação do quimiocinas CX
3CL1 como um novo regulador da proliferação celular maligna em epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 6 (7): e21546. doi: 10.1371 /journal.pone.0021546
editor: Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de maio de 2011; Aceite: 1 de junho de 2011; Publicação: 07 de julho de 2011
Direitos de autor: © 2011 Gaudin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Ligue contre le cancer (Comité Val d’Oise), o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), a Université Paris-Sud, ea União Europeia FP6 (INNOCHEM, conceda número LSHB-CT -2.005-518.167). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
cancro do ovário
epitelial (EOC), constitui o sexto tipo de câncer mais comum ea quinta maior causa de morte por câncer entre as mulheres nos países desenvolvidos [1]. Devido à natureza silenciosa da doença em estágio inicial, a maioria das mulheres com EOC disseminaram a doença (
ou seja
expansão no peritônio e metástase no omento) no momento do diagnóstico e apresentam doença avançada, com um período de cinco taxa de sobrevivência inferior a 30% no ano [2]. Apesar da alta incidência e mortalidade do EOC, os fatores etiológicos envolvidos na carcinogênese ovariana permanecem pouco conhecidos, limitando a eficácia de protocolos de tratamento.
O microambiente do tumor epitelial consiste em um tecido complexo contendo vários tipos de células. A maior parte destas células produzem e /ou respondem a quimiocinas, que podem desempenhar papéis importantes no desenvolvimento e progressão de tumores epiteliais primárias [3] – [5]. Temos mostrado, por exemplo, que o α-quimioquina CXC estromais derivadas de células factor-1 de SDF-1 /CXCL12 contribui para a rede imunossupressora dentro do microambiente do tumor, nomeadamente por orquestrar o recrutamento de pré-DC2s [6]. Também mostrámos que CXCL12 regula a angiogénese tumoral e que esta é crítica para o crescimento de tumores [7]. Por outro lado, pouco ou nada se sabe sobre o papel do quimiocinas fractalcina /CX
3CL1 em EOC, embora tenha sido comprovado para mediar a adesão celular forte [8] e sua presença em tecidos epiteliais é amplamente documentado [9] – [10]. CX
3CL1 existe em duas formas. A forma ancorada à membrana medeia a adesão firme de células que expressam o seu único receptor, CX
3CR1, ao endotélio sob fluxo fisiológico, através da sua própria função de adesão intrínseca e através da activação de integrina [11] – [12]. A forma solúvel é liberado através de clivagem em um local perto da membrana [13]. Como outras quimiocinas convencionais, recruta células imunes rolamento CX
3CR1, tais como linfócitos T e células NK citotóxicas, células dendríticas ou um grande sub-população de células CD14
+ monócitos [8]. Como resultado de tanto a adesão e actividades quimiotáticas da quimiocina, o CX
3CL1 /CX
3CR1 complexo pode mediar tanto efeitos pro- ou anti-tumor [14]. células de adenocarcinoma ductal do pâncreas rolamento CX
3CR1 aderem especificamente para CX
3CL1-expressando células de origem neuronal e migrar em resposta a CX
3CL1 produzida por neurónios e fibras nervosas, contribuindo para perineural difusão no cancro pancreático [15 ]. células de cancro da próstata que expressam CX
3CR1 aderir às células endoteliais de medula óssea humana e migram para um meio condicionado por osteoblastos, que segregam a forma solúvel da quimiocina contribuindo para a elevada probabilidade de células de cancro da próstata metástase para o esqueleto [16] – [17]. Em contraste, solúvel CX
3CL1 (SCX
3CL1) libertada no microambiente do tumor pode ser um componente activo da resposta anti-tumoral [18] – [21], fazendo com que a vacinação de ratinhos com células de carcinoma modificado para produzir CX
3CL1 uma resposta anti-tumoral potente devido à quimiotaxia de células NK [22], ou fazer CX
3CL1 expressão por células cancerígenas do cólon um fator que reduziu drasticamente o seu potencial metastático [23].
no presente trabalho, nós investigamos a expressão de CX
3CL1 em tecidos ovarianos saudáveis e malignos e o seu papel na proliferação de células epiteliais do ovário malignas. Esta quimiocina foi produzida por ambas as células epiteliais do ovário saudáveis e malignas, e a sua produção em EOC foi positivamente correlacionada com a taxa de proliferação celular. Interessantemente, foi também correlacionada com a expressão de induzida por glucocorticóides de fecho de leucina (GILZ), uma proteína de 17 kDa de fecho de leucina descoberto como uma transcrição induzida por dexametasona em timócitos de murideo, e que têm demonstrado recentemente para aumentar a proliferação de células em EOC e activar AKT, uma molécula de sinalização crucial na tumorigénese [24], [25]. Nossas descobertas foram apoiadas por dados paralelas e complementares acumulados em espécimes de tumor de doentes diagnosticados por EOC, na linha celular de cancro do ovário BG-1 e num modelo de xenoenxerto subcutâneo do rato. Eles fornecem uma visão mais aprofundada do papel da CX
3CL1 na proliferação de células malignas e crescimento do tumor, intimamente associada com GILZ.
Resultados
Detecção de CX
3CL1 em saudáveis e malignas tecidos ovarianos
A expressão celular do CX
3CL1 foi examinado por imunoistoquímica (IHQ) em seções isoladas a partir de três ovários saudáveis, oito tumores benignos serosos e mucinosos (alguns ainda contendo tecido ovariano normal), oito serosa e tumores borderline mucinoso, dois tumores de células da granulosa do ovário e de 54 espécimes de EOC invasivo. CX
3CL1 foi claramente detectado na superfície do epitélio dos ovários (OSE) e as células no epitélio das trompas de Falópio (Figura 1A). Em tumores benignos e serosas e limítrofes mucinosos, CX
3CL1 imunorreactividade foi detectada nas células de tumor em proliferação derivadas do epitélio (Figura 1, B e C). CX
3CL1 expressão foi detectada em espécimes EOC, incluindo a serosa, de células claras, endometrióide e subtipos histológicos mucinosos (Figura 1D). Nestes tumores, foi detectada principalmente em células malignas, fazendo com que as células tumorais a fonte mais significativa de CX
3CL1 em EOC. Consistente com este achado, CX
3CL1 foi detectada nas células epiteliais a partir de ascites malignas, com níveis mais elevados de expressão do CD326
+ fracção (Figura 1E). CX
3CL1 foi confinado para o citoplasma das células epiteliais malignas e não foi detectado nos núcleos. CX
3CL1 estava ausente de tumores de células da granulosa do ovário não-epiteliais (Figura 1F).
(A) ovário saudável, CX
3CL1 imunorreatividade no OSE (i) e trompa de Falópio (ii) . (B) seroso (i) e (ii) os tumores benignos epiteliais do ovário de mucina. (C) serosa (i) e (ii) os tumores epiteliais do ovário limite de mucina. (D) tumores de ovário epitelial maligna: mucinoso (I), endometrióide (II), clara de células (III) e serosa (IV), CX
3CL1 imunorreactividade em células epiteliais é confinado para o citoplasma, nenhuma coloração nos núcleos de células de tumor. (E) citocentrifugada CD326
– não epitelial (i) e CD326
+ epitelial (ii) células isoladas de ascite maligna coletadas de um paciente diagnosticado com EOC invasivo. CX
3CL1 é detectada em CD326
+ células e também em alguns CD326
– células. O tumor de células da granulosa do ovário (F) Non-epitelial, ausência de CX
3CL1 imunocoloração. (A-F) Ampliação x 40.
O ARN mensageiro para CX
3CL1 foi visualizado por meio de RT-PCR, que gerou um produto do tamanho esperado (387 pb) a partir de três amostras de ovário , em seis amostras de tumores de ovário benignos, três espécimes de fronteira e nove espécimes EOC. Também foi detectada no BG1, SKOV3 e linhas celulares de cancro do ovário OVCAR3. Os dados representativos são apresentados na Figura 2A. A quantidade de mRNA foi quantificado por PCR em tempo real em cinco amostras de AOE. Ele foi positivamente correlacionada com a intensidade da coloração IHC em uma escala de sete pontos (teste de Spearman,
P
0,05, r = 0,88) (Figura 2B). Uma proteína de 90 kDa, correspondente ao tamanho esperado do comprimento total CX
3CL1, foi detectado em amostras de biópsia EOC, em CD326
+ células epiteliais a partir de ascites malignas e em SKOV3, células BG1 e OVCAR3 (Figura 2C). CX
3CL1 é uma molécula ligada a membrana com o domínio de quimiocina em uma haste do tipo mucina. A clivagem na base deste talo por metaloproteinases gera uma quimiocina solúvel, que funciona como um quimioatractor clássica [13]. Em seguida, investigou se SCX
3CL1 foi lançado a partir de células de cancro do ovário. Foi detectada em ascites malignas (variando de 1,3 ou 1,5 ng /ml). Também realizamos testes ELISA em sobrenadantes de cultura. As maiores quantidades de SCX
3CL1 foram recuperados a partir do sobrenadante da cultura de células OVCAR3, que deu o sinal mais forte em transferências de Western (Figura 2D). Nossos resultados destacam a expressão constitutiva anteriormente unappreciated de CX
3CL1 no epitélio saudável dos tubos de superfície e de Falópio ovário, indicando que EOC podem ser originários de qualquer um destes epitélios. Nós revelamos ainda que CX
3CL1 produção por células epiteliais malignos precede tumorigênese.
(A)
CX
3CL1
mRNA foi detectada por PCR convencional com o tamanho esperado (387 pb ) em amostras representativas de 2 ovários saudáveis, 5 Cystadenomas (tumores benignos), 2 tumores borderline, 5 adenocarcinomas (tumores malignos) e nas linhas celulares EOC-derivados, SKOV3, OVCAR3 e BG1. A linha branca vertical separa as pistas não são executados no mesmo gel. (B)
CX
3CL1
níveis de mRNA foram quantificados por PCR em tempo real e são expressos como
CX
3CL1
conteúdo normalizado ao do
ß-actina
. O diagrama mostra a distribuição dos escores imunocoloração versus a quantidade de
CX
3CL1
mRNAs normalizados aos de
ß-actina Compra de 5 amostras EOC. Cada símbolo representa uma corrida de amostra individual em triplicado (valor médio); O teste de Spearman,
P Art 0,05, r = 0,88. (C) CX
3CL1 imunotransfer�cias de lisados de proteína total de espécimes EOC, a partir CD326
+ amostras de ascite maligna enriquecida de células epiteliais e, a partir SKOV3, BG1 e linhas celulares OVCAR3. O
3CL1 proteína CX é indicado como uma banda de ~ 90 kDa. níveis de ß-actina são mostrados para a normalização. (D) de detecção por ELISA de SCX
3CL1 no meio de cultura de 24 h das células BG1, OVCAR3 e SKOV3 (dados são médias ± SEM de três experiências separadas); indetectável SCX
3CL1 no meio de cultura de células HEK-293T (HEK), usado como um controlo negativo.
CX
3CL1 está correlacionada com Ki-67 e GILZ em EOC
CX
3CL1 imunocoloração foi heterogênea em amostras EOC, que vão desde a ausência de coloração detectável (escore 0, 9/54) a uma forte imunorreatividade (escores 5-7, 18/54). Por conseguinte, investigado se as diferenças em CX
3CL1 níveis de expressão foram associados com a expressão de dois marcadores de proliferação: Ki-67, que é utilizada rotineiramente para o diagnóstico [26] e GILZ, que foi recentemente identificada como um factor que controla a proliferação de células malignas EOC [25]. A imunorreactividade para CX
3CL1, GILZ e Ki-67 foi pontuada numa escala de sete pontos na base da intensidade de coloração e o grau de coloração de secções em série de fragmentos de EOC de 54 pacientes. Houve uma correlação positiva altamente significativa entre as pontuações para Ki-67 e aqueles para GILZ, como esperado (Tabela 1). Curiosamente, correlações positivas significativas foram encontradas entre CX
3CL1 e Ki-67 e entre CX
3CL1 e GILZ, para toda a coorte de 54 pacientes (Figura 3, A e B). As pontuações de positividade para estas proteínas também foram correlacionados no carcinoma seroso e carcinoma seroso não (Tabela 1).
(A e B) CX
3CL1 e Ki-67 pontuações finais (A, teste de Spearman,
P Art 0,01, r = 0,38) e as pontuações finais CX
3CL1 e GILZ (B, teste de Spearman,
P Art 0,0001, r = 0,59) foram positivamente correlacionados em 54 espécimes EOC incluindo serosa (quadrados pretos) e amostras não serosa (quadrados brancos). (C) Dendrograma gerado pela análise hierárquico aglomerativo cluster para os 54 espécimes EOC estudados, contra a idade no momento do diagnóstico, o estágio FIGO, grau, Ki-67, GILZ, CX
3CL1 e os níveis de imunorreatividade CXCL12. Dois grupos são identificados, com elevados (em baixo) os níveis de proliferação de baixo (em cima) e. Espécimes relevantes são rotulados com números.
CXCL12, uma quimiocina produzido por células de cancro do ovário [6], tem sido implicado no controlo da proliferação nestas células [27]. Como já demonstrado anteriormente em uma coorte de 183 pacientes [28], CXCL12 imunorreatividade em células cancerosas foi heterogênea, com escore de 0 (produção indetectável) obtidos em 16 pacientes e de 5 a 7 (forte imunorreatividade) obtido em oito pacientes do nosso coorte de 54 pacientes. Não houve correlação significativa entre as pontuações finais para CXCL12 e CX
3CL1, ou entre as pontuações finais para CXCL12, GILZ e Ki-67. Uma análise de sete conjuntos de dados, incluindo a idade no momento do diagnóstico, o estágio FIGO, classificação, GILZ, Ki-67, CX
3CL1 e CXCL12 imunoreatividades, com base em uma abordagem de agrupamento hierárquico aglomerativo revelou dois grupos principais, como mostrado pelo dendrograma gerado a partir de a análise estatística (Figura 3C). As características principais que distinguem os dois grupos principais, correspondentes a níveis baixos e elevados de proliferação, são apresentados na Tabela 2. Conforme esperado, a produção de CXCL12 não diferiram significativamente entre os dois grupos. Em contraste, CX
3CL1 e GILZ imunorreactividades em células de tumor foram mais elevados para o grupo com o maior nível de proliferação. Apesar do número relativamente pequeno de pacientes, o número de cancros em FIGO fases III e IV, foi significativamente maior no grupo de alto proliferação. Por outro lado, a idade no momento do diagnóstico e grau não diferiu entre os dois grupos. Assim, as taxas mais elevadas de proliferação foram associados com a regulação positiva de GILZ e CX
3CL1 expressão.
GILZ regula positivamente CX
3CL1 expressão
Os dados imuno-histoquímica indicou claramente que GILZ níveis em células malignas foram positivamente correlacionados com CX
3CL1 níveis, sugerindo um possível papel para GILZ na regulação CX
3CL1 produção. Testamos esta hipótese determina os montantes dos CX
mRNA 3CL1 e proteína na pGILZ (superexpressão GILZ) e CTRL (produzindo baixa quantidade de GILZ) células BG1. Como esperado, o conteúdo GILZ (ARNm e proteína) foi significativamente mais elevada do que em pGILZ em clones CTRL. aumentos paralelos em CX
mRNA e proteína 3CL1 foram retratados na RT-PCR, IHC e Western blot (Figura 4, A, B e C). Além disso, as células pGILZ libertaram quantidades maiores de SCX
3CL1 do que as células de controlo (Figura 4D). Usando um Ab segmentação do domínio extracelular de CX
3CL1, transferências de Western de lisados de células BG1 tratadas com forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), uma proteína-quinase C (PKC), activador, mostraram uma ausência do 90-kDa banda correspondente ao full-length da CX
3CL1. Por outro lado, este tratamento aumentou a liberação de SCX
3CL1 no sobrenadante. (Figura 4, C e D). Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que CX
3CL1 produção pelas células malignas epiteliais ovarianos é regulada por GILZ.
(A)
CX
3CL1
intensidade do sinal PCR em CTRL e pGILZ células BG-1 foi quantificada por densitometria com normalização contra o sinal para
ß-actina
; os resultados estão expressos como
CX
sub rácios
3CL1 /SS-actina. representante Um experimento de três. (B) imunocoloração para CX
3CL1 em CTRL e pGILZ BG1 células citocentrifugada. Ampliação x 40. (C) Total de extractos de proteína celular de células CTRL e pGILZ BG1 cultivadas com ou sem 100 ng /ml de PMA durante 24 horas foram analisados por transferência de Western com um Ab específico que reconhece o domínio extracelular do CX
3CL1. CX
3CL1 níveis foram quantificados por densitometria, com normalização contra o sinal para ß-actina; os resultados são expressos como CX
rácios 3CL1 /SS-actina. Um representante experimento de três. (D) Os histogramas mostram a libertação de SCX
3CL1 para o sobrenadante de células tratadas ou não com PMA, tal como medido por ELISA. Os resultados são as médias ± SEM de três experiências independentes. *
P 0,05
, ausência contra presença de PMA e
#
P 0,05
, CTRL contra pGILZ BG1 células (não pareado
t
test)
CX
3CL1 aumenta a proliferação de células malignas
Nós mostramos que SCX
3CL1 é liberada pelas células de cancro do ovário do derramamento do quimiocina ligada à membrana sugerindo que SCX
3CL1 pode ser um componente activo do microambiente tumoral. Aqui, nós perguntado se esta quimiocina tem um impacto na proliferação de células tumorais, como sugerido pela correlação de CX
3CL1 e Ki-67 colorações imunológicas em amostras EOC. Esta acção proliferativa pode resultar de um efeito autócrino de CX
3CL1, que depende da expressão do seu receptor único, CX
3CR1 [8]. Detectamos
CX
3CR1
ARNm por RT-PCR convencional com o tamanho esperado (340 bp) em todas as amostras testadas EOC (N = 14) e nas três linhas celulares EOC, BG1, e SKOV3 OVCAR3. Flow-citometria analisa membrana revelou ainda CX
expressão 3CR1 tanto CD45
+ e CD45
– células de amostras de tumores malignos. No CD45
– fracção, que é altamente enriquecidas em células de ovário epiteliais malignas, a percentagem de CX
3CR1
+ células variaram de 20% a 95% (Figura 5A). Em células BG1, a nível de estado estacionário de membrana CX
expressão 3CR1 foi fraca ( 10% do total de células) em condições basais (Figura 5B). Curiosamente, a fracção de CX
sub 3CR1
+ células foi acentuadamente aumentada por tratamento ácido, um processo conhecido para dissociar o ligando do seu receptor. Por outro lado, diminuindo a concentração de FBS a 10% a partir de 1% em meio de cultura levou a um aumento da expressão de membrana CX
3CR1 em células BG1 (Figura 5C). Em contraste, o nível de superfície CX
3CR1 foi mais baixa em células pGILZ, que produzem maiores quantidades de SCX
3CL1 do que as células CTRL. Com base nestes resultados, usamos células CTRL BG1 cultivadas em meio suplementado com 1% FBS para medir o efeito proliferativo de recombinante humana (rh) CX
3CL1 por [
3H] -timidina. Os resultados de nove experiências independentes mostraram que rhCX
3CL1 aproximadamente o dobro da taxa de proliferação das células após 24 h de tratamento (Figura 6A). Esta resposta foi anulada através da adição de um CX
3CL1 analógico com um terminal-N modificado que se liga ao CX
3CR1 e actua como um antagonista (Figura 6B) [29]. Estes resultados mostram uma ação proliferativa das exógena CX
3CL1 através da sua ligação ao CX
3CR1. A seguir, investigou se endógena CX
3CL1 estimula a proliferação de células tumorais. Para este fim, as células pGILZ BG1, que geram grandes quantidades de endógena CX
3CL1, foram tratados com o CX
3CL1 analógico renovada a cada 24 h durante 72 h. Sob estas condições, a taxa de proliferação de células foi marcadamente diminuída, subjacente a um papel para endógena CX
3CL1 na regulação da proliferação de células de tumor (Figura 6C).
(A) Níveis de CX
e 3CR1 do marcador pan-hematopoéticas CD45 foi determinada por citometria de fluxo em 2 amostras recentemente dissociados de espécimes EOC. Os números indicam frequências de CX
3CR1
+ CD45
– células. (B) perfis FACS representativos para CX
3CR1 níveis em células BG1. Esquerda, expressão de superfície de CX
3CR1 em condições basais; meio, expressão de superfície de CX
3CR1 em células após o tratamento ácido; direita, expressão de CX
3CR1 em células permeabilizadas. Os números indicam percentagem de CX
sub 3CR1
+ células (média ± SEM) de 3 experiências independentes. (C) Os histogramas mostram a intensidade de fluorescência de CX
coloração 3CR1 na superfície de células CTRL BG1 cultivadas na presença de 1% ou 10% de FBS, e de células CTRL e pGILZ BG1 cultivadas na presença de 1% de FBS. Os números indicam a percentagem de CX
3CR1
+ células para uma experiência representativa de três.
(A-C) A proliferação foi medida por [
3H] -timidina (a) em células CTRL incubadas com ou sem 10 ng /ml rhCX
3CL1 durante 24 h, 9 experiências independentes. Histogramas representam médias ± SEM, teste t pareado,
**
P Art 0,001; (B) em células CTRL incubadas com ou sem 10 ng /ml rhCX
3CL1 durante 24 h, na presença ou ausência de 10 ug /ml CX
antagonista 3CR1; cada símbolo representa uma corrida de amostra individual em triplicado, as linhas representam valores médios, *
P Art 0,05,
t
teste, uma experiência representativa de 3; (C) em células pGILZ com e sem tratamento com 10 mg /ml CX
antagonista 3CR1 substituído a cada 24 h por 72 h, cada símbolo representa uma corrida de amostra individual em triplicado, as linhas representam valores médios, *
P
0,05,
t
teste, uma experiência representativa em 3. (D) os extractos totais de proteína celular de células CTRL cultivadas na presença e na ausência de 10 ng /ml rhCX
3CL1 analisados por western blot com Abs específico. níveis de pAkt foram quantificadas por densitometria, com normalização em relação ao sinal de AKT total. Os resultados são expressos como razões de pAKT /AKT. Um blot, representante dos três realizados, é mostrado.
AKT hiperativação é frequentemente observada em cancros do ovário e está relacionada ao controle da proliferação celular na EOC [30], [31] [32] – [33]. Níveis de pAKT, que é a forma activa de AKT, foram maiores nas células rhCX BG1
3CL1-tratados (Figura 6D). Estes resultados sugerem fortemente que o efeito proliferativo do CX
3CL1 /CX
3CR1 casal está associada à activação AKT. GILZ foi previamente identificado como um factor proliferativo activação AKT em EOC [25]. Para confirmar que CX
3CL1 ação envolve a activação AKT
in situ
, medimos Ki-67 e PAKT pontuações em espécimes EOC marcou 0 para GILZ e quer produzir ou não CX
3CL1. Como mostrado na Tabela 3, a proliferação e a fosforilação de AKT foram mais elevadas em amostras que produzem CX
3CL1. Em conjunto, esses resultados sugerem que o efeito proliferativo do CX
3CL1 em células malignas epiteliais ovarianos é consecutivo ao CX
ligação 3CR1 que ativa AKT.
In vivo
impacto da GILZ superexpressão
Finalmente, nós investigamos o impacto da GILZ e CX
3CL1 no crescimento do tumor
in vivo
utilizando um modelo de xenoenxerto subcutâneo mouse. BG1 células que sobre-expressam quer GILZ (pGILZ) ou não (CTRL) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus atímicos e o crescimento tumoral foi seguido durante 35 dias. Os volumes de tumor médios são representados graficamente na Figura 7A. Os tumores em desenvolvimento a partir de células pGILZ tinham volumes significativamente maiores do que aqueles em desenvolvimento de CTRL, em qualquer ponto do tempo. Western blot de extratos de xenotransplante e imunomarcação mostraram aumentos paralelos em GILZ e CX
3CL1 níveis de proteína (Figura 7, B e C). Assim,
GILZ
superexpressão está claramente associada com níveis mais elevados de CX
3CL1 produção em tumores, resultando em taxas mais elevadas de crescimento e proliferação do tumor.
células pGILZ ou CTRL BG1 (A) (40 × 10
6 células /ml) foram injectados subcutaneamente nos flancos direitos de ratinhos nus. O tamanho do tumor foi medida a cada 5 dias, durante 35 dias (n = 3 ratos por grupo). O volume do tumor [mm
3] foi calculado da seguinte forma: (comprimento [mm]) x (largura [mm])
2 × 0,5 **
P Art 0,001 (não pareado
t
teste). (B) Os extractos totais de proteína celular de tumores xenoenxertados foram analisadas por western blotting com Abs específicos. níveis CX
3CL1 e GILZ foram quantificados por densitometria, com normalização contra o sinal para ß-actina; os resultados são expressos como proporções CX
3CL1 ou GILZ /ß-actina. Um representante blot de três realizado é mostrado. (C) As secções em série de tumores xenoenxerto pGILZ e CTRL foram coradas para CX
3CL1, GILZ e Ki-67. Controlo negativo: sem marcação foi detectado quando cada Ab primário foi omitido. Ampliação x 40.
Discussão
Neste estudo, revelou que CX
3CL1 foi constitutivamente produzido em EOC e investigou o papel deste quimiocinas no crescimento do tumor. A produção deste quimiocinas precedida malignidade no OSE, e também foi encontrada nas trompas de mulheres saudáveis e em tumores benignos. A análise imuno-histológica revela que CX
3CL1 produção em amostras EOC foi correlacionada com os níveis de Ki-67 e GILZ, dois marcadores de proliferação em células epiteliais do ovário malignas. análise de agrupamento hierárquico identificados dois grupos principais, com altos e baixos níveis de proliferação, diferindo em GILZ e CX
3CL1 níveis.
In vitro
, GILZ superprodução leva a um aumento no CX
3CL1 produção em células BG1. CX
3CL1 aumenta a proliferação celular através do seu receptor BG1, CX
3CR1, e um aumento paralelo é observado em níveis de pAkt. Em ratinhos xenoenxertados, a sobre-expressão de ambos GILZ e CX
3CL1 está associada com o crescimento do tumor mais rápido. Esses resultados destacam uma relação entre GILZ e CX3CL1 como um regulador chave da proliferação de células malignas e crescimento do tumor.
De acordo com as hipóteses recentes relativas à origem e histogênese do EOC, eu tumores do tipo, que são acreditados para incluir todos os principais histotipos, originam o OSE, que era tradicionalmente considerado como sendo a fonte da transformação neoplásica. Em contraste, tumores do tipo II, que se pensa compreendem quase exclusivamente carcinoma seroso de alto grau, acredita-se que surgem a partir da região distai das trompas de Falópio [34] – [36]. Tanto o OSE e as trompas de Falópio são actualmente pensado para ser possíveis fontes de EOC neoplásica e ambos são derivados a partir da conduta Mülleriano embrionário [37]. CX
3CL1 foi detectada no endométrio humano [38] e as trompas de Falópio [39]. Nós também detectou CX
3CL1 no OSE, ainda indicando que a produção de CX
3CL1 por células epiteliais ovarianos precede tumorigênese. CX
3CL1 foi também detectada em células de tumor benigno e borderline, o que sugere que a sua produção não está associada a malignidade.
tumores epiteliais ovarianos são morfologicamente heterogénea e são classificados por patologistas em serosa, de células claras, endometrioid e subtipos de mucina com base no exame histopatológico. Cada subtipo é caracterizado por um perfil específico de mRNA, os factores de risco genéticos e características moleculares [34] [40] – [41], sugerindo que o carcinoma do ovário é uma doença heterogénea [42]. Apesar desta heterogeneidade, não houve associação significativa entre CX
3CL1 níveis e tipo histológico em nossa série, que incluiu amostras representativas de todos os quatro principais tipos histológicos de EOC. Como GILZ e CXCL12, CX
3CL1 é amplamente expresso em EOCs e sua presença não reflete a heterogeneidade morfológica de EOC [25] [28].
As quimiocinas, incluindo CXCL12, são produzidos localmente no ovário tumores e contribuir para o microambiente do tumor [5] – [6]. Aqui, identifica-CX
3CL1 como um outro componente do microambiente EOC. As células epiteliais de ascite maligna, amostras tumorais e de três linhas celulares de cancro do ovário, nomeadamente BG1, OVCAR3 e SKOV3, exibido coloração para CX
3CL1. CX
3CL1 foi confinado para o citoplasma e estava ausente dos núcleos. As células contidas CX
3CL1 com um peso molecular de 90 kDa correspondente à forma da membrana CX
3CL1, a partir do qual a forma solúvel é derivada através do derramamento [8]. A produção de SCX
3CL1 em sobrenadantes de cultura paralelo de que a forma ligada à membrana, sugerindo que a produção de SCX
3CL1 em EOC microambiente foi aumentada em tumores com forte CX
3CL1 imunorreactividade. Curiosamente, o local de libertação dos CX
3CL1 podem também depender de CXCL12, produzidos por células malignas epiteliais do ovário em EOC e conhecida para regular a clivagem de CX
3CL1 de neurónios [43]. Não podemos excluir a possibilidade de que CXCL12 estimula as metaloproteinases envolvidas na CX
3CL1 clivagem no EOCs, como acontece em culturas neuronais. Na verdade, uma investigação mais aprofundada deste aspecto é necessária para concluir.
A intensidade do CX
3CL1 coloração ea fração de células tumorais coradas para CX
3CL1 foram variáveis em nossa coorte de 54 doentes com doença avançada EOC primário. Esta heterogeneidade na produção do CX
3CL1 foi positivamente correlacionada com os níveis GILZ.