Abstract

Ratos têm sido utilizados como modelos de câncer há mais de um século, proporcionando avanços significativos em nossa compreensão deste multifacetado família de doenças. Em particular, modelos de ratos de xenotransplante tumoral ortotópicos estão emergindo como a preferência para pesquisa de câncer devido ao aumento da relevância clínica em relação aos modelos subcutâneos do rato. No estudo atual, desenvolvemos modelos de xenotransplante de cancro pancreático ortotópico em camundongos através de um método minimamente invasivo, ultra-som injeção guiada (USGI) comparável à injeção ortotópico métodos altamente invasivos cirúrgicos (SOI). Este método optimizado impedido complicações da injecção, tais como células de recuo através do canal de injecção ou vazamento de células fora do pâncreas para a cavidade peritoneal. O crescimento do tumor foi monitorizado in vivo e quantificado por imagens ultra-sónicas semanal, os tumores foram também detectadas por fluorescência imagiologia in vivo utilizando um tumor-alvo da sonda molecular. Os volumes tumorais médios para os modelos USGI e SOI após 2 semanas de crescimento do tumor foram 205 mm

3 e 178 mm

3, respectivamente. Por USGI de linhas celulares de cancro pancreático humano, xenotransplantes de cancro do pâncreas ortotópicos humanos foram estabelecidos. Com base em imagens de ultra-som, o xenotransplante de cancro pancreático humano ortotópico tomar taxa foi de 100% para ambas as linhas celulares de cancro do pâncreas humanos utilizados, MiaPaCa-2 e Su86.86, com volumes de tumor médios de 28 mm

3 e 30 mm

3 . Nós demonstramos que este método USGI é viável, reprodutível, fácil, minimamente invasivo e melhorado em comparação com o método SOI altamente invasivo para o estabelecimento de modelos de xenotransplante de tumor pancreático ortotópico adequado para imagiologia molecular

Citation:. Huynh AS, Abrahams DF , Torres MS, Baldwin MK, Gillies RJ, Morse DL (2011) Desenvolvimento de um cancro da Xenoenxerto modelo ortotópico pâncreas humano, utilizando ultra-som injeção guiada das células. PLoS ONE 6 (5): e20330. doi: 10.1371 /journal.pone.0020330

editor: Maria G. Castro, Universidade da Califórnia, Los Angeles, e Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de março de 2011; Aceito: 20 de abril de 2011; Publicado em: 27 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Huynh et al. . Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Conceder um apoio : NIH /NCI R01-CA123547 (https://www.nih.gov/, https://www.cancer.gov/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Ratos têm sido utilizados como modelos de câncer há mais de um século, proporcionando avanços significativos em nossa compreensão desta família multifacetada de doenças. Atualmente, existem quatro principais áreas de investigação sobre o cancro que utilizam modelos de ratos: biologia básica e fisiologia, terapêutica experimental, prevenção e genética de susceptibilidade e risco. Estes modelos têm provado ser útil na validação da função dos genes, caracterização de genes do cancro novos e biomarcadores tumorais, ganhando uma visão sobre os mecanismos moleculares e celulares subjacentes iniciação do tumor e os processos de vários estágios de tumorigênese, e proporcionando melhores modelos clínicos em que para testar romance terapêutica estratégias [1]. Em particular, os modelos de xenoenxerto de tumor de rato são comumente utilizados em estudos pré-clínicos. modelos de xenoenxerto de tumor humano são criados por injecção de células tumorais humanas cultivadas a partir de cultura em um rato ou pelo transplante de uma massa tumoral humano num ratinho. O xenotransplante pode ser prontamente aceito por ratos imunocomprometidos, tais como ratinhos nus atímicos ou imunodeficientes severamente comprometida (SCID) [2]. Existem várias vantagens principais da utilização de xenoenxertos de tumores humanos: eles possuem a complexidade de anormalidades genéticas e epigenética que existem na população tumoral humano; pode ser utilizada para auxiliar no desenvolvimento de abordagens terapêuticas moleculares individualizados; e podem ser implantados ortotopicamente para reproduzir o ambiente órgão em que o tumor cresce, de modo que o efeito do tumor no seu microambiente pode ser modulada [3].

Os dois principais tipos de modelos de murganho de xenoenxerto humanos utilizados para pesquisa de cancro, heterotópica e ortotópica são definidos pela localização do xenoenxerto implantado. Para os modelos subcutâneos heterotópicos, o xenotransplante é implantado entre a derme e músculo subjacente e geralmente está localizado na lateral, na parte traseira ou a pata do rato. Há mais de 30 anos, o modelo de xenoenxerto subcutâneo tem sido o modelo do rato pré-clínico mais utilizado para a investigação do cancro, porque é rápido, barato, facilmente reprodutível, e tem sido considerado suficientemente pré-clínico para testar drogas anti-câncer. O modelo subcutâneo também tem as vantagens de fornecer uma confirmação visual de que os ratinhos usados ​​num estudo tem tumores antes da terapia; e proporcionando um meio de avaliar a resposta do tumor ou crescimento ao longo do tempo, em comparação com modelos em que a sobrevivência dos animais intracavitária é a única medida de resposta [4]. No entanto, as principais desvantagens da utilização de pré-clínico de xenoenxertos subcutâneos modelos tornaram-se evidentes. Tem sido observado de forma consistente que os regimes de drogas que são curativa em modelos de xenoenxerto subcutâneo do rato muitas vezes não têm um efeito significativo sobre a doença humana. A causa primária desta falha pode ser devido à observação de que o microambiente subcutânea não é relevante para que o local de órgão de doença primário ou metastático. Para além disso, modelos de tumores subcutâneos raramente formar metástases. Estas observações sugerem que os modelos de tumor heterotópicos que não representam os locais apropriados para tumores humanos não são preditivos quando usado para testar as respostas às drogas anti-câncer [5].

Para corrigir as deficiências dos modelos subcutâneos, xenoenxertos de tumores ortotópicos são cada vez mais explorados para aumentar a relevância clínica. Neste modelo, o xenoenxerto de tumor ou é implantado ou injectado no órgão equivalente a partir do qual o cancro originado, ou onde metástases são encontrados em pacientes. Vantagens dos modelos ortotópicos incluem o uso do local relevante para interacções tumor-hospedeiro, o aparecimento de metástases de doença relevante, a capacidade para estudar a dependência do local específico da terapia, a expressão específica de órgão de genes e que os cenários clínicos podem ser replicadas, por exemplo, a remoção cirúrgica do tumor primário, ou terapia adjuvante de metástases ocultas [5]. As principais desvantagens são que ortotópico geração de xenoenxerto de tumor é um trabalho intensivo, tecnicamente difícil, dispendioso, requerendo mais tempo de cura e de recuperação e que o volume de monitorização do tumor requer métodos de imagem relativamente menor rendimento em comparação com a utilização de pinças de [5]. No entanto, modelos de tumores ortotópicos estão emergindo como a preferência para pesquisa de câncer devido ao aumento da relevância clínica.

Há uma forte necessidade de desenvolver modelos melhorados para a investigação pré-clínica de câncer pancreático. Estima-se que 43.140 pessoas (21,370 homens e 21,770 mulheres) serão diagnosticados com câncer de pâncreas em 2010, e que 36.800 homens e mulheres morrerão desta doença [6]. O prognóstico é ruim, com menos de 5% de sobrevivência de cinco anos após o diagnóstico, e remissão completa é rara. Não há métodos eficazes de detecção precoce têm sido desenvolvidos e progresso no desenvolvimento do tratamento e terapia está estagnada. A gemcitabina foi a quimioterapia padrão por mais de uma década. No entanto, o benefício do tratamento com gemcitabina como agente único no câncer de pâncreas avançado e metastático é pequena [7]. O uso de modelos de xenotransplante ortotópicos para pesquisa de câncer pancreático pré-clínico pode melhorar o desenvolvimento de terapias e as modalidades de diagnóstico por imagem contra esta doença.

Neste estudo, foi investigada a viabilidade do desenvolvimento de modelos pancreáticos humanos ortotópicos de xenotransplante de cancro usando o ultra-som guiada injecção (USGI) das células tumorais. mouse modelos de xenotransplante tumoral ortotópicos de cancro pancreático têm sido bem estabelecida há muitos anos. No entanto, estes modelos requerem o implante cirúrgico altamente invasivo ortotópica (SOI) de células de tumor ou pedaços para o pâncreas. Este procedimento pode resultar em trauma significativo, o que requer tempo de recuperação pós-operatório, e podem conduzir a eventos adversos, tais como infecção, hemorragia, a adesão do tumor para outros órgãos, e outros efeitos do stress cirúrgico, por exemplo cicatrização de feridas.

avanços recentes têm permitido o desenvolvimento de métodos guiada por imagem para injecção ortotópico de células ou tecido em órgãos internos, potencialmente eliminar a necessidade de procedimentos cirúrgicos altamente invasivas. Em particular, minimamente invasiva de ultra-sons em tempo real da injecção guiada (USGI) de células tumorais pode ser realizada para criar modelos de xenoenxerto ortotópicos. USGI de células tumorais tornou-se um método aceitável para o desenvolvimento de modelos de carcinoma hepatocelular ortotópicos. Por exemplo, um modelo de resistência multi-droga foi estabelecida com sucesso em ratinhos nus por meio de implante ortotópico de células de carcinoma hepatocelular humano multi-resistentes dirigido por ultrassonografia [8]. Nós temos desenvolvido com sucesso um novo modelo de xenotransplante ortotópico de metástase linfática, onde os números precisos de células tumorais foram injetadas nos linfonodos axilares usando a orientação de imagem de ultra-som [9].

Um modelo murino ortotópico singênico pancreático rato câncer foi desenvolvido pela injecção de células de adenocarcinoma ductal pancreático murinos, Pan02, em ou perto do pâncreas de ratinhos C57BL /6 de ultra-som usando a orientação SonoCT [10]. O método de ultra-sons foi guiado concluiu ser favorável em comparação com o modelo subcutâneo para a investigação da influência da imunoterapia no crescimento do tumor [10]. No entanto, os tumores resultantes deste estudo apareceu a ser amplamente disseminada por toda a cavidade abdominal e não isolado apenas ao pâncreas, e não era claro se isso foi resultado de metástase, ou possivelmente células sendo liberado na área circundante durante o procedimento.

o nosso estudo é o primeiro a relatar a injeção ortotópico de células cancerosas pancreáticas humanas diretamente no pâncreas de ratos imunocomprometidos por orientação de ultra-som-imagem. Temos totalmente caracterizado o tumor ter taxas relativas ao modelo cirúrgico e ter confirmado por histologia que os tumores foram inicialmente isolados para o pâncreas, seguido por metástase subsequente na cavidade peritoneal em semanas mais tarde. Além disso, nós demonstramos que um agente de imagiologia molecular alvo pode ser especificamente entregue através da vasculatura para os tumores resultantes no pâncreas.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos procedimentos estavam em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de laboratório de Recursos animais (1996), National Research Council, e aprovado pelo Institutional animal Care e do Comitê Use, University of South Florida sob o protocolo aprovado R3715. ratinhos imunocomprometidos estão alojados em uma instalação limpa com condições especiais que incluem HEPA filtrada sistemas de gaiolas ventiladas, roupas de cama autoclavado, autoclavado habitação, água esterilizada, alimentos irradiados e da gaiola especial procedimentos de mudança. Os ratos são tratados sob condições assépticas, incluindo o uso de luvas, batas e revestimentos de sapato.

Cultura celular

MiaPaCa-2 (ATCC CRL-1420), células SU86.86 (ATCC CRL- 1837), e as células parentais HCT116 (ATCC CCL-247) foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA). As células HCT116 /+ δOR de cancro do cólon foram geneticamente modificados a partir da linha de células HCT116 parental altamente sobre-expressam o receptor opióide-δ [11]. Expressão do δOR na superfície de HCT116 e HCT-116 /δOR + células foi caracterizado antes da injecção usando um

In vitro

ensaio de ligação de fluorescência resolvida no tempo [12]. células HCT116 /δOR +, e MiaPaCa-2 foram cultivadas em meio DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro de vitelo normal (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) e 1% de solução de penicilina /estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO). As células foram cultivadas SU86.86 em meio RPMI (Invitrogen) suplementado com FBS a 10% (Atlanta Biologicals). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO2.

cirúrgico ortotópico de cancro do pâncreas do rato Modelo de Xenoenxerto

Para comparação com a técnica USGI, 5 ratinhos nu /nu fêmea de 6-8 semanas de idade (Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN) foram submetidos a um método cirúrgico estabelecida para injecção ortotópico de células no pâncreas. Para este procedimento, os ratinhos foram anestesiados sob gás de isoflurano; a pele abdominal e músculo foram objecto de uma incisão ao lado da linha média e diretamente acima do pâncreas para permitir a visualização dos lóbulos pancreáticos; o pâncreas foi levemente retraído e posicionados para permitir a injecção directa de um bolus de 20 ul de 1 × 10

6 HCT116 /δOR + células /PBS utilizando uma seringa de 1 cc com uma agulha de calibre 30; entrega bem sucedida de células no pâncreas foi observada sob ampliação utilizando um microscópio de dissecação; o pâncreas foi colocado de volta no interior da cavidade abdominal; e ambas as camadas musculares e a pele fechada com cola cirúrgica. Após a recuperação da cirurgia, os ratos foram monitorados e pesados ​​diariamente.

Ecografia

O Visual Sonics Vevo 2100 Imagiologia Station foi usado para todos os ultra-sonografia. aquisições de imagens foram realizadas utilizando o pacote de medição abdominal reforçada no modo-B e configurações do modo 3-D. O estado fisiológico (ECG, respiração, pressão sanguínea e temperatura corporal) dos ratinhos foi monitorizada continuamente durante cada sessão de aquisição de imagem. Os ratos foram fotografadas antes de xeno tumor para estabelecer as imagens de linha de base e depois fotografada por semana até 4 semanas usando o ultra-som para monitorar o desenvolvimento dos ortotópicos xenoenxertos de cancro do pâncreas.

Fluorescência de imagem

Ratos tendo pancreático ortotópico xenoenxertos das células HCT116 /δOR + foram administrados 4,5 nmol /kg de peso corporal de DMT-Tic-Cy5 por injecção na veia da cauda. Dmt-Tic-Cy5 é uma afinidade elevada (3 nM Ki) sonda alvo peptidomimedic conjugado com corante fluorescente (Cy5), que foi utilizado para determinar a localização dos HCT116 células /δOR + por

in vivo

e

ex vivo

fluorescência de imagem [12]. Após a injecção, os ratinhos foram mantidos numa câmara escura especial e protegido da exposição à luz, tanto quanto possível para evitar a foto branqueamento do corante. Alfalfa livre de alimentos e roupas de cama gaiola especial foram usadas para minimizar a autofluorescência.

In vivo

e

ex vivo

fluorescência imagens foram obtidas usando a Série Caliper Life Sciences Xenogen IVIS 200 imaging System. Foi utilizada a excitação de 615-665 nm e 695-770 nm filtros de emissão. Tempos de aquisição variou de 0 s a 10 s para manter contagens de intensidade dentro da gama de 15.000 a 60.000 para evitar a saturação. Antes da análise dos dados, foram realizadas instrumento subtrações fundo. Imagem 3.2 vivendo Software foi usada para desenhar as regiões de interesse (ROI) nos tumores para determinar o sinal de fluorescência média (unidades de eficiência). unidades de eficiência são calculadas através da normalização imagens de emissão de fluorescência para as variações na distribuição de luz incidente de excitação no palco. A autofluorescência fundo foi subtraída por determinação do sinal de fluorescência médio do tumor antes da injecção.

Histologia dos xenoenxertos do pâncreas

O pâncreas dos ratos foram colhidas, visualmente inspeccionadas, fixadas em tampão de formalina a 10%, processadas , incorporado, tri-seccionados, H e coradas e analisadas por um patologista para a presença de tumores

Estatísticas

os dados são representados como média ± SD. e teste t de Student foi utilizado para determinar a significância.

Resultados

O desenvolvimento do cancro da Xenoenxerto Modelo rato ortotópico de pâncreas humano utilizando USGI

O modelo do rato do cancro pancreático humano ortotópico foi desenvolvido usando ratinhos nus atímicos fêmeas de 6-8 semanas de idade. Os ratinhos foram anestesiados utilizando 3% de isoflurano gás através da câmara de indução e, em seguida, fixado em decúbito dorsal sobre a plataforma ultra-sons com um cone de nariz para a manutenção da anestesia em 1,5 a 2%. A plataforma ultra-som é posicionado para ter o lado do pâncreas do corpo para o suporte de agulha mecânica. O ultra-som de gel foi aplicada ao abdómen e do pâncreas localizadas ajustando mecanicamente o posicionamento do transdutor de ultra-sons, com o baço como uma referência. A imagem pré-digitalizada de rato região abdominal foi realizada utilizando o recurso de aquisição de imagem modo 3D antes de xeno para estabelecer uma linha de base para a análise comparativa. Um mL de seringa de 0,5, com uma agulha de 30 g foi colocado no suporte de seringa mecânica e alinhados em paralelo com a sonda e perpendicular ao corpo. A agulha da seringa foi, então, devidamente alinhados e avançado para dentro do pâncreas, utilizando a funcionalidade de sobreposição de guia da agulha que permite a visualização do alinhamento da agulha e de injecção alvo no monitor EUA. Um bolus de 20 ul de 1 × 10

6 células tumorais em suspensão em PBS foi injectada directamente no pâncreas através do recurso a micro-injecção de precisão guiada por imagem automatizado. Uma técnica de injecção optimizados foi utilizado, no qual o volume de injecção foi diminuída de um volume inicial de 50 mL para 20 mL. Em vez de imediatamente retrair a agulha, uma pausa de 5 segundos após a injecção das células com uma retirada lenta, deliberada da agulha permitido para a entrega completa de células no pâncreas. A técnica optimizada impedido complicações da injecção, tais como células de recuo através do canal de injecção ou vazamento de células fora do pâncreas para a cavidade peritoneal. A Figura 1 mostra a ultra-sons em tempo real as imagens adquiridas da USGI de 1 × 10

6 HCT116 /δOR + células em um bolus de 20 ul em pâncreas de rato. Uma vez que uma injecção foi completada, a anestesia foi descontinuada e o rato foi devolvido à caixa original e observado até capaz de movimento intencional. O estado fisiológico (frequência cardíaca, temperatura corporal, ECG e taxa de respiração) dos ratos foi monitorada durante todo o processo usando Unidade de Monitoramento Avançado fisiológicas do Vevo. Seguindo USGI xeno, os ratos foram monitorados e pesados ​​diariamente para identificar quaisquer sinais de stress ou trauma devido ao procedimento e ou tumor fardo, e não foi observada perda de peso significativa ou outro trauma.

A) Mostra o medidor 30 agulha no pâncreas do rato pré-injecção. B) Mostra a injecção de um bolus de 20 mL de células tumorais no pâncreas mouse.

O HCT116 /δOR + modelo foi escolhido porque temos desenvolvido uma sonda altamente específico imagiologia molecular (DMT-Tic-Cy5 ) para a detecção de células que expressam o receptor δ-opióide humana e já usou esta sonda para o

in vivo

e

ex vivo

detecção específica de HCT116 /δOR + células por imagens de fluorescência [12] . Apesar de não ser ortotópico, a utilização desta linha também é relevante porque o cancro colorectal é conhecida por formar metástases no pâncreas [13].

Inicialmente ratinhos portadores de xenoenxertos ortotópicos de HCT116 /δOR + semanal via SOI e USGI foram fotografadas por ultra-som para até 4 semanas para controlar o crescimento do tumor. O recurso de aquisição de imagem de modo 3D foi utilizado, no qual um motor 3D traduz o transdutor Microscan através do abdômen para obter várias fatias 2D que são montados e prestados pelo software Vevo em um conjunto de dados 3D conjunto de estruturas anatômicas do pâncreas e outros órgãos abdominais. A Figura 2 mostra as imagens de ultra-som de rato pancreata xenoenxertos tumorais rolamento adquiridos no tempo 0 (antes da injecção das células), 1 semana e 2 semanas pós-USGI SOI e de células. Após 3 a 4 semanas, os ratinhos tinham tumores muito grandes com abdómens distendidos inchadas, e nestes pontos de tempo posteriores, alguns animais tinham metástases em diferentes regiões da cavidade abdominal, por exemplo, o trato GI, fígado e pulmões.

A) pâncreas de rato normal, B) 1 semana de pós-USGI, C) 2 semanas pós-USGI, D) uma semana de pós-SOI, e E) 2 semanas pós-SOI.

para demonstrar a viabilidade do desenvolvimento de um modelo pancreático ortotópico por USGI que é comparável aos métodos SOI, 5 ratinhos cada foram submetidos USGI ou SOI de 1 × 10

6 HCT116 /δOR + células no pâncreas. O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente e quantificado por imagens ultra-sónicas. Após 2 semanas, grandes tumores de xenoenxerto pancreáticos foram observadas em todos os 10 ratinhos por imagens ultra-sónicas (Figura 3). as medições de volume 3D foram quantificados usando a função de volume 3D-modo, em que os volumes são criados por desenho contornos em torno do tumor em cada 10 fatias da série de imagens para criar um volume de tumor em 3D e uma imagem. A Figura 3 mostra imagens de ultra-som 3D representativos da USGI (3A) e SOI (3D) modelos de xenotransplante de rato 2 semanas após a injecção de células tumorais. A média de volume de tumor (n = 5) para os modelos USGI e SOI foram plotados ao longo do tempo na Figura 4 e estão registados na Tabela 1. Os ratos foram então administrados 4,5 nmol sonda /kg DMT-Tic-Cy5 através de injecção na veia da cauda.

In vivo

fluorescência imagens foram adquiridas 24 h mais tarde, o que proporcionou o máximo contraste. O

In vivo

fluorescência imagens na Figura 3 mostraram absorção da sonda fluorescente na área do pâncreas de ambos os modelos de ratinho, indicando a presença de células HCT116 /δOR + tumorais. O sinal

In vivo

fluorescência média (n = 5) foi 2 vezes mais elevada para SOI em comparação com o modelo USGI, p 0,002 (Figura 5). Baseado em

in vivo

ultra-som e de fluorescência de imagem, a taxa de absorção foi de 100% para ambos os modelos, enquanto o uso de células HCT116 /δOR + tumorais.

O azul área sombreada representa o tumor gerado através da realização de tumor 3D medições de volume. A) imagem de ultra-som de modelo USGI, B)

in vivo

imagem de fluorescência de modelo USGI, C)

ex vivo

fluorescência imagem do pâncreas do rato a partir do modelo USGI, D) de imagem de ultra-som modelo SOI, e)

in vivo

imagem de fluorescência de modelo SOI, e F)

ex vivo

fluorescência imagem do pâncreas mouse a partir do modelo de SOI.

Para determinar se USGI pode ser utilizado com linhas de células de cancro pancreático humano, cinco ratinhos foram submetidos a USGI de 2 × 10

6 MiaPaCa-2 em células de um bolus de 20 mL e mais 5 ratinhos foram submetidos a USGI de 2 × 10

6 SU86.86 células. Depois de 2 semanas, todos os ratinhos tinham xenoenxertos de tumor pancreático ortotópicos observados por ultra-sonografia e inspecção visual (Figura 6). A média de volume de tumor (n = 5) foram representados graficamente ao longo do tempo para os tumores pancreáticos humanos MiaPaCa-2 e Su86.86 (Figura 7) e registada na Tabela 1. Com base em

In vivo

imagiologia de ultra-sons, o xenoenxerto ortotópico índice de pega foi de 100%, enquanto que com as duas linhas celulares de cancro pancreático humano, MiaPaCa-2 e Su86.86.

o azul área sombreada representa o tumor gerado através da realização de medições de volume de tumor em 3D.

Validação pelo Ex vivo fluorescência de imagem e Histologia

imediatamente após

in vivo

fluorescência de imagem, a HCT116 /δOR + tumor xeongraft rolamento camundongos foram humanamente eutanasiados, visualmente examinados para a presença de tumores em outras partes do corpo, e os principais órgãos (coração, pulmão, rins, fígado, baço, pâncreas, trato GI) removido e

ex vivo

fluorescência imagens adquiridas 24 h após a administração da sonda fluorescente alvo. O

ex vivo

fluorescência média (n = 5) adquiridos a partir de pâncreas de ambos os modelos foi relativamente o mesmo (Figura 5). Conforme determinado pela

ex vivo

de imagem, a sonda de fluorescência específica estava presente em 100% do pâncreas do rato (n = 5) para ambos os modelos, e um baixo nível de fluorescência foi observada nos rins (Figura 8).

por histologia, foram observados tumores em 100% dos pancreata que sofreu USGI ou SOI usando HCT116 células /δOR +. Os tumores foram observados em apenas 4 dos 5 (80%) do pâncreas injectados com MiaPaCa-2 ou SU86.86 células, mesmo que a taxa de absorção foi de 100% com base na imagiologia dos EUA. A histologia destas pancreata única foi preparado a partir de 3 secções que foram de 50 uM para além, por isso, é provável que os tumores foram perdidas durante o corte. A Figura 9 mostra representativa H E de coloração de pâncreas de rato contendo xenoenxertos de tumores de todos os três linhas de células. Para xenotransplantes de HCT 116 /δOR + de células, a percentagem média (n = 5) de tecido maligno em relação ao tecido afectada encontrado numa única secção do pâncreas foi de 76 ± 15% para o método SOI e 62 ± 13% para USGI (Tabela 2) . Cada xenoenxerto foi histologicamente classificados por tipo de malignidade e quer dizer percentagem marcados (n = 5) para SOI e USGI respectivamente: 84% ± 9, e 85% ± 9 celular, 12% ± 5 e 11% ± 6 estromal, e 4% ± 4 e 4% ± 3 necrótica (Tabela 2).

a visão de ampliação 20X mostra pâncreas normal (indicado por setas pretas) adjacente para as células tumorais (indicado por setas vermelhas).

Discussão

Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relato da xeno ortotópico de células cancerosas pancreáticas humanas por USGI no pâncreas mouse. Neste estudo, foi demonstrado que este método é viável USGI, reprodutível, fácil, minimamente invasiva e melhorada em comparação com o método SOI altamente invasivo para o estabelecimento de modelos ortotópicos pancreáticas adequados para aplicações de imagem molecular. USGI é uma melhoria em relação ao método SOI para a imagem latente porque a parte invasiva do procedimento leva apenas 30 segundos versus 5 minutos e com uma recuperação mais curto e tempo de cura. A ferida cirúrgica ainda estava presente no momento da imagem de fluorescência de 2 semanas mais tarde com o método SOI, enquanto o USGI ferida prick não visível era depois de 1 dia. A presença da ferida cirúrgica alteradas as propriedades autofluorescência da pele e pode, assim, diminuir os estudos de imagem de qualidade de fluorescência.

A ultra-sonografia foi usado para controlar a injeção de células tumorais

in vivo

. A visualização em tempo real das injecções de células permitido para a optimização do processo de injecção. Em experiências iniciais, observou-se células derramando-se de fora do pâncreas para dentro da cavidade peritoneal durante um bolus de 50 ul de células de tumor foi injectado directamente para o pâncreas, tanto pelo método USGI e SOI. Este volume foi escolhido porque era inicialmente o volume utilizado no modelo ortotópico pancreático singeneicos desenvolvido por Schneider et ai, em que se observou metástases abdominais na maioria dos casos [10]. Observou-se também metástases abdominais em ratos que receberam um bolus de 50 mL e suspeitar que estas metástases pode ser devido à dispersão de células. Observou-se também o recuo das células através do canal de injecção, quando a agulha foi removida a partir do pâncreas demasiado rapidamente, o que resultou em 3 ratinhos desenvolver um pequeno tumor subcutâneo no local da injecção. Portanto, o volume de injecção optimizada para 20 uL e o método de injecção para evitar o derramamento e recuo das células para fora do pâncreas.

As experiências iniciais determinaram que xenoenxertos pancreáticas ortotópicos de células HCT116 /δOR + exibem difusão peritoneal após 3 a 4 semanas, o que foi relatado por outros, bem [14], [15], [16]. Neste período de tempo, observamos as metástases para o peritônio, fígado e pulmões. Metástases não foram detectados a 2 semanas. Outros têm observado metástase significativa para o peritoneu, fígado, pulmões e nódulos linfáticos após a injecção ortotópico cirúrgica de células tumorais para o pâncreas [17]. Isto sugere que os xenoenxertos de cancro pancreático utilizando células HCT116 /δOR + são semelhantes aos xenoenxertos de células de cancro pancreático. Desde que foram investigar a viabilidade de USGI determinando xenotransplante tumoral índice de pega e não metástase, optou-se por realizar o resto do estudo utilizando camundongos com 2 semanas de idade xenoenxertos de cancro do pâncreas ortotópicos.

O ultra-som e fluorescência de imagem foram utilizados para identificar a localização de tumores e para monitorizar o progresso do crescimento do tumor

in vivo

. Embora HCT116 células /δOR + são células de câncer colorretal humanos, eles são relevantes para os modelos de xenotransplante pancreáticas porque eles são conhecidos para formar metástases ocultas no pâncreas [13]. Além disso, eles podem ser rastreados com uma sonda imagiologia molecular que tinham desenvolvido anteriormente, a sonda fluorescente peptidomimético (DMT-Tic-Cy5) que tem como alvo especificamente o receptor δ-opióide expresso na superfície desta linhagem de células tumorais com o sub afinidade nM de [12 ].

O sucesso na geração de tumores de xenoenxerto pancreáticas ortotópicos usando USGI foi comparável aos nossos métodos SOI usando HCT116 células /δOR +. Com base em imagens de ultra-som,

in vivo

e

ex vivo

fluorescência de imagem e análise histológica, o xenotransplante tomar taxa foi de 100% para ambos USGI e SOI usando HCT116 células /δOR +. Para ambos os modelos, houve uma forte correlação na formação de tumores observados usando tanto ultra-sonografia e fluorescência. Snyder et al., Também relataram que as modalidades de imagem de fluorescência e de ultra-som são abordagens complementares para monitorar a progressão do tumor e resposta ao tratamento em estudos pré-clínicos usando modelos do rato ortotópico de câncer pancreático humano [18]. Os volumes de tumor de xenoenxerto para SOI e USGI eram comparáveis ​​em ambos os 1 e 2 semanas após a implantação. sinal de fluorescência média No entanto, a quantificados (n = 5) adquirido a partir de

In vivo

imagiologia do modelo SOI foi duas vezes mais elevada em melhoria em comparação com o modelo USGI enquanto não houve diferença significativa na quantificada

ex vivo

sinais. O aumento

In vivo

fluorescência gerada a partir do sinal de modelos SOI em relação ao

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sinal pode ser devido a complicações cirúrgicas, tais como o trauma do tecido nesta região causando a cicatrização de feridas. A ferida no local da injecção cirúrgica ainda estava presente no momento da imagem de fluorescência, o que pode ter aumentado propriedades fluorescentes em relação ao tecido afectado. Independentemente disso,

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fluorescência de imagem do modelo USGI foi superior ao SOI, como o quantificado

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sinal foi equivalente ao

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sinal obtido a partir do pâncreas . No ponto 24 h de tempo após a injecção da sonda fluorescente alvo, observou-se um baixo nível de fluorescência nos rins, o baço, o coração e os pulmões. No entanto, a SOI modelo tiveram um aumento significativo do sinal, p 0,002, em comparação com estes tecidos USGI. Isto é possivelmente devido ao aumento da metástase a partir de xenoenxertos gerados pelo IOS em relação ao USGI ao mesmo após a injecção ponto de tempo de células (2 semanas). Com base no valor médio de malignidade em relação ao tecido normal, pâncreas conforme determinado pelo patologista (Tabela 1), os 2 tipos de métodos produziram quase iguais de malignidade; com uma média de 85% de necrose componentes celulares, 11% e 4% do estroma. Por isso, nós demonstramos que xeno tumor pancreático ortotópico por USGI é viável e comparável aos resultados obtidos em SOI.

Desde as fases iniciais do estudo utilizou células de câncer colorretal, duas linhas de células pancreáticas humanas, MiaPaCa-2 e