Sumário

Nossos estudos anteriores demonstraram que PMS1077, um antagonista do fator ativador de plaquetas (PAF), poderia induzir a apoptose de células Raji. No entanto, ainda não tenha sido determinado o mecanismo de acção. O factor-kappa de transcrição nuclear B (NF-kB) via de sinalização desempenha um papel crítico na sobrevivência de células de tumor, proliferação, invasão, metástase e angiogénese, portanto, determinou os efeitos do PMS1077 e os seus análogos estruturais no factor de necrose tumoral-α ( TNF-α) induzida por activação de sinalização de NF-kB. Neste estudo, verificou-se que PMS1077 inibido o TNF-α expressão induzida do gene repórter regulamentado NF-kB de uma forma dependente da dose. ensaio Western blot indicou que PMS1077 suprimido do inibidor de TNF induzida-α de kB-α (IkB-α) fosforilação, a degradação de IkB-α, e fosforilação de p65. PMS1077 consistentemente bloqueado TNF-α induzida translocação nuclear de p65 tal como demonstrado no ensaio de imunofluorescência utilizado. estudos de docking por modelagem molecular previu que PMS1077 pode interagir diretamente com a quinase-β IkB (IKK-β) subunidade. Estes resultados sugeriram que PMS1077 pode suprimir a activação de NF-kB por segmentação IKK-β envolvida na via de sinalização de NF-kB. Finalmente, mostrámos que PMS1077 células para o TNF-α apoptose induzida sensibilizados por suprimir a expressão de NF-kB de genes anti-apoptóticos regulamentados. Os nossos resultados revelam uma nova função de PMS1077 no NF-kB via de sinalização e implica que PMS1077 pode ser considerado como um composto anti-tumoral de chumbo

citação:. Shi J, Chen J, Serradji N, Xu X, Zhou H, Y Ma, et al. (2013) PMS1077 sensibiliza TNF-α induzida apoptose em células cancerosas humanas da próstata por Bloqueio de NF-kB via de sinalização. PLoS ONE 8 (4): e61132. doi: 10.1371 /journal.pone.0061132

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 17 de outubro de 2012; Aceito: 05 de março de 2013; Publicação: 09 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Shi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelos Projetos Chun Hui (número Z2009-1-62001, https://www.moe.edu.cn) do Ministério da Educação da China e, em parte, pelos projectos de apoio de Ciência e Tecnologia da província de Gansu (número 1104FKCA123, https://www.gsstc.gov.cn), China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nos últimos anos, se a síntese de um certo número de derivados de piperazina que mostrou potente dupla anti-PAF e actividades anti-HIV-1 [1], [2], [3], [4]. Apesar de melhorar ainda mais estas propriedades e tendo em conta a flexibilidade destes compostos, que também foram acoplados para estudar os efeitos potenciais destes compostos em outras condições patológicas, tais como a inflamação e génese tumoral. O nosso trabalho anterior demonstrou que PMS1077 poderia induzir a apoptose de células de Raji, mas o mecanismo de acção permanece pouco claro [5].

Por causa do papel crucial de produtos do gene regulado de NF-kB na proliferação celular, sobrevivência, invasão, metástase e angiogénese [6], [7], [8], nós concluímos que PMS1077 pode mediar a apoptose das células cancerosas através da modulação da cascata de sinalização de NF-kB. A família NF-kB é essencialmente composto por cinco proteínas, incluindo Rel-A (p65), Rel-B, C-Rel, p50, e p52 [9]. O típico de mamífero de NF-kB é constituído por um heterodímero p50 /p65. Em células não estimuladas, o NF-kB liga-se a proteínas de inibidor kB e é sequestrado no citoplasma como um complexo inactivo. Após estimulação por exemplo por TNF-α, a cascata de sinalização conduz à activação do complexo da cinase IkB, o que resulta na fosforilação, ubiquitinação e degradação de IkB pelo proteassoma 26S [9], [10]. Em seguida, o heterodímero libertado NF-kB transloca-se rapidamente para o núcleo, onde se liga ao local kB e induz a transcrição de uma grande variedade de genes alvo envolvidas no desenvolvimento e progressão [8] do cancro, [11].

no presente estudo, a hipótese de que PMS1077 podem modular a via de ativação de NF-kB. Para testar esta hipótese, foram determinados os efeitos de PMS1077 e os seus análogos estruturais sobre a activação de NF-kB induzida pelo TNF-α-. Os nossos resultados mostraram que PMS1077 pode inibir o TNF-α degradação de IkB induzida-α, fosforilação de IkB-α, fosforilação de p65, p65 e a translocação nuclear. estudos de ancoragem por modelagem molecular previsto que PMS1077 pode suprimir a activação de NF-kB através da interacção directa com IKK-β. Além disso, também foi encontrada PMS1077 para suprimir a expressão induzida por TNF-α de NF-kB de genes regulados anti-apoptóticos, levando a sensibilização de TNF-α apoptose induzida em células de tumor. Desta forma, os dados deste estudo avançado nossa compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade anticâncer de PMS1077, e pode nos ajudar a otimizar ainda mais suas propriedades para o desenvolvimento potencial da droga.

Materiais e Métodos

cultura celular e reagentes

HEK293T (rim embrionário humano), células DU145 (cancro da próstata humana) e PC3 (cancro da próstata humano) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection. As células foram cultivadas em DMEM (de Eagle modificado por meio de Dulbecco) suplementado com 10% de FBS (soro fetal bovino), 100 unidades /mL de penicilina, e 100 mg /ml de estreptomicina e incubou-se a 37 ° C num CO 5%

2 incubadora . PMS1077 e os seus análogos estruturais foram sintetizados como descrito anteriormente [4]. Esses análogos foram dissolvidos em DMSO para produzir uma /L solução de 50 mmol de experiências in vitro. TPCA-1 (um inibidor específico de NF-kB) foi adquirido a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, E.U.A.). Os anticorpos contra a P-p65, p65, P-IkB-α, IkB-α, Bcl-xL, Bcl-2, survivina e PARP foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. TNF-α foi adquirido a partir de Pepro Tech. GenEscort ™ Transfection Reagent foi comprado de Wisegen Biotechnology Corporation (Nanjing, China).

transfecção e repórter luciferase ensaio

DU145 e células PC3 foram semeadas em placas de cultura de tecidos de 60 mm, respectivamente. Dependente de NF-kB plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo (4 ×-kB pGL4.20) foi transfectado em células semeadas, utilizando o reagente de transfecção GenEscort ™ de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 h, as células foram seleccionadas e proliferaram em meio suplementado com 5? G /mL de puromicina até clones resistentes apareceu. Os dois clones foram validados com o nome DU145-NF-kB-Luc e PC3-NF-kB-Luc. High Throughput Screening para os compostos indicados foi realizada nestas linhas de células usando um-Glo Luciferase Assay System (Promega).

Para estudar a activação do NF-kB em células HEK293 por TNF-α, NF-kB-dependente Firefly luciferase repórter (4 ×-kB pGL4.20) foi transientemente co-transfectadas, juntamente com o plasmídeo de luciferase de Renilla (pGL4.74) em células HEK-293T linha usando um reagente de transfecção GenEscort ™ de acordo com as instruções do fabricante. Após o tratamento, as células foram lisadas com tampão de lise passiva (Promega) e a actividade da luciferase foi determinada utilizando um Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega) com uma Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesely, MA, E.U.A). a actividade de luciferase relativa foi expressa como uma razão de actividade de luciferase do pirilampo para Renilla actividade de luciferase. Os dados representam três experiências independentes realizadas em triplicado.

3- (4, 5-cimethylthiazol-2-il) -2, foi determinada 5-difenil tetrazólio (MTT)

A viabilidade celular utilizando o ensaio MTT. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços (1 × 10

4 células /cavidade), tratou-se com vários compostos a várias concentrações, e depois manteve-se em cultura durante mais de 12 ou 24 h. No final desse período, 20 ul de MTT (5 mg /mL) foi adicionada ao meio de cultura e incubou-se a 37 ° C durante 2 h. Em seguida, o meio foi removido. Os cristais de formazano insolúvel em água foram, em seguida, dissolvido em DMSO (100 ul /poço). A densidade óptica de cada poço foi medida com um Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, E.U.A.) a 570 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm. Para cada concentração testada, poços contendo todos os reagentes excepto para as células serviram como controlos. A sobrevivência celular é aqui descrito como percentagem relativa absorvância (A), tal como definido por (a

droga /Um

controlo × 100) (Ye et al., 2004).

análise de transferência de Western

transferência de Western de proteínas foi realizada como descrito em um dos nossos estudos anteriores [12]. Resumidamente, as células tratadas foram colhidas em tampão de lise RIPA contendo Tris-HCl 50 (pH 7,5), NaCl 150 mM, NP-40, 0,5% de DOC 1%, SDS a 0,1%, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, NaF 20 mM , 2 mM de ortovanadato de sódio e a Protease Inhibitor Cocktail (Roche). Após a lise, os lisados ​​foram centrifugados durante 10 min a 13000 g a 4 ° C. As amostras de proteína total (30-60 ug) foram transferidos para uma membrana de PVDF após separação electroforética em gel de poliacrilamida a 12% SDS. Após o bloqueio com leite magro a 5% em TBST (0,1%) durante 2 h à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas durante a noite com o anticorpo primário a 4 ° C e lavadas cinco vezes em TBST, depois incubados com peroxidase de rábano silvestre conjugado secundário anticorpos à temperatura ambiente durante 2 h. As membranas foram lavadas cinco vezes em TBST, e, em seguida, incubou-se com um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada ocidental (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, EUA) e exposto a filme de raios-X.

NF-kB /translocação nuclear p65 ensaio

análise imunocitoquímica de NF-kB translocação nuclear /p65 em células PC-3 foi realizada utilizando um celular de NF-kB translocação Kit (Beyotime Biotech) de acordo com as instruções do fabricante, como previamente descrito [13 ], [14]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a 4000 células /poço. 24 horas mais tarde, as células foram pré-tratadas com PMS1077 (50 uM) durante 2 h, seguido por tratamento com TNF-α 20 ng /ml durante 30 minutos. As células pré-tratadas com DMSO a 0,2% e 2