Abstract

O

CCS3

lócus no cromossomo mouse de 3 regula a susceptibilidade diferencial de A /J (A, suscetível) e C57BL /6J (B6, resistentes) linhagens de camundongos a-induzido quimicamente câncer colorretal (CRC). Aqui, nós relatamos o mapeamento de posição de alta resolução do gene subjacente à

CCS3

efeito. Pela correlação genótipo /fenótipo de uma série de 33 /estirpes de ratos ACB BCA recombinantes congénicos, bem como em grupos de populações de retrocruzamento rolamento cromossomas recombinantes exclusivos para o intervalo, e em estirpes subcongenic, temos delineado o tamanho máximo do

CCS3

intervalo físico para um segmento ~2.15 Mb. Este intervalo contém 12 transcrições anotados. Sequenciamento de candidatos posicionais em A e B6 identificou muitas mudanças de codificação quer de baixa prioridade ou variantes de codificação não proteicos. Encontramos uma cópia única variante número (CNV) no intron 15 do gene

NFKB1

. A CNV consiste de duas cópias de uma sequência de 54 pb adjacente ao local de splicing exão 15, enquanto apenas uma cópia é encontrado em CRC-susceptível A. A proteína NFKB1 (p105 /p50) expressão é muito reduzida em tumores em comparação com o normal Um epitélio do cólon, tal como analisada por imuno-histoquímica. Estudos em macrófagos primários de ratinhos B6 A e demonstrar uma activação diferencial acentuado da via de NFkB por lipopolissacárido (cinética da estimulação e máximos níveis de IκBα fosforilado), com uma activação mais robusto sendo associado com resistência a CRC. O NFkB tem sido implicado na regulação da homeostase e a resposta inflamatória na mucosa intestinal. O intervalo contém outro candidato posicional

Slc39a8

que é diferencialmente expressos em A vs dois pontos B6, e que foi recentemente associado a agressividade do tumor CRC em humanos

Citation:. Meunier C, Van Der Kraak G, C Turbide, Groulx N, Labouba I, Cingolani P, et al. (2013) posicional Mapeamento e Candidate Gene Análise do mouse

CCS3

Locus que regula a susceptibilidade diferencial para cancerígena induzida por câncer colorretal. PLoS ONE 8 (3): e58733. doi: 10.1371 /journal.pone.0058733

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de dezembro de 2012; Aceito: 05 de fevereiro de 2013; Publicação: 14 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Meunier et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação para PG e NB do Instituto Canadian Cancer Society Research [www.cancer.ca/Research.aspx], o Cancer Research Society Inc. [www.src-crs.ca/en-CA] eo Canderel Programa de iniciativa [www.deficanderel.com/3/donate.htm] do Cancer Research Centre Goodman [cancercentre.mcgill.ca/research/]. PG é um Professor James McGill de Bioquímica. CM recebeu apoio studentship e prêmios de viagem do Programa McGill Integrated Cancer Research Training (MICRTP) ea Fundação Quinlan Peter [www.mcgill.ca/gcc-research/funding/] através da Universidade Faculdade de Medicina McGill. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a patogénese do cancro colo-rectal (CRC) está associada com a acumulação sequencial de mutações em genes específicos, que provoca a progressão passo a passo a partir de lesões pré-neoplásicas ao adenocarcinoma completo soprado [1]. fases histopatológicos correlacionando com rearranjos moleculares somáticas são bem descrito [1], [2]. No entanto, só nos últimos anos e com o advento dos estudos de associação em todo o genoma tem o grau de complexidade de interacções entre os componentes genéticos e ambientais contribuem para a etiologia de cancro colo-rectal humano foram apreciados [3], [4], [5] , [6]

Por uma pequena proporção de casos de CRC ( 10%)., um determinante genético clara e altamente penetrante pode ser observado nas síndromes de cancro hereditário, mais importante polipose adenomatosa familiar (FAP), Lynch síndrome (hereditário não-polipose cancro do cólon) e alternadamente, doenças inflamatórias do intestino (IBD) -linked CRCs [7], [8]. Por outro lado, a maioria dos casos de CRC ( 90%) são esporádicas sem história familiar antes. A etiologia da CRC esporádica envolve interações bidirecionais entre um componente genético complexo, e os fatores ambientais mal definidas [3], [6]. Até à data, como muitos como 16-20 variantes de baixa penetrância comuns foram identificados em estudos de associação do genoma (GWAS) para esporádica CRC humana [9], [10]. Quase metade desses loci estão intimamente ligados ou alélicas com componentes da via de sinalização TGFß: SMAD7, GREM1, BMP2, BMP4, RHPN2 e LAMA5 ([11], [12], revisto em [13]). Por outro lado, tem sido proposto que até 170 tais loci podem contribuir para a susceptibilidade de CRC nos seres humanos [13].

de mais de 25% de todos os cancros são pensados ​​para ser associada com infecção crónica, inflamação ou outros tipos de resposta inflamatória [14]. inflamação crónica tem sido recentemente apreciado como um dos principais contribuintes para a etiologia de CRC nos seres humanos [15], [16], revisto em [13]. Assim, os pacientes que sofrem de doenças inflamatórias do intestino (DII) têm um risco muito maior de desenvolver (CA) CRC associado a colite, a extensão da manifestação colite correlacionando-se com a incidência de CA-CRC [17]. Além disso, não-esteróides anti-inflamatórios (AINEs) mostram um efeito protetor contra diferentes tipos de cânceres [18]. Curiosamente, vários componentes chave de vias de resposta imune Th17 e Th1 TGFp-mediadas recentemente foram identificados como loci de baixa penetrância associada com DII início, o que pode implicar TGFp sinalização em ambos IBD-ligadas, bem como CRCs esporádicos ([15], [ ,,,0],16], revisto em [19], [20]).

o rato representa um modelo experimental valiosa para dissecar o componente genético complexo de CRC humano. Mice estão disponíveis como estirpes puras fixados para homozigose para diferentes variantes alélicas que representam ampla diversidade genética em genes-chave e caminhos relevantes para CRC patogênese. Além disso, CRC pode ser induzida de uma forma reprodutível e bem controlada por mutagénios químicos tais como azoximetano (AOM) [21], [22]. Os tumores resultantes assemelham-se de perto a sua contraparte humana no que diz respeito à histopatologia (de focos de criptas aberrantes ao carcinoma

in situ

) e alterações genéticas subjacentes (mutações em

Apc

,

Kras

e

ß-catenina

) [23], [24]. linhagens produzidas rato apresentam diferenças marcantes na susceptibilidade ao agente cancerígeno induzida CRC e análises de ligação clássica em cruzamentos informativos ter localizado vários loci que regulam as diferenças inter-tensão na susceptibilidade [25], por exemplo,

Ccs1

[26],

Ssic1

[27], e

Ccs2

[28]. Estudos paralelos em cepas cong�icas derivados de BALB /Chea e STS /A sugeriu uma pluralidade de loci adicionais (

SCC1

para

Scc15

) resposta afetando a induzida por substância cancerígena CRC [29], [30 ]. Destes, a clonagem posicional do

SCC1s

lócus levou à identificação de

Ptprj

como gene causal, e rearranjos somáticas dentro do homólogo humano

PTPRJ

foram identificados em humanos CRC [31], [32].

no modelo de carcinogênese química AOM, C57BL /6J estirpe (B6) é resistente com alguns tumores CRC observou 18 semanas após o início do tratamento (tipicamente 0-5 tumores), enquanto A /J (A) são altamente suscetíveis com a multiplicidade de tumores variando entre 20-50 [33]. Em nosso laboratório, nós usamos um conjunto de linhas /ACB BCA recombinantes cong�icas rato (RCS) derivados de resistente CRC A B6 e CRC-suscetíveis a identificar os determinantes genéticos responsáveis ​​pela susceptibilidade diferencial dessas cepas para CRC-induzida OMA. As estirpes 13 ACB e 22 BCA foram obtidos por endogamia sistemática de uma dupla backcross (N3), e cada cepa contém uma pequena quantidade (12,5%) do DNA de um dos pais fixa como um conjunto de segmentos cong�icas discretos (mapeado por genotipagem) sobre o fundo (87,5%) do outro progenitor. Individuais locos de resistência /susceptibilidade contribuem para uma característica complexa pode segregar no RCS individuais e podem ser estudados isoladamente, facilitando estudos de identificação de genes. Isto levou ao mapeamento dos três loci (

CCS3

,

Ccs4

,

Ccs5

) regulação da resposta ao CRC-induzida AOM nestas estirpes [33], [34] , [35]. O

CCS3

lócus determina a susceptibilidade inicial para CRC-induzida AOM (aparecimento de adenomas), enquanto o

Ccs5

lócus modula a multiplicidade de tumores em animais portadores de alelos de susceptibilidade a

CCS3

[ ,,,0],34]. O

CCS3

lócus foi mapeado a um segmento de 14 Mb na porção central do cromossoma 3. Este intervalo contém 94 transcrições anotados, e vários destes genes que mostram a expressão robusta no cólon, ela própria regulada de uma estirpe específica moda.

no estudo atual, temos realizado análises genéticas na ACB /estirpes BCA e em cruzamentos deles derivados para estreitar ainda mais o tamanho do

CCS3

intervalo genética para 2,2 Mb. Temos caracterizado ainda mais os genes no intervalo de perfil de expressão e sequenciamento de DNA genômico.

Resultados

congênica recombinante Delineamento do intervalo CCS3 em AcB /BCA e AxB /BXA estirpes puras recombinantes

fenotipagem um subconjunto de 23 ACB /estirpes BCA para susceptibilidade a CRC-induzida AOM inicialmente mostrou que a susceptibilidade diferencial de a e linhagens de camundongos B6 para CRC é regulada por um único locus designado

CCS3

. Nestes estudos,

CCS3

foi mapeado a um segmento de 14 Mb na porção central do cromossoma 3 [33]. Para melhor delinear a

CCS3

intervalo de genética, nós fenotipada /estirpes adicionais ACB BCA (elevando o total para 33 cepas), bem como um subconjunto de AXB estirpes /BXA (AXB19, AXB24, BXA2, BXA8, BXA12 ), com algumas dessas estirpes que carregam haplótipos recombinantes informativos no

região CCS3

. Grupos de ratinhos foram tratados com uma dose semanal de injecção OMA durante 8 semanas, e 11 semanas mais tarde, os animais foram sacrificados, os dois pontos foram recolhidas e os tumores foram marcados. As cepas foram estratificados de acordo com o número de tumores detectados, tanto como baixo /intermediários (≤ 10 tumores) ou altas ( 15 tumores) [33]. Este padrão de distribuição bimodal estirpe foi então sobreposta a combinação de haplótipos conhecidos de A e alelos B6 para o cromossomo distal 3 (

CCS3

) nestas estirpes. Um resumo de todos os dados disponíveis a partir de AcB /BCA e AXB /BXA estirpes é mostrado na Figura 1A. Esta análise confirmou o papel crítico de

CCS3

alelos de susceptibilidade CRC traço, e estirpes adiante identificados AcB52 e AcB60 como transportando haplótipos recombinantes informativos que delineiam os limites da do locus nos lados proximal e distal, respectivamente. Para melhor delinear os pontos de quebra de recombinação nessas linhagens, desenvolvemos vários marcadores adicionais informativas (microssatélites e marcadores SNP) na região por sequenciação de DNA genômico de A e pais B6 (ver secção Materiais e Métodos). Utilizando estes marcadores, que delineada ainda mais os pontos de quebra de recombinação, no lado proximal (AcB52), entre os marcadores P3-17 (PST. 132,558 Mb) e P3-19 (PST. 132,562 Mb), e sobre o lado distal (AcB60) entre os marcadores D4-11 (PST. 136,18 Mb) e rs30215915 (PST. 136,20 Mb) (Fig. 1B). Estes estudos reduziu ainda mais o tamanho do intervalo física máxima do

CCS3

lócus para 3,64 Mb (P3-17 para rs30215915).

A. Cromossomo 3 haplótipos de estirpes ACB /BCA são exibidos juntamente com a sua resistência (branco) ou padrão de suscetibilidade (preto) para CRC-induzida AOM (tira de fundo). Os segmentos cromossómicos derivados de B6 são indicadas a cinzento (2), enquanto os haplótipos A são anotadas em branco (1). Setas (↓) indicam estirpes chave RCS delineando o intervalo mínimo cromossômica para o

CCS3

lócus. B. mapa de haplótipos detalhada do

CCS3

lócus, incluindo delineamento do proximais e distais limites de alta densidade SNP genotipagem nos principais cepas cong�icas informativos (AcB52, AcB60).

alta resolução de mapeamento de posição do locus CCS3 por testes prole de camundongos retrocruzamentos informativos

nestes estudos, produzimos (B6xA) animais F2, que foram genotipados para identificar recombinantes informativos dentro do

CCS3

intervalo , utilizando marcadores rs30055788 no lado proximal e rs30215915 no lado distai. Entre um conjunto de 240 animais F2 selecionados, foram identificados 3 recombinantes informativos que foram designados RecA, RecB e RECC. Cada recombinante foi, em seguida, retrocruzadas em progenitura tanto B6 e um fundo, e múltiplos de cruzamentos individuais foram, em seguida, genotipados para marcadores no intervalo e fenotipados para susceptibilidade a CRC (Fig. 2A, 2B). Nesta análise, a progênie de retrocruzamento entre o rato Rec indivíduo (A, B, C) e os pais ou A ou B6 exibida uma mistura de haplótipos recombinantes na região, com combinações de homozigose para A ou alelos B6 ou heterozigosidade para os alelos A /B (Fig. 2B). Em seguida, comparou o genótipo dos cromossomas recombinantes com o fenótipo de uma e retrocruzamentos B6 derivadas delas (Fig. 2a, 2b). controla um dos Pais números desenvolvidas alta tumorais (X = 45,5; A Fig. 2A) enquanto que os controlos B6 foram baixo (X = 1,0; p 0,0001). teste de progênie de RecB e RECC retrocruzado a B6 mostrou números tumorais agregados nestes ratos semelhantes aos controles B6, de acordo com a homozigose para haplótipos B6 na porção distal do

região CCS3

previamente definido. Por outro lado, testes progenitura de RecA e RecB atravessa a A mostraram um número de tumores nestes animais que não foram estatisticamente diferentes dos que os detectados em controla um parentais (embora RecB XA eram mais intermediário), de acordo com homozigotia para o alelo na porção distal de

CCS3

(Mb134.0-136.2). Finalmente, observou-se um terceiro grupo de animais que apresentavam a multiplicidade de tumores intermediário entre aquele dos dois extremos parentais (x = 8,5;

P

0,001 para ambas as comparações); estes incluíram RecA x B6 (genótipo BB proximal /AB distal; genótipo AB proximal /AB distal), RecB X B6 (proximal AB, AB distal), RecB XA (proximal AA /AB distal), e RECC XA (proximal AB, AB distal). Neste grupo de animais, houve uma forte correlação entre a multiplicidade de tumores intermediário e heterozigosidade para haplótipos A /B na porção distal do

CCS3

intervalo, de acordo com o padrão de co-dominante de herança de

CCS3

alelos que anteriormente relatados [33]. O efeito combinado de A /D, A /B e alelos B /B na porção distal do

CCS3

é mostrado na Figura 2C. Estas experiências reduziu ainda mais o tamanho do

CCS3

intervalo de ~2.15 Mb, como delineado no lado proximal por eventos de recombinação recíprocos em RecA e RecB (no rs31197594 e rs52356981 intervalo) e sobre o lado distai da recombinação caso em AcB60 (no intervalo de rs31197594 rs30215915) (a partir da Fig. 1).

. Após o tratamento AOM, dois pontos foram dissecados, fixo e o número de tumores foi marcado (ratos individuais mostrados como ‘•’). Controles e ratos retrocruzamentos correspondentes a recombinantes-chave (Rec A, B e Rec Rec C), onde criados para A /J (indicada A) e C57BL6 /J (indicado como B). Os ratos foram agrupados por haplótipo no

CCS3

lócus e animais recombinantes realizar um haplótipo diferente em cada metade do

CCS3

intervalo. Grupos que mostram os números de tumor estatisticamente forma diferente do grupo parental A são identificados (#). B. O

CCS3

haplótipo no cromossomo distal 3 de cada grupo de ratos fenotipados no painel (A) é mostrado em preto (B6), branco (A /J) ou listradas (heterozigotos). As linhas tracejadas mostram o intervalo identificado pela primeira vez em RCS (seta), bem como o intervalo genético reduzida para

CCS3

sugerido por um evento de recombinação em Rec Rec A e B entre os marcadores e rs31197594 rs52356981, no lado proximal (quadro ). A fronteira distai foi estimada a partir de estudos em estirpes congénicas recombinantes a partir de Figura 1B. C. Aggregate correlação genótipo /fenótipo de ratos backcross combinadas para o reduzido

CCS3 intervalo

(Mb134.0-136.2).

candidatos posicionais para o locus CCS3

O ~2.15 Mb

CCS3

intervalo contém 12 genes que codificam, um micro RNA (

Mir1895

), bem como vários RNAs não-codificantes longos (lincRNA) e um retroposon (Fig. 3A , e dados não mostrados). A sequência do segmento de 2,15 Mb foi comparado entre A e B6 usando sequências do genoma de referência disponíveis a partir da Wellcome Trust Sanger Institute [36], e uma lista completa de todas as variantes ex�icas, intrónicas e intergénicas é apresentado na Tabela S1. Não há SNPs que distinguem A e B6 em qualquer

Mir1895

(pst 133.903.469-133.903.547) nem no lincRNAs e retroposon encontrados em posições 134810372-134810477 (105 nt), 135.099.190-135.100.723 (1537 nt), 135158617 -135158847 (231 nt), 135.188.928-135.189.496 (569 nt), 135.390.302-135.391.702 (1401 nt), 135.626.423-135.626.782 (360 nt) nos conjuntos de dados ENSEMBL. Portanto, é pouco provável que estes ARN não codificantes são responsáveis ​​pela

CCS3

efeito, embora uma contribuição de tais RNAs não-codificantes pode ainda não ser formalmente excluída. Entre os 12 genes que codificam anotados no intervalo (

Cxxc4

,

Tacr3

,

CENPE

,

Bdh2

,

Nhedc2

,

Nhedc1

,

Cisd2

,

Ube2d3

,

Manba

,

NFKB1

,

Slc39a8

,

Bank1

), um número de variantes de nucleótidos distinguir a e B6 (Tabela 1; Tabela S1), com aminoácidos não-sinónimo único variantes encontradas em Manba (L844F) e Bank1 (A375M). Manosidase um beta (Manba) é uma enzima lisossómica, a inactivação do que faz com que o beta-manosidosis, uma doença de armazenamento lisossómico com um amplo espectro de envolvimento neurológico [37]. Assim, uma variante patológica neste gene é improvável que causam susceptibilidade a CRC. Por outro lado, a variante A375M em Bank1 (B andaime proteína celular com repetições de anquirina) é uma substituição conservativa que afecta um resíduo não conservado em parentes BANCO 1 (dados não mostrados), e, assim, é pouco provável que seja patológico.

A. O

CCS3

lócus contém 12 transcrições anotados, qual a posição, direção de transcrição (seta), e posição dos marcadores SNP de referência são mostrados. B. A posição dos produtos de amplificação de longo alcance utilizados para profunda sequenciação do

Nfκb1

é mostrado para escalar junto com a posição dos exons 25 codificação e não codificantes de

Nfκb1

. A posição da deleção intrónica 54 pb identificadas em A /J é mostrado. Ele corresponde à perda de um 54 pb da repetição directa, que está presente em duas cópias em B6 (sombreado a cinzento), o que é em si mesma composta por uma estrutura de 3 repetições (identificados por setas acima da sequência). A posição da cópia variante número em relação ao exão 15 do gene é mostrado, em conjunto com uma projecção 15 do exão na sequência traduzida estrutura proteica prevista. p50 previsto e porções IκBγ da proteína são apresentados, juntamente com o domínio Rel homologia (RHD), anquirina-unidades de repetição (ANK), domínio de morte (DEAD) e a região rica em glicina (G) separando p50 e p105 (chamados IκBγ).

Temos relatado anteriormente RNA transcrito profiling estudos, comparando a expressão de genes no

CCS3

interval tanto para a vs mucosa normal B6, e por vs. mucosa normal Os tumores dos murganhos Um [33]. Re-sequenciamento de todos os exons que codificam anotado e exão /íntron foi realizada para os genes que apresentam elevada expressão na mucosa do cólon normal (

Cisd2, Ube2d3

,

Nfκb1

e

Slc39a8

). Por causa de sua associação prévia com a homeostase do epitélio do cólon, e da resposta inflamatória

in situ

, o

gene de nossas ações Um rato Nfκb1

foi sequenciado na sua totalidade (130 kb). Esta análise combinada falhou para identificar variantes de nucleótidos que afectaram as sequências do local de consenso de splicing (Tabela S1), com a excepção notável de uma variante do número de cópias (CNV) que consiste de um elemento de 54 pb localizada 13 nucleótidos a jusante local de splicing a 3 ‘do exão 15 ( A Fig. 3B). Este elemento está presente como duas cópias em DNA genômico B6, mas uma cópia está em falta a partir da posição correspondente no A. O duplicado 54 elemento bp encontrado em B6 é em si parte de um motivo de DNA repetitivo composto por 3 repetições de DNA fim-a-idênticos que inclui o local 3 ‘de splicing de

Nfκb1

exão 15 no genoma B6 (Fig. 3B). A supressão de um dos dois elementos de 54 pb em A perturba a integridade do motivo de 3 repetições encontradas em ADN B6. A variabilidade do número de repetições desses ADN do fim-de-idênticas sugeriu uma possível mudança na conformação secundária sequência nesta junção do exão 15 /intrão 15 em ADN genómico e /ou RNA precursor. Com efeito, a análise preliminar da estrutura secundária de um fragmento de ADN de mais de 350 pb abrangendo o motivo de 3 repetições mostra a presença de um pseudo-nó putativo em ratinhos B6 (Fig. 4A), que está ausente do ADN genómico A (Fig. 4B). Além disso, a 54 pb-elemento, uma cópia da qual está ausente de A, exibe de espécies cruzadas similaridade de sequência entre os ratos, humanos e várias outras espécies (Fig. 5A), sugerindo um possível papel conservada deste elemento e estrutura secundária associada através várias espécies. Curiosamente, não parece ser significativa conservação da sequência do intrão 15 entre as espécies, ao passo que a sequência de nucleótidos e previu

Nfκb1

exão 15 sequência de aminoácidos mostra fraca conservação inter-espécies (Fig. 5A, 5B). O papel específico pelo qual esse CNV iria regular a função NFKB1 foi investigada, mas, até agora, nenhum mecanismo claro foi identificada (ver Discussão)

.

A ferramenta pknotsRG [77] foi usado para gerar estruturas secundárias para o 350 segmento de nucleótidos que abrangem a estrutura de repetição de 3-B6 (a) e a variante característica deleção de a /J (B). bases desemparelhados são indicados em azul, bases amarela, identificando nucleotídeos envolvidos em estruturas pseudo-nó. Esta análise identifica uma pseudo-nó com a complementaridade intra-molecular mais elaborado, que é interrompido no alelo variante A /J.

A. alinhamento ClustalW (EBI) de

Nfκb1

intron 15 sequências de diferentes espécies (mostrado à esquerda do alinhamento). A sequência de rato de referência a partir de B6 é mostrado na parte superior, incluindo o código de letra amino ácido única para o segmento de polipéptido codificado pelo exão 15. A sequência genómica de A é mostrado exactamente como na Fig. 3B, incluindo o apagado 54 duplicação bp ( “—“) eo motivo de DNA 3-repeat sobreposição do site 3 ‘splicing do exão 15 (setas). Ambas as sequências de rato (B6 e A) foram alinhados para rato correspondendo, cão, cavalo e sequências genómicas humanas. Conservação de cada nucleotídeo do mouse é representado como sombreada caixas na parte inferior com elevada (preto) para baixo (branco) Grau de conservação. B.

Nfκb1

sequência de cDNA codificada pelo exão 13 ao exão 17 (apresentado como alternada sublinhado e formato regular para cada exão) do mouse e genes humanos foram alinhados. A porção menos conservada da sequência que é codificado pelo exão 15, cuja sequência é em caracteres em negrito. nucleótidos conservada entre a sequência são identificados (*).

A activação do NFkB Caminho

Investigou-se também a activação da via de NFkB em estirpes A e B6, usando um padrão de indução de LPS ensaio em macrófagos primários (BMDM). Indução de NFkB nos macrófagos e células epiteliais do intestino é muito semelhante no que diz respeito aos sinais de indução que estão ativos em ambas as células (LPS /TLR4; Nod1 /peptidoglycan; TNF /TNF-R) e cinética de tempo [38]. BMDM foram expostos a LPS, e em diferentes pontos de tempo, as células foram lisadas e analisadas por western blot para a expressão de p50 e p105 Nfκb1 isoformas, total e phospohorylated (P-) Iκbα, bem como a quinase total e fosforilada de IkB, (p -) Iκkβ (Figura 6).. Estas experiências mostraram níveis semelhantes de expressão de p50 Nfκb1 e proteínas P105, e Iκkβ total. Estes níveis permaneceram semelhantes ao longo da duração do tratamento. No entanto, a activação da via de NFkB por LPS era muito mais forte em B6 do que num macrófagos, conforme determinado pelo aparecimento de activado P-Iκkβ e a diminuição simultânea na Iκbα junto a detecção de p-Iκbα, orientada para a degradação. Em macrófagos B6, activação NFkB ocorreu mais rapidamente e foi mais robusto do que em A BMDM (cinética de aparência e quantidade total de p-Iκbα e p-Iκkβ). No geral, estes resultados identificam mais fraca activação de NFkB para uma células em comparação com as células B6 em resposta à estimulação por LPS microbiana.

osso macrófagos derivados de medula foram preparados a partir de (

CCS3

S

) e

CCS3

R

ratinhos B6 () e foram estimuladas na presença de lipopolissacarídeo (LPS). Nos intervalos indicados tempo (minutos, mostrados na parte superior), as células foram colhidas, lisadas e extratos de proteínas totais foram preparados. As amostras foram resolvidas em 10% SDS-PAGE e analisados ​​por imunotransferência com anticorpos contra p50 de NFkB (P105), no total, e phospohorylated (P-) IκBα bem como cinases fosforiladas totais e IkB, (p-) IKKα /β e β- actina como controlo de carga. O peso molecular de proteínas individuais é mostrada no lado direito de cada painel montados, cada um dos quais é representativa de 3 experiências independentes.

expressão de p105 /Nfκb1 proteínas p50 na mucosa normal e de tumores de A /J

investigada a expressão do precursor Nfκb1 P105 por imunohistoquímica usando um anticorpo (ver Materiais e Métodos) que reconhece ambas as P105 e o produto p50 Nfκb1. Nesta análise, foram incluídos nas mesmas seções ambos mucosa normal, lesões displásicas e adenocarcinomas mais avançadas, quer intramucoso ou protubing no lúmen intestinal, todos obtidos na necropsia de A ratos 18 semanas pós-tratamento. Várias imagens representativas são mostrados na Figura 7. Na mucosa normal, a coloração das proteínas NFkB é visto em criptas, predominantemente nos núcleos de células epiteliais intestinais (IEC), e também pode ser detectado no sub-população de células da lâmina própria. Esta coloração é em larga medida ausente em áreas adjacentes de hiperplasia de tecido /adenomas (Fig. 7F /h), assim como em outras secções com tumores desenvolvidas (adenocarcinomas) visto no lúmen intestinal (Fig 7b /d). Estes resultados indicam uma perda de expressão da proteína Nfκb1 em lesões cancerosas com displasia de alto grau de baixa e observada em camundongos A /J.

coloração imuno-histoquímica Representante (IHC) para a proteína p105 NFKB1 /p50 em tumores e epitélio do cólon adjacente a partir de murganhos portadores de homozigoto a /J-haplótipo em CCS3. 5 × ampliação (a, c, e, g) e correspondentes 20 × ampliação (b, d, f, h) são apresentados por cinco tumores representativos.

Discussão

últimos anos, estudos de associação do genoma (GWAS) têm apontado para uma pluralidade impressionante de fatores genéticos que contribuem para CRC susceptibilidade em seres humanos [4], [5]. Além disso, é cada vez mais reconhecido que os fatores ambientais, como dieta, estilo de vida e flora microbiana pode contribuir ainda mais para modular penetrância ou expressividade da pré-disposição genética. A contribuição de genes individuais para CRC susceptibilidade pode ser avaliada em modelos de ratos relevantes, onde os fatores genéticos e ambientais podem ser controladas [6]. Da mesma forma, a dissecção ‘frente genética’ de susceptibilidade diferencial de linhagens puras para CRC pode identificar os efeitos de genes novos, a relevância do que pode ser posteriormente testado para CRC humana [21].

No estudo atual, temos reduziu o tamanho do

CCS3

para ~2.15 Mb, um tamanho passíveis de clonagem posicional [39]. Este intervalo contém 12 transcrições anotados, dos quais 6 são expressos no intestino (Fig. 3A). Um deles codifica p105 Nfκb1, um forte candidato posicional e componente central de sinalização de NFkB. Embora muitas variantes polimórficas foram identificados entre A e B6 para genes no intervalo, translocações variantes obviamente não patológicos foram identificados nas suas regiões de codificação. a coloração imuno-histoquímica (IHC) revelou expressão Nfκb1 nuclear forte no epitélio do cólon normal, ao passo que os tumores adjacentes no mesmo tecido expresso muito baixo nível de proteína NFKB1 (Fig. 7). Isto sugere que a tumorigénese cólon está associada com a sub-regulação de P105 Nfκb1 no nosso modelo de ratinho de CRC-induzida AOM. Além disso, detectamos uma deleção perto

Nfκb1

exon 15 em A camundongos. Os mapas de deleção intrónicas 54 pb dentro de uma estrutura de repetição 3-unidade que sobrepõe o local de splicing a 3 ‘do

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exão 15. A correspondente sequência do intrão 15 mostra notável conservação inter-espécies, e o segmento afectado pela deleção é previsto para formar uma estrutura secundária muito estável, que é interrompida na um genoma. elementos de ADN presentes em intrões são conhecidos por influenciar o processamento do ARN como elementos de sequência [40] ou como estruturas secundárias que podem ser ligados por proteínas de ligação de dsRNA [41], [42]. Além disso, a estrutura secundária do ADN tais como ansas em gancho de cabelo de ADNcs também pode afectar o reconhecimento de ADN-proteína [43], a expressão do gene e de recombinação de ADN [44]. Gancho de cabelo formadas nas repetições de ADN tem sido associada com um certo número de doenças genéticas [45], [46], [47]. Importantemente, os estudos de expressão de proteínas em macrófagos primários tratados com LPS a partir de A e ratinhos B6 demonstrar a activação diferencial do percurso NFkB nestas células. Ao monitorizar a activação dependente do tempo e acumulação máxima de activado P-Iκkβ e p-Iκbα alvo para degradação notou-se que uma activação mais forte da via NFkB está associada com uma diminuição acentuada na susceptibilidade a CRC. Portanto, a convergência de genética colocação de dados de mapeamento

Nfκb1

dentro do intervalo ~2.15 Mb de

CCS3

, o papel conhecido da via de NFkB na homeostasia da mucosa intestinal (ver abaixo), o detectada a perda de expressão da proteína NFkB p105 /p50 em tumores, em comparação com a mucosa normal, a activação diferencial observada desta via em animais de diferentes

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haplótipos, e a presença de uma alteração genética no gene distintivo, em conjunto apontar no

Nfκb1

como um forte candidato para o

CCS3

efeito.

Nfκb1 é um membro da família de NFkB de fatores de transcrição que compartilham um DNA amino-terminal de ligação e domínio de homologia dimerização Rel. No entanto, ela não tem um domínio de activação de transcrição (TAD) e depende de heterodimerização com os membros contendo TAD família NFkB (p65 /RELA, RelB, c-Rel) para ativar a transcrição [48]. Nfκb1 é sintetizada como um precursor P105.