Abstract

Fundo

Phyllanthus

é um medicamento tradicional planta que tem sido utilizado no tratamento de muitas doenças, incluindo a hepatite e diabetes. O principal objetivo do presente trabalho foi investigar os potenciais efeitos citotóxicos do extrato aquoso e metanólico de quatro

Phyllanthus

espécies (

P.amarus, P.niruri, P.urinaria

e

P.watsonii

) contra as células cancerosas de melanoma de pele e próstata.

Metodologia /Principais achados

Phyllanthus

planta parece possuir propriedades citotóxicas com inibitória de metade do máximo concentração (IC

50) valores de 150-300 ug /ml para o extrato aquoso e 50-150 ug /ml de extrato metanólico, que foi determinada utilizando o ensaio de redução de MTS. Em comparação, os extractos de plantas não apresentaram qualquer citotoxicidade significativa na pele humana normal (CCD-1127Sk) e células de próstata (RWPE-1). Os extractos parecia actuar causando a formação de um claro “escada” fragmentação de ADN apoptótico em gel de agarose, apresentado células positivas TUNEL com uma elevação da caspase-3 e -7 actividades. O nível de lactato desidrogenase (LDH) foi menor que 15% em células

Phyllanthus

tratados de câncer. Estes indicam que

Phyllanthus

extractos têm a capacidade de induzir a apoptose com efeitos mínimos necróticas. Além disso, a análise do ciclo celular revelaram que

Phyllanthus

induziu uma prisão /-fase G1 Vão em células PC-3 e uma paragem da fase S em células MeWo e estes estavam acompanhados por acumulação de células na Sub-G1 ( apoptose) de fase. As propriedades citotóxicas pode ser devido à presença de compostos fenólicos, tais como galotaninos, elagitaninos, flavonóides e ácidos fenólicos encontrados tanto na água e metanol extracto das plantas.

Conclusões /Significado

Phyllanthus

planta exerce o seu efeito de inibição de crescimento de um modo selectivo em relação às células cancerosas através da modulação do ciclo celular e indução de apoptose através da activação de caspases em células de melanoma e cancro da próstata. Assim,

Phyllanthus

podem ser fontes para o desenvolvimento de um agente anti-cancro potente indutor de apoptose

citação:. Tang YQ, Jaganath IB, Sekaran SD (2010)

Phyllanthus

spp. Induz Crescimento Inibição selectiva de células de cancro humano MeWo PC-3 e por meio da modulação do ciclo celular e na indução de apoptose. PLoS ONE 5 (9): e12644. doi: 10.1371 /journal.pone.0012644

editor: Niyaz Ahmed, da Universidade de Hyderabad, Índia |

Recebido: 25 de junho de 2010; Aceito: 17 de agosto de 2010; Publicação: 08 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Postgraduate Research Grant, da Universidade Malaya (UM PS183 /2009b) (www.um.edu.my) e da Malásia Agrícola e Instituto de Pesquisa para o Desenvolvimento (MARDI) (53-02-03-1002) (www.mardi.gov .meu). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é um nome dado a grupo de doenças que surgem a partir de crescimento descontrolado, a propagação de uma célula anormal e pode resultar em morte. É extremamente difícil de tratar, devido a várias classes distintas de tumores que exibem respostas diferentes ao tratamento e nem todos os agentes anticancerosos efectivamente dar uma resposta positiva em todos os casos [1]. Alguns têm sido referido como exibindo toxicidade para as células normais, acompanhada de efeitos indesejáveis ​​tais como vómitos, náuseas e alopécia. Assim, os agentes anticancerígenos ineficazes resultaram em altas taxas de mortalidade em pacientes [2] cancerosas. O melanoma é um tipo de cancro da pele que surge a partir de melanócitos, uma célula produtora de bronzeamento pigmento. incidência de melanoma e sua taxa de mortalidade é alta em populações de pele clara em todas as partes do mundo, incluindo Austrália, EUA e Reino Unido [3] – [4]. O câncer de próstata é a segunda principal causa de mortes por câncer depois do câncer de pulmão no mundo [3]. Atualmente, não existem tratamentos eficazes para o câncer melanoma e de próstata, e como tal intensa pesquisa é necessária para obter novos agentes anticancerígenos para esses cânceres.

A alta mortalidade em pacientes com câncer tem levado muitos pesquisadores a fonte para o potencial -produtos naturais à base de compostos terapêuticos [2]. plantas de ervas e medicamentos derivados de plantas têm sido usadas como fonte de agentes anticancerígenos potenciais em culturas tradicionais em todo o mundo e estão se tornando cada vez mais popular na sociedade moderna [5]. Os potenciais agentes anticancerígenos derivados de produtos naturais são conhecidos por possuir diversos compostos bioativos, como roscovitina de rabanete vermelho e flavopiridol de

Amoora rohituka

, uma árvore tropical que tem mostrado efeitos tremendos no tratamento de cancros [6] – [8].

a planta do género

Phyllanthus

pertence à família

Euphorbiaceae

e foi relatado para ter efeitos farmacológicos, como a atividade antiviral contra a hepatite B e relacionados vírus da hepatite [9] – [12], actividade anti-bacteriana [13], [14], a actividade anti-hepatotóxica ou protector no fígado [15] – [19], bem como anti-tumorais e anti-cancerígenos propriedades [16 ], [20]. Além disso, é também exibiu propriedades hipoglicemia [21], [22]. Embora o gênero de plantas

Phyllanthus

foi mostrado para ser benéfico para a saúde humana, mas a sua eficácia contra o câncer ainda não foi completamente elucidado.

Um dos desafios no tratamento do câncer é que o cancro possui a capacidade para evadir a apoptose (morte celular ou programa) que leva à sua ineficácia como droga citotóxica para matar células cancerosas. O processo apoptótico é um importante mecanismo de morte celular em resposta ao tratamento citotóxico e sua indução é um modo altamente desejável para um agente anticanceroso [23]. ciclo celular é um processo que actua como uma chave para controlar o crescimento e proliferação de uma célula. A interrupção do processo do ciclo celular irá causar um desequilíbrio entre a proliferação celular e a morte celular (apoptose), subsequentemente levando ao desenvolvimento do cancro. Assim, o ciclo celular pode servir como alvo para o agente anti-cancro para deter a proliferação incontrolada de células cancerosas e de dar início a eles sofrem apoptose [24]. Os efeitos citotóxicos de

Phyllanthus

extractos aquosos (e metanol) sobre a inibição do crescimento contra o melanoma da pele e células do cancro da próstata durante o seu ciclo celular poderia explicar em parte o seu modo de atividade. O objetivo do presente estudo foi determinar o efeito citotóxico do

Phyllanthus

extrai sobre a proliferação de células cancerosas da próstata e da pele e também para investigar a relação destes efeitos antiproliferativos com apoptose provável e modulação do ciclo celular.

resultados

a atividade citotóxica de extratos aquosos e metanólico de

Phyllanthus

espécies

neste estudo, nós investigamos os efeitos citotóxicos do extrato aquoso e metanólico bruto de quatro diferentes

Phyllanthus

espécie,

P.amarus, P.niruri, P, urinaria,

e

P.watsonii

, em dois cânceres humanos (MeWo e PC-3) bem como normais (CCD-1127Sk e RWPE-1) linhas celulares. As propriedades citotóxicas do

Phyllanthus

extractos foram determinados usando o MTS [3- (2-il-4,5-dimetiltiazol] -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H sal -tetrazoliuminner) ensaio de redução. O princípio por detrás deste ensaio é baseado na capacidade de redução de um sal de tetrazólio solúvel, pela enzima desidrogenase mitocondrial das células viáveis, num produto de formazano colorido solúvel que pode ser medida espectrofotometricamente. A concentração inibitória de metade do máximo (IC

50) O valor foi determinado a partir da curva de dose-resposta construída e configurada como um parâmetro para a citotoxicidade.

A Tabela 1 mostra a comparação de IC

50 para valores ambos os extratos aquosos e metanólico bruto dos quatro

Phyllanthus

espécies em ambos câncer humano linhas celulares (MEWO e PC-3) e normal (CCD-1127Sk e RWPE-1). O resultado revela a presença de efeitos citotóxicos de

Phyllanthus

espécies, tanto melanoma de pele e células de câncer de próstata, onde o respectivo IC

50 valores de

foram determinados Phyllanthus

extratos. Em comparação, a planta não mostrou quaisquer efeitos citotóxicos significativos nas células humanas normais, enquanto que, as drogas anticâncer padrão (5’Fluorouracil e doxorrubicina) apresentou efeito citotóxico mais forte do que o

Phyllanthus

extratos, mas apresenta toxicidade no Normal células (Tabela 1). Entre os quatro

Phyllanthus espécies de plantas

,

P.urinaria

mostraram forte efeito citotóxico, seguido de

P.watsonii, P.niruri

e

P.amarus

. Além disso, o CI

50 valores dos extractos de metanol de

Phyllanthus

espécies foram notavelmente mais baixo do que os extractos aquosos em ambas as células cancerosas que indicam que o extracto de metanol é mais citotóxico do que o extracto aquoso.

Identificação de polifenóis em

Phyllanthus

espécies

O metanol e extratos solúveis em água obtidos a partir de várias espécies de

Phyllanthus

foram submetidos à análise por HPLC (High Cromatografia líquida de desempenho), acoplada com o agrupamento de fotodíodos (PDA) e detecção por MS-MS, permitindo a identificação de compostos fenólicos (Tabela 2). Doze compostos principais foram identificados com base nos seus tempos de retenção, os espectros de UV, e os espectros de massa parental e padrões de fragmentação secundário. Os compostos foram detectados gálico ácido, galloylglucopyronside, digalloylglucopyronside, trigalloylglucopyronside, tetragalloylglucopyronoside, corilagen, geranina, rutina, glicosídeo quercetina, quercetina diglucoside, quercetina ramnosídeo e ácido caffeolquinic.

fragmentação do DNA

uma das características bioquímicas do processo de apoptose é a formação de fragmentação de DNA nuclear, o que mostra a presença de fragmentos de DNA típicos escada de 180 – 200 pares de bases e seus múltiplos num gel de agarose. Em contraste, a clivagem aleatória de ADN em células necróticas irá produzir uma mancha difusa mediante electroforese de ADN. Assim, o ADN método de electroforese em gel foi utilizado para determinar o possível modo de morte celular causada por

Phyllanthus

extractos. A Figura 1A mostra a presença de fragmentos de DNA produzidos por tratamento de células com MEWO

Phyllanthus

extractos e um padrão similar foi observado com o fármaco padrão (5’Fluorouracil) como controlo positivo. Sem formação de escada foi observada em células não tratadas. Estes fenómenos também foram observadas na linha de células PC-3 de ambos os extractos tal como mostrado na Figura 1B. Assim, isto indica que ambos os extractos de

Phyllanthus

eram capazes de induzir a apoptose ou morte celular programada em MeWo e células PC-3, em resposta aos efeitos citotóxicos de

Phyllanthus

.

pista 1 -4: aquosa e Lane 6-9: extractos de metanol para

P.amarus, P.niruri, P.urinaria

e

P.watsonii

, na ordem. Pista 5 e 10: 1 kb do ADN marcador, pista 11: uma droga de referência, em que A) 5’Fluorouracil para MeWo e B) A doxorrubicina para células PC-3. Pista 12:. Células não tratadas

TUNEL e índice apoptótico

TUNEL (terminal desoxinucleotidiltransferase dUTP nick rotulagem final) de ensaio é uma técnica para permitir a detecção de células em apoptose, rotulando a livre final de ADN apoptótico com um marcador que pode ser visualizada sob microscópio de luz. Como mostrado na Figura 2, as células apoptóticas foram observadas como células de cor castanha em

Phyllanthus

extrai-tratada MeWo (Figura 2A, ponta de seta) e as células cancerígenas PC-3 (Figura 2B, seta), o seu aspecto foram similares para células apoptóticas que estavam presentes nos controlos positivos, apoptótica-indutor droga anticancerosa (5’Fluorouracil e doxorrubicina), enquanto que as células viáveis ​​foram coradas azul. Isto confirma que o

Phyllanthus

extratos foram capazes de induzir apoptose em células de melanoma de pele e câncer de próstata. As populações de morte celular pode ser calculado e expresso de uma forma matemática, conhecido como índice apoptótico. A partir da Figura 2C, a percentagem de morte celular (apoptose índice) dos doentes tratados com MeWo e PC-3 foram significativamente aumentada até 50% em comparação com o grupo controle em 72 horas de tratamento com

Phyllanthus

extratos. Além disso, a percentagem de

Phyllanthus

extratos células em apoptose induzida foi perto das drogas anticâncer (5’Fluorouracil e doxorrubicina), com diferença apenas 8%

análise TUNEL de MeWo e PC-3. células cancerosas depois de serem tratados com

Phyllanthus

extrai a 100 × ampliação. células TUNEL-positivos (apoptóticos) foram observável como células coradas marrom (seta vermelha) em) MeWo e B), as células PC-3 extractos tratados com

Phyllanthus

A e células viáveis ​​normais manchar como a cor azul. C) O gráfico mostra a percentagem de índice apoptótico (%) de não tratada e tratada (

Phyllanthus

extratos e drogas anticâncer) MeWo e células cancerosas PC-3 a partir da análise TUNEL.

Phyllanthus

extratos induzida por caspase-3/7 ativações

Uma ativação de caspases (aspartato específica cisteína protease) é uma das alterações bioquímicas durante a apoptose. Os níveis de caspase-3/7 induzida por

Phyllanthus

tratamento estavam acentuadamente aumentadas (3-4 dobras), em comparação com o grupo não tratado (Figura 3) para ambos os extratos de

Phyllanthus

. O nível de caspase-3/7 de drogas padrão, 5’Fluorouracil e Doxorubicina em MeWo e células PC-3, respectivamente, eram 6-dobras aumentar quando comparada com a do grupo controlo e 0,5 vezes maior do que

Phyllanthus

extrai após 72 horas de tratamento. Isto indica que a apoptose induzida por

Phyllanthus

extratos foi mediada através da activação das caspases.

O gráfico mostra os níveis de caspase-3 e -7 em grupos tratados e não tratados de MeWo e PC-3 células . As barras mostram a média ± SE

induzidas extratos-Phyllanthus

mínima efeito necrótica

A necrose é uma outra forma de morte celular que irá provocar uma resposta inflamatória de células vizinhas através a fuga de conteúdos intracelulares. Como mostrado na Figura 4, a percentagem de níveis de LDH produzida como um resultado do tratamento com ambos os extractos de

Phyllanthus

espécies foi inferior a 10% para as células MeWo e menos de 15% para as células PC-3, em comparação ao dos grupos de controle após 72 horas de tratamento. O efeito necrótico de extractos de metanol foi mais pronunciado, onde foi observada a ser de 4% mais elevada do que o extracto aquoso de

Phyllanthus

espécies. Isto sugere que o

Phyllanthus

espécie possui efeitos necróticos mínimos e melanoma pele era menos propenso a exibir efeito necrótica do que as células cancerosas da próstata. Em contraste, o nível de LDH induzido pelo controlo positivo (5’Fluorouracil e doxorrubicina) foi 25% mais elevada do que as células não tratadas e de 18% na variação com o

Phyllanthus

tenha sido tratada com células em 72 horas de tratamento.

o gráfico mostra a percentagem de níveis de LDH no

Phyllanthus

-extratos MeWo tratada e PC-3 células de câncer foram maiores do que o grupo não tratado, após 72 horas de tratamento. As barras mostram a percentagem média ± SE

Phyllanthus

extratos induzem a paragem do ciclo celular seguido de apoptose

Para determinar a fase do ciclo celular que é inibida pelo

Phyllanthus

extractos de plantas, tanto MeWo e células PC-3 foram tratados pelo respectivo IC

50 valores de 24, 48, 60 e 72 horas e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo. A cinética da distribuição do ciclo celular de grupos tratados e não tratados de MeWo e células PC-3 foram mostrados na Figura 5 e 6, respectivamente. As alterações na distribuição das células tratadas em diferentes fases do ciclo celular foram observáveis ​​por 24 horas após o tratamento com

Phyllanthus

extrai para as linhas de células tanto de cancro.

A percentagem de

Phyllanthus células

extratos-tratados em a) Sub-G1, B) Ir /G1, C) S e D) G2 /M fases de células MEWO em intervalos de tempo diferentes (24, 48, 60 e 72 horas) de tratamento . As barras mostram a percentagem média ± SE

A percentagem de

Phyllanthus

células extratos-tratado em um) Sub-G1, B) Ir /G1, C) S e D) G2 /M fases de células PC-3 em intervalos de tempo diferentes (24, 48, 60 e 72 horas) de bares de tratamento mostram a percentagem média ± SE

Como pode ser visto na Figura 5,

Phyllanthus

extractos apresentaram paragem do crescimento na fase-S em células MeWo de 24 horas e manteve-se evidente depois de 72 horas de tratamento e isso foi acompanhado por uma acumulação de células na Sub-G1 (células de apoptose) tanto para a fase aquosa e extratos metanólico. A percentagem de células apoptóticas tinha aumentado de uma maneira dependente do tempo a partir de 1,8% em 24 horas para 6,1% às 72 horas, em comparação com os grupos de controlo (Figura 5A). Enquanto isso, a percentagem de células na fase S de células MeWo tratados foi elevado para 15% acima dos controlos às 72 horas de tratamento (Figura 5C). Além disso, a percentagem de células em Go /G1 e G2 /M fases diminuiu com o tempo após tratamento com

Phyllanthus

extrai devido ao facto de as células tratadas foram presos em fase S e, subsequentemente, acumulado no Sub-G1 (apoptose) de fase (Figura 5B e 5D). No entanto, a potência de

Phyllanthus

extrai para induzir a paragem da fase S não foi tão forte como a droga padrão (5’Fluorouracil), com uma diferença de 22,1% em 72 horas após o tratamento.

para as células PC-3,

Phyllanthus

apresentaram paragem do crescimento na fase Go /G1, 72 horas após o tratamento com uma acumulação de células em apoptose na fase sub-G1 para ambos os extractos aquosos e metanólico. A percentagem de células apoptóticas aumentou de 3,4% em 24 horas até 7,4% em 72 horas ao longo dos grupos não tratados (Figura 6A). A percentagem de células PC-3 tratadas em Go /G1 de fase foi de 13,7% em 24 horas e aumentou para 18,8% às 72 horas acima dos grupos não tratados (Figura 6B). No entanto, a percentagem de células na S e G2 3 tratados com PC-/M fases diminuiu com o tempo de tratamento (Figura 6C e 6D), devido ao facto de que tratada células PC-3 foram presos em Go /fase G1 e posteriormente acumuladas em fases Sub-G1. Enquanto doxorrubicina mostraram uma prisão fase G2 /M em células PC-3 às 24 horas e manteve-se evidente após 72 horas de tratamento.

Discussão

O homem tem plantas usados ​​extensivamente para o tratamento de vários tipos de doenças desde os tempos antigos [7]. plantas de ervas e medicamentos derivados de plantas têm sido amplamente utilizados em culturas tradicionais em todo o mundo e ganharam popularidade na sociedade moderna como alternativas naturais para produzir novos compostos terapêuticos potenciais para o combate às doenças [5]. Sessenta por cento dos fármacos anticancerígenos disponíveis hoje originado a partir de produtos naturais, e seus derivados (incluindo antibióticos). Isso resultou em uma maior confiança nos produtos naturais como fontes importantes para o desenvolvimento de agentes anticancerígenos eficazes [7].

No presente estudo, ambos os extratos aquosos e metanol de quatro espécies de plantas de

Phyllanthus

efeitos citotóxicos exibido no melanoma humano da pele (MeWo) e próstata (-3 PC) linhas celulares. As variações no IC

50 valores de

Phyllanthus

extratos contra células de melanoma e câncer de próstata pode ser devido aos diferentes níveis de compostos bioativos presentes em cada

Phyllanthus

espécies, como a quercetina, ácido gálico e ácido caffeolquinic que têm sido provado possuir efeitos anticancerígenos [16], [25] – [27]. Além disso, os dados obtidos sugerem que o extrato metanólico de

Phyllanthus

parecia ter efeito citotóxico mais pronunciada do que extrato aquoso, indicando os compostos bioactivos solúveis em metanol contidas no

Phyllanthus Quais são, provavelmente, mais potente do que os compostos bioactivos solúveis aquosos em matar células cancerosas. Entre os quatro

Phyllanthus

espécies utilizadas,

P. urinaria

mostrou o efeito mais forte citotóxicos. Isto poderia ser associado ao seu conteúdo exclusivo de trigalloylglucopyronoside e tetragalloylglucopyronosid. Curiosamente,

Phyllanthus

extratos não causou quaisquer alterações significativas na viabilidade celular de ambas as linhas de células normais da pele humana (CCD-1127Sk) e próstata (RWPE-1). Estes resultados correlacionam-se com os estudos realizados por Huang et ai. em que

Phyllanthus

plantas exibido matança seletiva contra as células cancerosas [28]. Este efeito citotóxico selectivo é um critério importante, porque as drogas actualmente disponíveis como alvo as células normais, bem como conduz a efeitos secundários.

A vida e a morte de uma célula é controlada pelo ciclo celular, que é fortemente regulada pela ciclina , quinases dependentes de ciclina (CDK), inibidores de CDK (CDKI) e outros genes supressores de tumor. Assim, a desregulação do ciclo celular irá conduzir à proliferação anormal de células com DNA danificado e evasiva da apoptose [29].

Phyllanthus

extratos interrompeu o ciclo celular de células MEWO em fase S, implicando, assim, que eles poderiam ter interferido com a síntese de DNA, travar a progressão do ciclo celular na fase S e levando a apoptose. A paragem da fase S por

Phyllanthus

extrai em células MeWo pode ser devido a: (1) inibição de enzimas cdc25 [16], [30] – [32], ou (2) a inibição da topoisomerase II de ADN o que leva à activação de caspases [16], [33]. Assim, altos níveis de caspase-3 e -7 atividades foram detectados após o tratamento 72 horas posto de

Phyllanthus

extratos. No entanto, paragem da fase S por exibiu

Phyllanthus

extractos não foram tão pronunciado como 5’Fluorouracil, que é uma droga anti-cancro da pele sensível da fase S, indicando que

Phyllanthus

extrai provavelmente matar células de melanoma de outras maneiras além de interromper o ciclo celular, tais como alterações em vias de sinalização celular de melanoma incluindo FAS caminho [34]. Investigações posteriores irá abordar o modo de ação de

Phyllanthus

extrai em células de melanoma.

Phyllanthus

extratos exerceram sua parada do crescimento em células-PC tratados com 3 de acumular as células em Go /G1 de fase, o que implica que

Phyllanthus

extractos podem interferir com a síntese de proteínas de células PC-3 que param assim a sua progressão da fase G1 para a fase S, durante o seu ciclo celular e subsequentemente iniciam a apoptose. Isto pode ser devido aos efeitos inibitórios da proteína MDM2, o que reduz a proliferação celular e induz a apoptose pela elevação do p21, Bax, e os níveis de pRb, bem como a redução de Rb hiperfosforilada e E2F1 [35].

Phyllanthus

induzida por apoptose em células PC-3 pode estar associado ao aumento da expressão do gene receptor /ligando Bax e Fas como proposto por Huang et al. [25]. As elevações da proteína Bax é associado com o envolvimento da via mitocondrial (intrínseco) em apoptose que envolve a redução do potencial de membrana mitocondrial, libertações do citocromo C e subsequentemente levando a activação das caspases [36]. Altos níveis de caspase-3 e -7 actividades foram detectados em células tratadas com

Phyllanthus

extractos. A /paragem na fase G1 Go no PC-3 pelo

Phyllanthus

extractos pode estar associada ao seu alto teor de compostos fenólicos. Os 12 polifenóis identificados no

Phyllanthus

, são classificados em quatro grupos principais, a saber, elagitaninos, galotaninos, flavonóides e ácidos fenólicos com elagitaninos sendo o grupo mais abundante de composto. Elagitaninos são também abundantemente encontrada em romã e têm sido estudados muito cuidadosamente para os seus efeitos terapêuticos variados incluindo as suas propriedades de cancro suprimindo [37]. Geraniin, o principal elagitanino encontrados em toda a P

hyllanthus

espécie, foram mostrados para contribuir para prisões de crescimento em outros tipos de câncer, incluindo câncer de cólon [38], [39]. No entanto, a droga de referência para o cancro da próstata, doxorrubicina, interromperam o crescimento de células cancerosas, prendendo-os em fase G2 /M e, eventualmente, iniciar a apoptose por uma variedade de mecanismos, tais como a inibição de enzimas topoisomerase como visto em outros estudos [40], [ ,,,0],41]

A activação da caspase-3 e -7 actividades em células cancerosas tratadas durante resultados apoptose em:. (1) inactivação da enzima poli (ADP-ribose) polimerase ou PARP, e (2) activação de caspases activadas ADNase (CAD), subsequentemente, fazendo com que a fragmentação do ADN, que é uma das características da apoptose [42], [43]. Deste modo, a elevação destas caspases após

Phyllanthus

tratamentos permite o aparecimento de fragmentos de ADN de apoptose em gel de agarose, que foi posteriormente confirmado com a presença de células positivas TUNEL. Assim, os efeitos citotóxicos de

Phyllanthus

extrai na pele humana (MeWo) e próstata (PC-3) linhas celulares de cancro foi mediada através de um mecanismo de apoptose com ativação de caspase-3 e -7 e isso pode ser devido à presença de ácido gálico encontrados em

Phyllanthus

extratos. O ácido gálico tenha sido anteriormente provado que induzem apoptose através da activação de caspase-3 [44].

na descoberta de medicamentos à base de produtos naturais e de desenvolvimento, de necrose pode ocorrer ao longo com a apoptose. Isto tem sido demonstrado em muitos fármacos anticancerígenos, tais como cladribina, cisplatina, doxorubicina e 5’fluorouracil, os quais possuem ambos efeitos apoptóticos e necróticos [45], [46]. A LDH são um grupo de enzimas que estão presentes no nosso corpo e o seu nível anormalmente elevado indica problemas de saúde. Em células, LDH são produzidos principalmente pelas mitocôndrias e desempenham um papel importante na oxidação do lactato, reduzindo piruvato [47]. Em morte celular por necrose, a integridade da membrana plasmática é perdida e isto leva à perda do conteúdo citoplasmático para o ambiente extracelular, causando uma reacção inflamatória [23]. As medições da enzima LDH como um indicador de necrose, demonstraram que

Phyllanthus

além de ter actividade apoptótica, também possuir uma capacidade mínima de induzir a morte celular por necrose em ambos MeWo e células PC-3. Tomados em conjunto, os resultados indicam que

Phyllanthus

planta possui dupla capacidade de morte celular, talvez devido à natureza bruta de

Phyllanthus

extratos, onde todos os compostos bioativos potenciais são misturados e maio agir individualmente ou em sinergismo, contribuindo assim para esta dupla capacidade de morte celular “efeitos.

Esses compostos bioativos são acreditados para possuir citotoxicidade para as células cancerosas através da sua capacidade de interromper o crescimento de células de câncer e iniciar-los para sofrem morte celular apoptótica. Embora os mecanismos detalhados ou subjacentes da seletividade do

Phyllanthus

planta contra células cancerosas de pele e próstata ainda não é claro, os nossos resultados revelaram que

Phyllanthus

planta exerce a sua inibição de crescimento para as células cancerosas através da modulação ciclo celular e indução de apoptose através da activação de caspases. Purificações adicionais de

Phyllanthus

extratos e investigações da via de apoptose são necessários para revelar o modo exato de ação de

Phyllanthus

planta por suas propriedades anti-câncer.

Materiais e métodos

extratos de plantas e drogas padrão

aquoso e extratos metanólicos de quatro

Phyllanthus

espécies (

P.amarus, P.niruri, P.urinaria, e P .watsonii

) foram fornecidos pelo Dr. Indu Bala, Centro de Biotecnologia, MARDI. Recentemente colhidas amostras de plantas foram lavados, secos em temperatura ambiente e depois liofilizadas. Para o extracto aquoso, secou-se amostra de plantas foram embebidas com água ultra-pura, enquanto metanol absoluto foi utilizado para a preparação de extracto metanólico. As amostras foram, então, homogeneizados com tampão de extracção e o sobrenadante foi recolhido depois de três ciclos de extracção. A doxorrubicina e 5’Fluorouracil foram as drogas convencionais utilizadas como controlos positivos neste estudo. Ambas as amostras testadas; extractos de plantas e drogas padrão foram armazenadas a -20 ° C.

cromatografia líquida de elevado rendimento acoplado com ionização electronspray (ESI) e espectrometria de massa (LC-MS-MS) análise

Para a água extraída amostras, 2 mL de sobrenadante foi seco num concentrador de vácuo (concentrador 5301 Eppendorf, Alemanha) e re-dissolveu-se em 20 mg /ml com 30% de metanol, antes de ser submetida para análise por LC-MS-MS. Para as amostras extraídas com metanol, o sobrenadante foi evaporado usando total de evaporador rotativo (Rotavapor RII, BUCHI, Suíça) e novamente com 20% de metanol dissolveu-re. As amostras foram separadas, em seguida, com a coluna de extracção em fase sólida (SPE) (LiChrolut RP-18 1000 mg /6 ml, Merck, Alemanha) com a fase móvel de 60% metanol e 70% de metanol. Todos os eluídos foram concentrados para 0,5 ml, depois diluiu-se 8 vezes com 40% de metanol, antes de ser submetida para análise por LC-MS-MS.

As amostras foram separadas utilizando o sistema de HPLC compreendendo uma bomba binária de HPLC, um injector auto-amostrador compartimento e detector de arranjo de diodos (DAD) (1200 series, Agilent Technologies, Alemanha). As separações foram realizadas usando uma fase inversa C-18, 150 mm x 4,6 mm d.i., 5 um de tamanho de partícula Thermo Hypersil OURO coluna (Thermo Scientific, Reino Unido). A separação foi desenvolvido utilizando uma fase móvel de ácido fórmico a 0,1% em água (solvente A) e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo (solvente B), com uma configuração de gradiente de solvente B: 5% (5 min), 5-90% (60 min), 5% (4 min) a um caudal de 1 ml /min. O volume de injecção foi de 20 ul e as detecções foram ambos a 280 nm e 360 ​​nm. Para a análise de espectrometria de massa, 3200 QTrap sistema LC /MS /MS (appiled Bioscience – MDS Sciex) foi utilizado com a fonte de ferro e a tensão foi mantida a 500 ° C e -4,5 kV para a ionização negativa, respectivamente. gerador de azoto foi ajustado para ser operado em fluxo de 60 psi de gás de cortina, o fluxo da fonte de gás 90 psi e o fluxo de gás de escape 60 psi. Foram escolhidos dois tipos de modos de digitalização: melhorar a espectrômetro de massa (EMS) e melhorar produto ion (EPI) para um espectro de massa varredura completa variando de

m /z

100-1200

cultura celular.

(HTB-65), (CRL-2565) e próstata RWPE-1 de células de melanoma de pele MeWo de células de câncer de próstata PC-3 (CRL-1435) células, normal da pele humana CCD-1127Sk (CRL-11609) linhas foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC). As quatro linhas de células foram cultivadas com diferentes meios de comunicação, de EMEM (Meio de Eagle mínimo essencial) para células MeWo, meio RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) em células PC-3, e de crescimento de queratinócitos, CC-4455 (Lonza, EUA) para RWPE-1 e células DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium) para células CCD-1127Sk. O meio de crescimento foi suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor 10% (FBS, Gibco). As células foram mantidas em ar humidificado com 5% de CO

2 a 37 ° C. As células foram colhidas utilizando 0,25% de tripsina (Hyclone) quando atingem 70-80% de confluência em balões de cultura.