Abstract

Dois eventos importantes, a saber, adesão e invasão, são fundamentais para a ocorrência de metástase. Importantemente, o receptor da laminina de 37 kDa kDa /67 (PRL /LR) tem sido implicado na melhoria destes dois eventos, facilitando assim a progressão do cancro. No estudo corrente, o papel da PRL /LR na adesão e invasão de cancro do fígado (Huh-7) e células de leucemia (K562) foi investigada. A citometria de fluxo revelou que as células Huh-7 apresentaram níveis de superfície celular significativamente maior LRP /LR em comparação com o cancro da mama pouco invasiva (MCF-7), as células de controlo, ao passo que as células K562 exibida LRP níveis de superfície celular significativamente inferior /LR em comparação com as células MCF-7 de controlo. No entanto, análise de transferência e densitométrica ocidental revelou que todas as três linhas de células tumorigénicas não diferiram significativamente com relação aos níveis totais de LRP /LR. Além disso, o tratamento de células de cancro do fígado com anti-PRL /LR anticorpo específico de IgG1-iS18 ​​(0,2 mg /ml) reduziu significativamente o potencial adesivo de células de laminina-1 e o potencial invasivo de células através do Matrigel ECM semelhante, enquanto leucemia células não apresentaram diferenças significativas em ambos os casos. Além disso, os coeficientes de correlação de Pearson sugeriu proporcionalidade direta entre LRP níveis /LR superfície celular e o adesivo e potencial invasivo de câncer de fígado e células de leucemia. Estes resultados sugerem o potencial uso de anti-LRP /LR anticorpo específico IgG1-iS18 ​​como uma ferramenta terapêutica alternativa para câncer hepático metastático através de impedimento do LRP /LR laminina-1 interacção

Citation:. Chetty C, Khumalo T, Da Costa Dias B, Reusch U, Knackmuss S, Little M, et al. (2014) Anti-LRP /LR específica do anticorpo IgG1-iS18 ​​Impede adesão e invasão das células cancerosas do fígado. PLoS ONE 9 (5): e96268. doi: 10.1371 /journal.pone.0096268

editor: Corinne Ida Lasmezas, The Scripps Research Institute Scripps Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de novembro de 2013; Aceito: 04 de abril de 2014; Publicado em: 05 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chetty et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa, da República da África do Sul e do Medical Research Council, a República da África do Sul. Quaisquer opiniões, resultados e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do autor (s) e, portanto, a Fundação Nacional de Investigação não aceita qualquer responsabilidade a este respeito aos mesmos. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. S.F.T.W. Atualmente é PLOS ONE Editorial Board Member. U.R., S. K. e M. L. é parceiro ou empregado por Affimed Therapeutics A.G., uma empresa comercial, que produz anticorpos terapêuticos para o tratamento de câncer e doenças inflamatórias. Além disso, os anticorpos anti-PRL /LR utilizados neste estudo para o bloqueio da invasão e adesão foram descritos em duas patentes internacionais como potenciais terapêuticos anticancerígenos ferramentas. patente Nomeadamente, EP0984987, intitulado “Um precursor do receptor de laminina solúveis e os métodos para inibir as interacções” tem reivindicações dirigida a uma composição farmacêutica que compreende um precursor do receptor de laminina solúvel ou derivado funcional ou seu fragmento e é propriedade da Universidade de Witwatersrand. Esta patente foi validado no Reino Unido e na Alemanha. A segunda patente, EP1670826, é co-propriedade da Universidade de Witwatersrand e Affimed Therapeutics AG e é intitulado “agir anticorpo de cadeia única contra 37 do receptor de laminina kDa /67 kDa como ferramentas para o diagnóstico e terapia de doenças de prion e câncer, produção e à sua utilização “. Esta patente europeia emitida foi validado no Reino Unido, França, Alemanha, Suíça e Áustria. As reivindicações são dirigidas a uma única molécula de anticorpo de cadeia especificamente dirigidas a PRL /LR para o tratamento de doenças provocadas por priões ou cancro. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O cancro é um fardo global que tem sido demonstrado ser a principal causa de morte em países economicamente desenvolvidos e a segunda principal causa de morte nos países economicamente em desenvolvimento [1]. De acordo com o World Cancer Research Fund (WCRF), estima-se que 14,1 milhões de casos de câncer foram diagnosticados no ano de 2012 e prevê-se que aproximadamente 24 milhões de novos casos de câncer serão diagnosticados até o ano de 2035, globalmente (http: //www.wcrf.org/cancer_statistics/). Atualmente, o câncer de pulmão foi identificado como o tipo de câncer mais comumente diagnosticado, com os dois tipos de câncer centrais para o presente estudo nomeadamente o cancro do fígado e leucemia, sendo classificado como sexto e décimo primeiro tipos mais diagnosticados com câncer, respectivamente (Globocan). Tem sido relatado que cerca de 782 mil casos de câncer de fígado e 352000 casos de leucemia foram diagnosticados no ano de 2012 (https://www.wcrf.org/cancerstatistics/world statistics.php cancro), indicando, assim, a necessidade urgente de se desenvolver eficaz tratamentos contra o cancro.

as células são em grande parte dependentes da matriz extracelular (ECM), que é o componente não-celulares de todos os tecidos e órgãos que fornece uma estrutura de suporte físico para os componentes celulares e também ajuda na iniciação da bioquímica essencial processos necessários para a correta diferenciação dos tecidos, homeostase e morfogênese [2]. As células aderem ao ECM através da acção de receptores de ECM [2]. Particularmente, o receptor da laminina não integrina de 37 kDa /67 kDa (PRL /LR) é um dos principais componentes da matriz extracelular, auxiliando em numerosos processos fisiológicos [3], [4], [5]. Sugere-se que a 37-kDa PRL é o precursor do receptor de alta afinidade LR laminina de 67 kDa, no entanto, o mecanismo exato pelo qual a forma do precursor do receptor é desconhecido [6].

PRL /LR é predominantemente um receptor de transmembrana, no entanto, é também evidente no núcleo e citosol [7], [8]. No núcleo, a PRL /LR desempenha um papel crítico na manutenção das estruturas nucleares enquanto no citosol, auxilia em processos de translação [8]. Como um receptor de transmembrana, PRL /LR serve várias funções, tais como a migração celular [9], adesão célula-matriz [10], a viabilidade celular e a proliferação de [3], [4], [5].

LRP /LR foi demonstrado ter uma elevada afinidade de ligação para laminina-1. Laminina-1 faz parte de uma família de lamininas, que são proteínas de matriz extracelulares que constituem várias glicoproteínas não-colagenosas que são encontrados na membrana basal [11], [12]. Esta glicoproteína Acredita-se que desempenham papéis críticos na ligação de células [11], a montagem da membrana basal [11], crescimento e diferenciação celular [13], a migração de células [11], [14], crescimento de neuritos [11], [15 ] e angiogénese [16]. Laminina-1 também tem sido demonstrado para promover o fenótipo invasivo de células tumorigénicas [17].

PRL /LR foi encontrado para ser sobre-expresso na superfície de várias células tumorigénicas [18]. O resultado desta sobre-expressão de um aumento da interacção entre a PRL /LR e laminina-1, e esta interacção tem sido mostrado para ser crucial na melhoria da adesão e invasão – dois componentes fundamentais da metástase [19]. Essencialmente, laminina-1 na membrana basal interage com a PRL /LR sobre a superfície de células tumorigénicas que conduzem à adesão [19]. Este, por sua vez, resulta na secreção de enzimas proteoliticas tais como a colagenase de tipo IV, a fim de hidrolisar o colagénio do tipo IV na membrana basal, permitindo assim que as células tumorigénicas para invadir e eventualmente se translocam para um local secundário [19].

Desde o /LR-laminina-1 interacção LRP foi identificado como o evento crucial na adesão e invasão, bloqueamento desta interacção pode ser considerada como um mecanismo essencial para o tratamento do cancro metastático. Isto implica LRP /LR como um alvo para o tratamento do cancro metastático. Além disso, vários estudos têm demonstrado que a aplicação de anticorpos específicos anti-PRL /LR reduz significativamente o adesivo e potencial invasivo de certas células tumorigénicas, tais como HT1080 fibrossarcoma [18], do pulmão [4], do colo do útero [4], do cólon [4] , próstata [4], de mama [20] e [20] células cancerosas esofágicas. Particularmente, anti-PRL /LR anticorpo específico de IgG1-iS18 ​​tem sido sugerido para interromper o /LR-laminina-1 interacção LRP [4], assim IgG1-iS18 ​​pode ser considerada como um possível ferramenta terapêutica no tratamento do cancro metastático.

neste estudo, a capacidade do anticorpo anti-LRP /LR-específica IgG1-iS18 ​​para impedir o adesivo e potencial invasivo de células de leucemia e câncer de fígado foi investigada. Devido à alta incidência e mortalidade em relação a esses dois tipos de câncer, as opções terapêuticas alternativas tornam-se uma necessidade. É digno de nota que os estudos semelhantes foram realizadas, no entanto, é possível que nem todos os tipos de células de cancro metastáticas podem ser responsivos a tratamentos de IgG1-iS18. É, por conseguinte, torna-se necessário levar a cabo estes estudos metastáticas em diferentes tipos de cancro, a fim de obter conhecimento sobre a utilização do anticorpo, tal como um anticorpo terapêutico amplo espectro alternativa para o tratamento de vários tipos de cancro. Assim, este estudo foi realizado com o objectivo de determinar se IgG1-iS18 ​​é capaz de reduzir significativamente o adesivo e o potencial invasivo de células de leucemia e de cancro do fígado, o que proporciona a possibilidade de o anticorpo a ser utilizado como uma ferramenta terapêutica alternativa no tratamento destes dois tipos de câncer.

Materiais e Métodos

cultura de células e condições

adenocarcinoma de mama humano (MCF-7), carcinoma de fígado (HUH7) e leucemia (K562) As linhas celulares obtidas a partir da ATCC foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) alto teor de glucose (4,5 g /l) suplementado com 10% de soro fetal de vitela e 1% de penicilina /estreptomicina a 5% de CO

2 e 37 ° C.

Reagentes e anticorpos

Matrigel utilizadas para ensaios de invasão de células é derivada da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma de rato e foi obtido de BD Biosciences.

laminina-1used para ensaios de adesão de células foi obtido a partir de Sigma-Aldrich.

cloranfenicol-acetil-transferase (CAT) de anticorpo foi obtido a partir de Sigma-Aldrich.

de IgG1-iS18 ​​foi produzida de modo recombinante num sistema de expressão de mamífero como relatado por

Zuber et al., (2008)

a microscopia confocal

de modo a visualizar a localização da PRL /LR na superfície da célula, foi empregue microscopia confocal. As células foram semeadas em lamelas de primeiro e deixou-se atingir 70% de confluência. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS durante cerca de 15 minutos, seguido de várias lavagens com PBS. As células foram bloqueadas em BSA a 0,5% em PBS, durante 5-10 minutos. Após uma lavagem PBS, o excesso de PBS foi apagado off. As lamelas contendo as células foram colocadas sobre uma lâmina de vidro (com células viradas para cima) e este foi seguido da adição de anticorpo primário-IgG1 iS18 (1:100) diluída em BSA a 0,5%. Poste uma incubação durante a noite a 4 ° C, lamelas foram enxaguadas três vezes em PBS /BSA. Depois da adição do anticorpo secundário acoplada com FITC que tinha sido diluído em BSA a 0,5%, a incubação no escuro foi deixada durante 1 hora. Seguido por três lavagens como anteriormente, DAPI diluída em PBS foi então administrado durante 5-10 minutos para permitir a coloração do núcleo. As células foram finalmente lavados uma vez com PBS sozinho e montadas numa lâmina limpa utilizando GelMount (Sigma-Aldrich). Um período de 45 minutos, foi alocado para permitir definir a ter lugar.

A citometria de fluxo

A quantificação dos níveis de superfície celular de LRP /LR foi realizada por citometria de fluxo. EDTA (5 mM) em PBS foi usado para facilitar o desprendimento de células aderentes, que foi seguido por centrifugação a 1200 rpm, 10 min. As células foram subsequentemente fixadas pelas células re-suspensão em PFA durante 10 min a 4 ° C. As células foram novamente centrifugadas em 1X PBS que permitiu a preparação de cinco suspensões celulares, um dos quais não se adicionou qualquer anticorpo (servindo assim como o controlo não manchado), um ao qual foi adicionado anticorpo anti-CAT (que serve como um controlo de isotipo) e um dos quais foi adicionado anti-PRL /LR anticorpo específico de IgG1-iS18. Os dois restantes suspensões de células foram incubadas apenas em PBS, a fim de ser utilizado como controlos negativos para a IgG1-iS18 ​​e anticorpo anti-CAT. Todas as suspensões foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Na sequência de três passos de lavagem com PBS 1X, ficoeritrina cabra anti-humano (PE) -coupled anticorpo secundário (Beckman Coulter) foi adicionado à suspensão de células contendo o anticorpo primário-IgG1 iS18, bem como uma das suspensões que foi incubado em apenas PBS . A suspensão de células que foi incubado com o anticorpo anti-CAT, bem como a restante suspensão de células que foi incubada apenas em PBS, foram ambos suplementados com uma aloficocianina de cabra anti-coelho (APC) -coupled anticorpo secundário seguido por outro período de incubação de 1 hora de todas as suspensões celulares. Além disso, três lavagens pós-incubação foram realizados e as suspensões de células foram analisados ​​utilizando o BD Accuri C6 citómetro de fluxo. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

SDS-PAGE e Western blotting

os níveis totais de PRL /LR foram determinados pela utilização de sulfato de electroforese em gel de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE ). Para executar o SDS-PAGE, foram usados ​​10 ug de proteína total. As proteínas que foram separados de acordo com o tamanho por SDS-PAGE foram então identificados através da aplicação de anticorpos específicos no processo de transferência de Western. As proteínas resolvidas no gel de poliacrilamida foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) utilizando 1X tampão de transferência (20% de metanol em glicina 192 mM e Tris 25 mM) durante 45 minutos a 350 mV e um dispositivo de transferência semi-seca. tampão (3% de BSA em PBS 1X Tween) de bloqueio foi, em seguida, utilizada para bloquear a membrana durante 1 hora manchada. Uma vez bloqueado, a membrana foi sondada com anti-PRL /LR anticorpo primário específico de IgG1-iS18 ​​(1:10000) durante 1 hora. Antes da incubação da membrana com anticorpo de cabra anti-humana-peroxidase (1:5000) secundário, foram realizadas três lavagens com PBS 1X Tween. A mais três lavagens em 1X PBS Tween foram realizados após incubação em anticorpo secundário, seguido pela detecção de HRP por utilização de um substrato quimioluminescente melhorado (Thermo Scientific). A fluorescência resultante foi revelada e fixada sobre uma película de raios-X. As experiências foram executadas em triplicado e repetidos pelo menos 3 vezes.

Ensaio de aderência de

A fim de avaliar o potencial de adesivo das linhas de células tumorigénicas que variam à membrana basal

In vitro

, laminina-1 (10 ug /ml) (BD Biosciences) foi usada para revestir placas de 96 micropoços, deixando poços não revestidos para serem usadas como controlos negativos. Após o revestimento dos poços durante 1 hora e lavagem com 0,1% de BSA em DMEM, outros locais de ligação da proteína sobre a placa de micropoços foram bloqueadas com 100 uL de BSA a 0,5% em DMEM durante uma hora. As células foram suspensas em meio de cultura isento de soro e adicionados a poços a uma densidade de 4 x 10

5 células /ml, a fim de avaliar o potencial de adesão. Além disso, as células que foram pré-incubadas com IgG1-iS18 ​​(0,2 ug /ml) e com anticorpo anti-CAT (Sigma, 0,2 ug /ml) de anticorpo como o controlo negativo foram adicionados aos poços correspondentes a fim de examinar os efeitos de os anticorpos sobre o potencial de adesão das células. As placas foram incubadas a 37 ° C durante 1 hora e, posteriormente, as células não aderentes foram lavadas com PBS e as células aderentes foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos. As células aderentes foram coradas com 0,1% de violeta de cristal. A mancha foi extraída usando 1% SDS e a absorvância da amostra extraída a 550 nm foi ensaiada como uma medida do potencial adesivo. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

Invasão ensaio

In vitro

análise da capacidade das linhagens de células tumorigénicas para invadir a membrana basal foi realizada utilizando o Matrigel ECM semelhante. meio de cultura frio isento de soro (DMEM) foi utilizado para diluir o Matrigel e este gel diluída foi dispensada na câmara superior de uma placa de 24 Transwell (BD Falcon, 8 um de tamanho de poro). Este gel foi então deixado solidificar durante aproximadamente 5 horas a 37 ° C. Depois de ser colhida, as células foram ressuspensas em meio de cultura isento de soro a uma densidade de 1 × 10

6 células /ml. tratamentos com anticorpos células que devem ser incubadas com IgG1-iS18 ​​(0,2 ug /mL) ou o anticorpo anti-CAT de controlo negativo (Sigma, 0,2 ug /ml) de anticorpo. As células foram, subsequentemente, carregou-se a câmara coberta de Matrigel superior e incubaram-se durante 18 horas. A câmara inferior foi preenchida com 500 ul de meio de cultura contendo 10% de FCS (para o teste) e sem FCS (para o controlo), e incubou-se a 37 ° C durante 18 horas. Isto foi seguido por aspiração dos meios de comunicação na câmara inferior e superior. As células não-invasivos foram então removidos através do uso de uma haste de algodão. As células invasivas restantes foram depois lavadas com 300 ul de PBS e fixadas com 300 ul de paraformaldeido a 4%, 10 min. As células foram coradas com 0,5% de corante azul de toluidina e após extracção do corante utilizando SDS a 1%, a absorvência foi então medida a 620 nm utilizando um leitor de ELISA. Os experimentos foram realizados em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

Avaliações estatísticas

O teste t de Student bicaudal com um intervalo de confiança de 95% foi utilizado para analisar os dados , com valores de p inferior a 0,05 foi considerado como significativo. A extensão ou grau de associação entre a PRL níveis /LR na superfície da célula e invasivo /adesivo potencial foi medida pelo coeficiente de correlação de Pearson. O coeficiente de correlação de Pearson foi também utilizado para medir a correlação entre o adesivo e o potencial invasivo das linhas de células. Um coeficiente positivo foi uma indicação da proporcionalidade direta entre as duas variáveis, enquanto um coeficiente negativo implícita proporcionalidade inversa.

Resultados

células cancerosas do fígado e leucemia revelar LRP /LR na superfície da célula

Fundamental para a ocorrência de metástases é a interacção entre a laminina-1 e PRL /LR na superfície da célula. Por isso, foi necessário para visualizar a PRL de superfície celular /LR como um meio de confirmação de que as células, de facto exibem PRL /LR sobre a sua superfície. Ambas as linhas de células tumorigénicas, bem como o controlo do cancro da mama pouco invasivo, revelou PRL /LR na superfície da célula, como representado na Figura 1 a). A fluorescência verde nas imagens abaixo é indicativa de superfície celular LRP /LR como células eram não-permeabilizadas e foi mostrado o anticorpo secundário não ligam não especificamente, como foi confirmado pelos controles representados na figura 1 b) e Fig.1 c) abaixo. O anticorpo anti-CAT foi utilizado como um controlo negativo, devido à sua capacidade de se ligar especificamente a cloranfenicol-acetiltransferase (CAT), que é uma proteína bacteriana e é, portanto, ausente em células de mamífero.

As células foram não-permeabilizadas, a fim de permitir a visualização da superfície da célula. a) As células foram marcadas com o anticorpo primário-IgG1 iS18 e um anticorpo secundário acoplado a FITC. b) As células foram marcadas com anti-acteyltranferase cloranfenicol (CAT) anticorpo como controlo negativo. c) As células foram marcadas apenas com o anticorpo secundário acoplada com FITC para confirmar que o anticorpo secundário não se liga de forma não específica.

altas percentagens de células tumorigénicas exibir PRL /LR na superfície da célula

Embora microscopia confocal confirmou que as linhas de células, de facto visor PRL /LR na sua superfície celular, foi necessário proceder a outras quantificação dos níveis de superfície celular da PRL /LR. A citometria de fluxo foi utilizada para esta quantificação.

Como se mostra na figura 2 A, C e E, todas as três linhas de células tumorigénicas revelaram elevadas percentagens de células dentro de uma população específica que exibir PRL /LR na superfície da célula, com a mudança entre os dois picos em cada gráfico sendo indicativo de uma mudança na intensidade de fluorescência devida à coloração da superfície celular das células com um anticorpo específico anti-PRL /LR-IgG1 iS18 e o anticorpo secundário acoplado com fluorocromo. HUH-7 de células de cancro do fígado mostrou uma percentagem mais elevada de células que exibem a PRL /LR na superfície da célula, em comparação com as células de leucemia K562, bem como o cancro da mama pouco invasiva (MCF-7), linha celular de controlo. FIG. 2 B, D e F, adicionalmente, incluir o controlo não corado, e este controlo serviu para mostrar que o anticorpo secundário PE não se liga de forma não específica. As mudanças na intensidade de fluorescência de células APC, única e anti-CAT-APC marcadas não-coradas (controlos negativos) estão representados na Fig S1. É também de salientar a adicionar que agrega restos celulares e celulares foram excluídos da análise de como eles estavam fora do portão definida (Fig. S3).

O primeiro pico nos gráficos A, C e E é representativo de não- células marcadas, ou seja, as células marcadas com anticorpo secundário de cabra anti-humano acoplado a PE única, ao passo que o segundo pico é indicativo de células marcadas com ambos os anticorpos anti-PRL /LR anticorpo específico de IgG1-iS18 ​​e o anticorpo secundário, ambos na concentração de 30 ug /ml. Gráficos B, D e F ilustram a inclusão de um controlo não corado para mostrar nenhum anticorpo secundário ligação não específica. Os experimentos foram realizados em triplicado e repetidos pelo menos três vezes com 20 000 células sendo contados por amostra.

células cancerosas do fígado mostrar significativamente mais elevada e células de leucemia apresentam níveis significativamente mais baixos de superfície celular LRP /LR comparação com células de cancro da mama pouco invasivos

para além da percentagem de células que exibem a PRL /LR na sua superfície celular, a PRL níveis reais de superfície celular /LR dentro de uma população específica de células foi analisada por citometria de fluxo. O mesmo número de células (20.000 células) em populações específicas de as três linhas de células tumorigénicas foram marcadas com a mesma concentração (30 ^ g /ml) de anticorpos primários e secundários anteriormente mencionados durante o mesmo período de tempo. Assim, quanto mais a PRL /LR que está presente na superfície das células tumorigénicas, o anticorpo mais primária IgG1-iS18 ​​se ligaria a PRL /LR e, subsequentemente, o anticorpo secundário acoplado com fluorocromo mais IgG-specifc se ligaria ao anticorpo primário . Assim, as intensidades de fluorescência média (IFM) que diferem entre as três linhas de células (Tabela 1) e, portanto, pode ser usado como um indicador dos níveis LRP /LR superfície celular. Observou-se que, em comparação com a linha de células MCF-7 de controlo do cancro da mama pouco invasivo, células do cancro do fígado (Huh-7) apresentaram níveis mais elevados de PRL /LR na sua superfície celular (Fig.3). Além disso, as células de leucemia K562 LRP revelou níveis inferiores de superfície celular /LR, em comparação com as células MCF-7 (Fig.3).

As células foram marcadas com o anticorpo primário-IgG1 iS18 (01:25) e anti- humano ficoeritrina (PE) anticorpo secundário. 20.000 células foram analisadas através de todas as três linhas de células, e as intensidades de fluorescência média (IFM) foram usadas como indicador dos níveis LRP /LR superfície celular. Os valores de MFI indicados na última coluna do Quadro 1 foram utilizados para construir esta figura e é de salientar que o valor MFI correspondente à linha de células MCF-7 foi definido como 100%. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidos pelo menos três vezes. ** P = 0,0025, *** p . 0,0001

As intensidades de fluorescência das medianas obtidas pós anti-CAT rotulagem e detecção de demonstrar que não há diferença significativa no grau de cell- coloração CAT superfície em todas as três linhas de células (Fig. S2)

LRP total níveis /LR não diferem significativamente entre as linhas de células tumorigénicas

Como mencionado anteriormente, LRP /LR não ocorre exclusivamente na superfície da célula, mas, adicionalmente, é visto no núcleo e citosol, análise de mancha de Western foi realizada, por conseguinte, a fim de avaliar os níveis totais de PRL /LR. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes. Uma mancha representativa está representada na Fig.4. É digno de nota para indicar que apenas o receptor de laminina kDa precursor 37 pode ser detectado por utilização de anti-PRL /LR anticorpo específico de IgG1-iS18.

anti-PRL /LR anticorpo específico de IgG1-iS18 ​​foi usado como o o anticorpo primário conjugado com um anticorpo acoplado a HRP secundário. β-actina foi utilizada como um controlo de carga.

Após a detecção de LRP, quantificação dos níveis totais de LRP era necessária e densitometria foi empregado para alcançar este objectivo. A Figura 5 descreve a análise densitométrica, que revelaram que, estatisticamente, não havia nenhuma diferença significativa observada em níveis totais de LRP entre as três linhas de células tumorigénicas.

A quantificação foi realizada usando densitometria e os dados são representativos das experiências levadas a cabo em triplicado e repetidas três vezes. Não significativo (NS):. P 0,05

IgG1-iS18 ​​impedir de forma significativa o potencial adesiva de células de câncer de fígado

Pivotal para o início de invasão é a adesão de um tumorigênico célula para a membrana basal através da interacção PRL /LR-laminina-1, uma vez que permite a outras interacções que ocorrem para facilitar a degradação da membrana basal. As células foram incubadas com anticorpos anti-CAT (0,2 mg /mL) IgG1-iS18 ​​e depois de uma hora e, as leituras de absorvância da solução resultante foram indicativos do grau de fixação das células às placas de laminina-1-revestidos.

Tal como representado na figura 6, o controlo sem anticorpo permitiu a determinação do potencial de adesivo das linhas celulares e verificou-se que tanto o cancro do fígado (Huh-7), bem como células de leucemia (K562) foram mais do que aderente o câncer de mama mal-invasiva (MCF-7), as células controle. No entanto, IgG1-iS18 ​​só foi eficaz de impedir a potencial adesiva de células de câncer de fígado e nenhuma redução significativa na adesão foi observada para as células de leucemia tratados com o anti-LRP /LR anticorpo específico IgG1-iS18. Como esperado, o anticorpo de controlo anti-CAT não têm um efeito significativo sobre o potencial adesivo das linhas de células tumorigénicas

p-valores mostrados no vermelho (* p = 0,0238; *** p = 0,0002). são indicativos do aumento do potencial de adesivo de cancro do fígado (Huh-7) e células de leucemia (K562) em comparação com o cancro da mama (MCF-7), linha celular de controlo. Os valores de p mostrados em preto (** p = 0,0031; *** p = 0,0005) representam a diminuição do potencial de adesivo após o tratamento de células com anticorpos apropriados. Foi observada uma redução de 63,35% no potencial de adesivo com a administração de IgG1-iS18 ​​aos HUH-7 células de câncer de fígado. Os dados representam experiências realizadas em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

Invasão do Matrigel por células de câncer de fígado (HUH-7) é significativamente impedida por anti-LRP /LR anticorpo específico IgG1-iS18 ​​

invasão da membrana basal é considerado como um pré-requisito para a progressão de um cancro metastático, por conseguinte, ensaios de invasão usando um Matrigel, que imita os componentes da membrana basal, foram realizados para determinar o potencial invasivo da linhas de células tumorigénicas. Da mesma forma para os ensaios de adesão, o controlo sem anticorpo permitiu a determinação do potencial invasivo das linhas de células. Além disso, as células foram tratadas com um anticorpo específico anti-PRL /LR-IgG1 iS18 e anticorpo anti-CAT (0,2 mg /ml).

Tal como mostrado na Fig.7, cancro do fígado (Huh-7) são células significativamente mais invasivo em comparação com o cancro da mama pouco invasiva (MCF-7), linha celular de controlo, enquanto que as células de leucemia (K562) mostrou um potencial invasivo significativamente menor em comparação com o controlo. Além disso, a IgG1-iS18 ​​dificultado com sucesso o potencial invasor de cancro do fígado (Huh-7), enquanto as células não resultado significativo foi observado para as células de leucemia. Como esperado, o controlo de anticorpo anti-CAT não afectou de forma significativa o potencial invasivo das linhas de células tumorigénicas

p-valores indicados a vermelho (* p = 0,0485; ** p = 0,0053). Representam as alterações em potencial invasivo das linhas de células em comparação com o controlo de células MCF-7, enquanto os valores de p mostrados em preto (* p = 0,0214; ** p = 0,0091) são indicativos do efeito de anticorpos apropriados sobre o potencial invasivo das linhas de células. Após a administração de IgG1-iS18 ​​aos HUH-7 de células de cancro do fígado, foi observada uma redução de cerca de 39,75% em relação ao potencial invasivo das células. Os dados são representativos das experiências levadas a cabo em triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

Discussão

Vários estudos têm revelado que, na superfície da célula, diversas linhas de células tumorigénicas apresentam uma sobreexpressão do de 37 kDa /67 kDa PRL /LR, portanto, o que sugere que o /LR-laminina-1 interacção PRL pode ser crucial para as células cancerosas se submeter a metástase [21]. Por conseguinte, pode ser útil para inibir esta interacção como um meio de dificultar a adesão e invasão – dois eventos considerados cruciais para a ocorrência do processo de metástase. Um estudo conduzido por Zuber

et al

demonstrou que o anticorpo IgG1-iS18 ​​é altamente específico para LRP /LR [18]. Além disso, pesquisas recentes têm mostrado que o anticorpo específico anti-PRL /LR IgG1-iS18 ​​impedir de forma significativa o adesivo e potencial invasivo de cervical [4], do pulmão [4], próstata [4], do cólon [4], da mama [20] e esofágicas [20] células cancerosas. O presente estudo investigou o papel da LRP /LR na adesão e invasão de câncer de fígado (HUH-7), bem como as células de leucemia (K562), e teve como objetivo estabelecer se a aplicação de anti-LRP /LR anticorpo específico IgG1-iS18 ​​significativamente reduz o adesivo e potencial invasivo destas duas linhas de células tumorigénicas.

Inicialmente, microscopia confocal revelou que todas as três linhas de células tumorigénicas, de facto visor PRL /LR sobre a sua superfície celular (Fig. 1a). No entanto, esta técnica é limitada pelo facto de que não é quantitativa e análise adicional foi necessário para estabelecer os níveis em que a PRL /LR é exibida na superfície da célula de linhas de células tumorigénicas estes.

significativamente elevados percentagens ( 87%) de todas as três linhas de células tumorigénicas, a saber, Huh-7, as células K562 e células MCF-7 (cancro da mama controlo mal-invasiva) exibido PRL /LR na sua superfície celular (Figura 2). Além disso, observou-se por análise das diferenças em intensidades de fluorescência média que, em comparação com a linha celular de controlo MCF-7, células de cancro do fígado (Huh-7) revelou células significativamente mais elevados e de leucemia (K562) revelou significativamente inferior LRP superfície celular /níveis LR (fig.3). Como afirmado anteriormente, a PRL /LR desempenha papéis essenciais na adesão, invasão, migração e proliferação de células [9]. Vendo que a linha de células Huh-7, é conhecido por ser invasivo e o K562 é entendida para ser uma linha de células em suspensão (ATCC), os níveis da superfície celular da PRL /LR que foram observadas podem ser correlacionando-se com o potencial invasivo dessas células