Abstract

NEDD9, uma proteína de adesão focal andaimes, foi recentemente proposta para regular invasão e metástase em alguns tipos de câncer, mas desconhecido em câncer cervical. O objetivo deste estudo foi determinar se NEDD9 estava envolvido na progressão e metástase de câncer cervical. Os resultados experimentais mostraram proteína NEDD9 foi sobre-expresso em cancro cervical em comparação com os tecidos do epitélio cervical normal. Superexpressão de NEDD9 foi correlacionada com a gradação histológica, metástase linfonodal, e estágio FIGO do câncer cervical. Silenciamento NEDD9 resultou na desfosforilação da tirosina de FAK e SRC oncoproteínas, e diminuição da migração celular e invasão nas células de carcinoma cervical HeLa e SiHa. A sobre-expressão de NEDD9 conduziu à fosforilação da tirosina de FAK e SRC oncoproteínas, e o aumento da migração celular e invasão. Além disso, a fosforilação da tirosina de NEDD9 foi significativamente diminuído através de suprimir a fosforilação de tirosina da FAK ou SRC, sugerindo um ciclo de feedback positivo de fosforilação de tirosina entre NEDD9 e FAK ou SRC. Além disso, os nossos dados mostraram que o silenciamento NEDD9 diminuição da expressão de vimentina e aumento da expressão de E-caderina nas células de cancro cervical, e vice-versa. E-caderina foi objecto de regulação da NEDD9, FAK e SRC, mas alterou nem tirosina-fosforilada nem NEDD9 total. Nossos resultados sugerem que NEDD9 é overexpressed em tecidos de câncer cervical e células, e overexpressed NEDD9 promove migração e invasão em células de carcinoma do colo do útero, provavelmente através de um ciclo de feedback positivo de fosforilação de tirosina entre NEDD9 e FAK ou SRC

Citation.: Sima N, Cheng X, Ye F, Ma D, Xie X, Lü W (2013) A superexpressão da proteína andaime NEDD9 Promove migração e invasão no câncer cervical via tirosina fosforilada FAK e SRC. PLoS ONE 8 (9): e74594. doi: 10.1371 /journal.pone.0074594

editor: Olivier de Wever, Universidade de Ghent, Bélgica

Recebido: 19 de fevereiro de 2013; Aceito: 05 de agosto de 2013; Publicação: 18 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Sima et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O presente estudo foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (nºs 30801227;. 81272862), a Zhejiang Provincial Natural Science Foundation da China (Nos Y2100403;. LY12H16020), o Programa Nacional de Pesquisa básica da China (No. 2009CB521808), o Fundamental Fundos de pesquisa para as universidades centrais da China e do Programa Provincial de Zhejiang para o cultivo de alto nível talentos Saúde inovadoras. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em mulheres em todo o mundo, especialmente nos países em desenvolvimento. Anualmente, cerca de 529.800 mulheres enfrentam esta doença, sendo responsável por 9% do total de casos novos de câncer [1]. Embora as estratégias atuais de tratamento, tais como a histerectomia radical e radioterapia tem bons resultados clínicos, quase 275.100 mortes são atribuídas ao câncer cervical todos os anos. Além disso, a cirurgia só é adequado para o início de doenças de palco e radioterapia acarreta efeitos secundários indesejáveis, tais como a insuficiência ovariana, estenose vaginal, radiocystitis e proctite radiação que influenciam a qualidade de vida do paciente [2]. Portanto, esses fatos salientam a necessidade urgente para o desenvolvimento de alvos terapêuticos mais eficazes e inovadoras.

gene NEDD9, identificado pela primeira vez em células precursoras neuronais em 1992, foi regulada durante o desenvolvimento do mouse do sistema nervoso central [ ,,,0],3]. Depois, este gene também foi encontrado em outras espécies e tecidos. Lei et al [4] rastreada uma biblioteca de cDNA para os genes que induziram brotamento levedura filamentosa de

S. cerevisiae

a fim de encontrar genes candidatos que podem coordenar sinalização celular e morfologia. Um “novo” gene foi identificado e designado o Enhancer Humano de filamentação 1 (HEF1). Outra equipe de pesquisa descobriu que a proteína relacionada com a p130Cas um romance 105 kD foi tirosina fosforilada pelo envolvimento das integrinas b1 em linfócitos T e designou como substrato do tipo de linfócitos Crk-associado (Cas-L) [5]. Assim, NEDD9 tinha dois outros nomes independentes na história. proteínas NEDD9 regular complexos proteicos que controlam ciclo celular e apoptose, migração, quimiotaxia, e diferenciação [6]. FAK e SRC foram implicados como alvos importantes de NEDD9 e eles foram fosforilada e ativada mutuamente, o que foi considerado como o “processo de regulação core” da NEDD9 [7].

Expressão

Nos últimos anos, alteradas de andaimes proteína NEDD9 surgiu como contribuindo para a metástase do câncer em vários tipos de câncer, como câncer de mama [6,8], glioblastoma [9], melanoma [10], pulmão [11,12] e cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP) [13]. No entanto, até à data nenhum estudo é realizado para determinar se NEDD9 está associado a carcinoma cervical humano. Relatórios recentes sugeriram que NEDD9 é sobre-expresso em alguns carcinoma humano como o melanoma [10] e HNSCC [13]. Aqui nós detectada expressão NEDD9 em tecidos de câncer cervical humanos e explorou o papel da NEDD9 na progressão do câncer cervical.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostra de tecido coleção

A amostras de tecidos do colo do útero e de nódulos linfáticos e parâmetros clínicos de 67 pacientes cervicais cancerosas (38 carcinomas escamosos cervicais e 29 adenocarcinomas), que foram submetidos à cirurgia em 2005 para 2009 em Hospital da Mulher, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang, foram recolhidos e dados detalhados foram mostrados na Tabela S1. Além disso, 22 amostras de tecido normal do colo do útero como controles foram derivadas de pacientes que se submeteram a histerectomia por causa de doenças ginecológicas benignas. Nenhum paciente recebeu quimioterapia ou radioterapia antes de os tecidos foram obtidos. O estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital da Mulher, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes ou seus responsáveis ​​legais.

Imunohistoquímica

Todos os tecidos foram imuno-histoquímica manchado em seções 4 mícrons para avaliar a expressão NEDD9 nestas amostras. Monoclonal de ratinho contra o anticorpo 2G9 NEDD9 (Abcam, 1: 1000) foi utilizado como o anticorpo primário. EnVision

kit de detecção de TM foi utilizado nos procedimentos e 3,3′-diaminobenzidina (DAB) foi aplicado como cromogénio. Cada secção foi marcado cegamente para a determinação semi-quantitativa da intensidade de coloração imuno-histoquímica por um patologista. intensidade da coloração foi pontuada como se segue: 0, sem coloração; 1, positividade fraca; 2, positividade moderada; e 3, positividade forte. As pontuações de imunohistoquímica compostos foram obtidos pela soma das pontuações de intensidade multiplicado pela proporção de células desse escore intensidade. Por exemplo, se a amostra apresentou coloração moderada (pontuação 2) em 20% das células e a coloração forte (3 pontos) em 30% das células, as pontuações de imuno-histoquímica compostas seria (2 x 0,2) + (3 x 0,3) = 1,3. Uma pontuação média foi utilizada para análise estatística.

cultura celular

linhas celulares de cancro do colo do útero Humanos SiHa (HPV16-positivo), CaSki (HPV16-positivo), HeLa (HPV18-positivo), C33A (HPV-negativo), humana não tumoral linha de queratinócitos HaCaT e linhas de células de rim embrionário humano HEK293 e HEK293T foram obtidos de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EUA). As células foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle. (DMEM; GIBCO, EUA) contendo soro fetal bovino a 10% (FBS) numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 a 37 ° C

Imunofluorescência

Quarenta e oito horas após o plaqueamento em lamelas de vidro, as células foram fixadas com paraformaldeído a 3,7% e incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho 2G9 (1: 200) contra NEDD9 como anticorpo primário. Após lavagem três vezes com PBS, as células foram incubadas com anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com Alexa Fluor 647 (Invitrogen) diluiu-se 1: 1500 em 2% de BSA, como anticorpo secundário. Os núcleos foram marcados com Hoechest33342 (Sigma).

siRNAs Preparação e transfecção

Com base na literatura [14] e uma ferramenta gratuita baseada na web (https://www.dharmacon.com) , três pares de siRNAs foram projetados contra mRNA NEDD9. ARNsi contra HPV16 E6 /E7 e a E-caderina foram concebidos como descrito anteriormente [15]. Todos os ARNic em cadeia dupla (Tabela S2) foram sintetizados quimicamente por GeneChem Co., Ltd. (Xangai, China). As transfecções foram realizadas em placas de 6 poços e usando Lipofectamine ™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Lentivirus Produção

A sequência de codificação completa de NEDD9 foi amplificado por PCR a partir dos plasmídeos contendo clone de ADNc de NEDD9 (OriGene, EUA) e inserido num vector de transferência de genes lentivírus pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen, EUA). A sequência de codificação de RNAs curtos hairpin (shRNA) de segmentação proteína de fluorescência verde (GFP) ou NEDD9 (Tabela S2) foram clonados imediatamente a seguir um pol III U6 promotor num vector de transferência de genes lentivírus (Invitrogen, EUA). Os vectores foram subsequentemente empacotado em partículas de lentivírus em células HEK293T. Os lentivírus foram utilizados para infectar células do cancro do colo do útero, tal como descrito anteriormente [16]. lentivírus produzidos foram titulados e armazenados de acordo com as instruções do fabricante.

Quantitative PCR

Total de RNAs foram preparados a partir de células tratadas usando TRIzol reagente (Invitrogen, EUA). PCR em tempo real quantitativa (qPCR) foi realizada utilizando um sistema de PCR de 7300 em tempo real (Applied Biosystems) e realizada por corante SYBR verde de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores oligonucleotídicos foram sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd. (Xangai, China). como listado na Tabela S2. A quantificação relativa da expressão do mRNA foi calculada com o 2

-ΔΔCT método tal como descrito anteriormente [17].

manchas de Western e imunoprecipitação

As transferências de Western foram realizados como descrito anteriormente [18] . As células foram colhidas e ressuspensas em tampão de lise para a extracção de proteínas. Cinquenta microgramas de proteína total a partir de cada amostra foi submetido a uma electroforese em gel de SDS-PAGE a 10%. Para imunoprecipitação, as células foram rebentadas em 250 mL de tampão de imunoprecipitação. Quantidades iguais de proteína (300 ug) foram sujeitas a imunoprecipi tacão, seguido por análise Western Blot. nível de cinzento cumulativa de bandas de Western blot foi obtido utilizando o software ImageJ (NIH, EUA) para análise quantitativa quantificação relativa. Os anticorpos primários foram específicos para proteínas seguintes: NEDD9 (ab18056) da Abcam, FAK (3285), pFAK (3283), Src (2109), pSRC (2101), Phospho-tirosina (9411), Vimentin (3932) e E-caderina (3195) A sinalização de forma da célula, HPV16 E6 (MAB874), E7 (MAB8680) da Millipore, GAPDH (SC-59540) e β-actina (SC-1616-R) de Santa Cruz. As bandas foram visualizadas usando um Kit ECL (Pierce, EUA).

Risco de cicatrização ensaio

Risco ensaio de cicatrização foi realizada para determinar a migração celular. As células foram infectadas com lentivírus, e 72 h depois cultivadas até à confluência completa. Em seguida, feridas (cerca de 1 mm de largura) foram preparadas utilizando uma ponta de micropipeta riscado através dos poços. A velocidade de migração celular foi calculado através da medição da distância migrada em 24 h. As fotografias foram tiradas com microscópio de contraste de fase (Olympus, Japão) em diferentes pontos de tempo após a zero.

Transwell ensaios

Os ensaios in vitro de invasão de células foram realizadas em placas de Transwell com base em Matrigel essencialmente conforme descrito previamente por Pelletier et al [19] com ligeiras modificações. 5 × 10

4 As células foram plaqueadas para dentro das câmaras de Matrigel-revestidas superiores das placas de 24 poços, Costar Transwell (Corning, Cambridge, MA) com um tamanho de poro de 8 um. Os compartimentos inferiores foram cheias com meio suplementado com soro fetal de bovino a 20%. Após 24 h de incubação, as células que não migraram na superfície superior das membranas foram suavemente raspadas com cotonetes de algodão e as células que migraram que tinham invadido a superfície inferior foram corados com violeta cristal e contadas. Os ensaios de migração de células foram realizados de uma forma semelhante, mas sem Matrigel.

A análise estatística

Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os dados foram analisados ​​com o pacote de software SPSS 12.0. Uma maneira ANOVA e teste t de Student foram utilizados para comparar os dados.

p

valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativa.

Resultados

NEDD9 é sobre-expresso em tecidos de câncer e linhas de células do colo do útero humano

Para encontrar uma pista da relação entre a proteína NEDD9 e carcinoma cervical humano, usamos a análise de imuno-histoquímica para determinar a expressão da proteína NEDD9 em tecidos de carcinoma cervical humano e analisada a associação da expressão de NEDD9 com a progressão do carcinoma cervical humano. Descobrimos que a proteína NEDD9 foi sobre-expresso na maioria dos tecidos de carcinoma cervical, mas fracamente expresso em tecidos epitélio cervical normal (Figura 1A). Além disso, a proteína NEDD9 foi sobre-expresso em linfonodos metastáticos (Figura 1B). Além disso, a sobre-expressão NEDD9 foi correlacionada com o grau histológico, metástase, e FIGO fase (Figura 1C). Além disso, como mostrado na Figura 1D, o ARNm NEDD9 foi sobre-expresso em quatro linhas celulares de cancro do colo do útero comuns (SiHa, HeLa, CaSki e C33A) independentemente de HPV-positivas ou -negativas, mas relativamente fracamente expresso em linha de queratinócitos HaCaT humanos e de células de rim embrionário humano linha HEK293. A análise Western blot mostrou que NEDD9 foi altamente expressa em linhas celulares de cancro do colo do útero, de modo semelhante às de qPCR. Análise por imunofluorescência mostrou que a proteína de NEDD9 foi sobre-expresso em linhas celulares de cancro do colo do útero e distribuídas principalmente em citoplasma (Figura 1E).

(A) coloração imuno-histoquímica de NEDD9 no carcinoma do colo do útero (SCC), adenocarcinoma de o colo do útero (AC) e o tecido normal do colo do útero. ampliação original, × 400. (B) coloração imuno-histoquímica de NEDD9 em metastáticos gânglios linfáticos ilíacos externos esquerdo do SCC e metastáticos certas nós obturador linfáticos do AC. ampliação original, × 400. (C) A análise estatística mostrou superexpressão NEDD9 foi correlacionada com a fase FIGO, gradação histológica e metástase. (D) Expressão de ARNm NEDD9 e proteína em várias linhas celulares foi avaliada por PCR quantitativa e análise de Western blot. (E) NEDD9 (vermelho) de localização e de expressão foram avaliados através da análise de imunofluorescência em carcinoma cervical SiHa, CaSki, HeLa, células C33A e queratinócitos HaCaT humanos. As células foram contra-coradas com Hoechest33342 (azul) e visualizou a 60 × ampliação.

expressão alterada de NEDD9 influências migração e invasão em células cancerosas cervicais

Para identificar a função NEDD9 em células de câncer do colo do útero, que derrubou NEDD9 em células SiHa e HeLa usando um específico siRNA (S: 5 ‘GAG ACA CCA UCU ACC AAG U [dT] [dT] 3’, aS: 5 ‘ACU UGG UAG AUG GUG UCU C [ ,,,0],dT] [dT] 3 ‘), que foi seleccionado a partir de três candidatos por qPCR. Como mostrado na Figura 2A, 2B e 2C, o siRNA mostraram efeitos de interferência fortes contra ARNm NEDD9 e proteína em células do cancro do colo do útero HeLa e SiHa. Além disso, nós tentamos decidir se a migração e invasão das células cancerosas do colo do útero seria atenuado pela redução da expressão NEDD9 via shRNA realizado por lentivírus. Os resultados dos ensaios mostraram que transpo� NEDD9 shRNA reduzir a capacidade invasiva e migratória de câncer cervical SiHa e HeLa (Figura 2D e 2E). Além disso, os resultados de ensaios para cicatrização de feridas mostrou o fechamento da ferida significativamente lenta no NEDD9 shRNA-tratados versus de controlo de células SiHa e HeLa às 24 h após a zero (figura 2F, 2G e 2H). Determinou-se ainda mais os efeitos do aumento da NEDD9 sobre a migração celular e invasão. lentivírus vectores foram utilizados para sobre-expressar NEDD9 em células HaCaT (Figura 3A). TGFp (5 ng /ml) também aumentou a expressão de NEDD9 em células HaCaT (Figura 3B). Os resultados do ensaio Transwell mostrou que a sobre-expressão exógena de NEDD9 resultou no aumento da invasão e migração celular em células HaCaT sem TGF estimulação (Figura 3C e 3D).

NEDD9 foi derrubado por siRNAs ou shRNAs em carcinoma cervical SiHa e células HeLa. (A) Os efeitos de interferência foram confirmados por PCR quantitativo em células SiHa e HeLa. Expressão de NEDD9 foi examinado por transferência de Western em SiHa (B) e células HeLa (C). As células foram infectadas com vectores lentivirais que codificam shRNA contra NEDD9. Os resultados de ensaio Transwell mostrou que a entrega lentiviral de shRNA segmentação NEDD9 resultou na invasão celular reduzida (D) e migração (E) em células SiHa e HeLa. Os resultados do ensaio de cicatrização da ferida ainda arranhões verificado que o silenciamento NEDD9 resultou na migração celular reduzida (F, G e H). barra de escala, 100 mm. *

P Art 0,05.

vectores lentivírus foram empregados para superexpressão NEDD9 nos queratinócitos HaCaT humanos (A). TGFp (5 ng /ml) também aumentou a expressão de NEDD9 em queratinócitos HaCaT humanos (B). Os resultados de ensaio Transwell mostrou que a entrega lentiviral de NEDD9 resultou num aumento da invasão da célula (C) e migração (D) em células HaCaT sem estimulação TGFp. barra de escala, 100 mm.

regulação mútua entre NEDD9 e FAK ou SRC

Além disso, as expressões de FAK e SRC, duas proteínas associadas à NEDD9 [4], em SiHa infectadas e células HeLa foram determinados por Western blot. Os resultados mostraram que as expressões de fosfo-FAK (Tyr397) e fosfo-Src (Tyr416), mas não total de FAK e proteína total SRC, foram significativamente menores a seguir knockdown de NEDD9 (Figura 4A e 4B). Em experiências sobre-expressão, tirosina-fosforilada e a FAK SRC, em vez de FAK total e SRC total, foram significativamente regulada positivamente, enquanto NEDD9 foi exogenamente super-expresso em células HaCaT (Figura 4C e 4D). Além disso, a imunoprecipitação foi utilizado para determinar se o inibidor de FAK PF-228 (Sigma, 10 mM) ou um inibidor SRC PP2 (Sigma, 10 mM) regulado a expressão de NEDD9. Os resultados mostraram que a expressão de NEDD9 fosforilada em tirosina, em vez de NEDD9 total foi significativamente reduzido, enquanto FAK ou SRC foi suprimida por PF-228 ou PP2 em células SiHa e HaCaT TGFp-estimulante (Figura 4E e 4F). Além disso, PF-228 (10? M) ou PP2 (10? M) reduziu a fosforilação de FAK ou SRC em TGFp-estimulação de células HaCaT (Figura S1). PF-228 ou PP2 suprimida invasão e migração de SiHa e células HaCaT TGF-estimulante (Figura S2). Da mesma forma, os resultados do ensaio Transwell mostrou que ambos os inibidores suprimida invasão celular e migração aumentada por sobre-expressão exógena de NEDD9 em células HaCaT (Figura 4G).

(A e B) A expressão de oncoproteínas NEDD9-associados, e FAK SRC, foi examinado por transferência de Western. Tirosina-fosforilada FAK e SRC, em vez de FAK e SRC, foram significativamente regulada para baixo, enquanto NEDD9 foi silenciado em células SiHa e HeLa. (C e D) Além disso, a tirosina-fosforilada e a FAK SRC foram significativamente regulada positivamente, enquanto NEDD9 foi exogenamente super-expresso em células HaCaT. (E e F) Os resultados de imunoprecipitação mostraram que fosforilada em tirosina NEDD9, em vez de NEDD9, foram significativamente regulada para baixo enquanto FAK ou SRC foi suprimida pela FAK inibidor PF-228 ou inibidor SRC PP2 na SiHa e TGFp-estimulação de células HaCaT. (G) Os resultados do ensaio Transwell mostrou que o aumento da invasão e migração celular por sobre-expressão exógena de NEDD9 foram reprimidas pela FAK inibidor PF-228 ou SRC PP2 inibidor em células HaCaT. barra de escala, 100 mm.

NEDD9 regula Vimentin e E-caderina nas células cancerosas cervicais

Vimentin e E-caderina eram proteínas importantes em relação à célula invasão e migração. A análise Western blot mostrou que a vimentina foi regulada para baixo e E-caderina foi regulada positivamente, enquanto NEDD9 foi suprimida por shRNA em células SiHa e HeLa (Figura 5A). Além disso, foi regulado positivamente de vimentina e E-caderina foi regulada para baixo enquanto NEDD9 foi sobre-expresso em células HaCaT (Figura 5B). Os resultados sugerem que a vimentina e E-caderina está envolvido na função reguladora de NEDD9 na migração celular e invasão em células de cancro do colo do útero. Os resultados de ensaio Transwell mostraram que a diminuição da invasão das células e a migração induzida por shRNA específico para NEDD9 foram aumentadas por transfecção de ARNsi contra a E-caderina (Figura 5C e 5D). Os resultados ainda confirmado que a E-caderina foi de uma proteína reguladora supressora na NEDD9 promoção da migração celular e invasão em células de cancro do colo do útero. Além disso, a E-caderina-regulado para baixo através de superexpressão de NEDD9 foi significativamente regulada em virtude da PF-228 ou PP2 em células HaCaT, entretanto, a expressão de vimentina-regulada foi significativamente regulada para baixo (Figura 5E). Na experiência inversa, nem tirosina-fosforilada, nem total de NEDD9 foi significativamente alterada durante a E-caderina foi suprimida por siRNA em células HaCaT (Figura 5F).

A expressão de marcadores de EMT, vimentina e E-caderina, foi examinado por transferência de Western. (A) Vimentin foi regulada para baixo e E-caderina foi regulada enquanto NEDD9 foi silenciado em células SiHa e HeLa. (B) Vimentin foi regulada e E-caderina foi regulada para baixo, enquanto NEDD9 foi sobre-expressos em células HaCaT. Os resultados de ensaio Transwell mostraram que a diminuição da invasão da célula (C) e migração (D) por shRNA de NEDD9 foram aumentadas por ARNsi contra a E-caderina nas células SiHa e HeLa. barra de escala, 100 mm. (E) E-caderina foi regulada e vimentina foi regulada para baixo em virtude da FAK inibidor PF-228 ou inibidor SRC PP2 em células HaCaT com NEDD9 exógena. (F) Resultados de imunoprecipitação mostraram que fosforilada-tirosina NEDD9 total e NEDD9 não foram significativamente regulada, enquanto a E-caderina foi suprimida por siRNA em células HaCaT.

E6 /E7 oncoproteína não regula NEDD9 na cervical células cancerosas

sabe-se que os genes E6 e E7 de HPV são os oncogenes chave para iniciar o desenvolvimento do cancro do colo do útero, mas o efeito de E6 e E7 dos genes do hospedeiro associadas com a progressão da doença ainda é incerta. Assim, observou-se possíveis ligações entre E6 /E7 e NEDD9 em células de câncer cervical. No entanto, a privação de HPV16 E6 /E7 por siARN não alterou a expressão de NEDD9 em células SiHa e CaSki HPV16-positivo (Figura 6A e 6B), vice-versa, a sub-regulação de NEDD9 não afectou a expressão de E6 /E7 (Figura 6C e 6D). Nossos resultados sugerem que NEDD9 é um evento molecular final que participa principalmente na progressão ou metástase do câncer cervical.

(A e B) O resultado da qPCR e Western blot mostrou que a privação de E6 /E7 por siRNA didn ‘t alterar a expressão de NEDD9 em células SiHa e CaSki HPV-positivos. (C e D) Interferência de NEDD9 não afetou a expressão de E6 /E7 em células SiHa e CaSki.

Discussão

Embora NEDD9 foi inicialmente identificado pela primeira vez como um dos novos genes expressos por células precursoras neurais mas regulada para baixo seguindo o desenvolvimento fetal [3], vários estudos actuais descobriram que NEDD9 sobre-expressão, como anormalidades de sinalização oncogénicos, foi associado com a metástase do cancro no cancro da mama [6,20,21], glioblastoma [9] , carcinoma de melanoma [10] e cabeça e pescoço de células escamosas (carcinoma epidermóide) [13], bem como ligada a resistência aos medicamentos em tumores do estroma gastrointestinal (GIST) [22]. Estudos recentes mostraram que NEDD9 regula TGF via no cancro da mama [23,24] e câncer hepatocelular [25] e sinalização Wnt no cancro colorectal [26]. Além disso, o TGF-p é um potente inibidor do ciclo celular em células HaCaT queratinócitos humanos, no entanto, também foi mostrado para promover a invasão e migração de células de HaCaT em [27,28]. Assim nós empregamos células HaCaT como um modelo para estudar a migração /fenótipo invasão induzido.

Ela havia sido comprovada por análise imuno-histoquímica que NEDD9 foi expressa no epitélio humano bronquiolar [29], os linfócitos humanos na membrana sinovial de artrite reumatóide [30 ], rato córtex cerebral e hipocampo neurônios [31], nevos humana e melanoma [10], encefálica embrionário murino e tubo tronco neurais [32], de início tardio doença de Alzheimer humana [33], mouse e pinto embrionário crista neural [34] , carcinoma da cabeça humana e do pescoço de células escamosas (CECP) [13]. Além disso, a análise imuno-histoquímica revelou também que NEDD9 sobre-expressão correlaciona-se com HNSCC e progressão do melanoma [10,13]. O câncer cervical possui uma característica clínica que metástase para linfonodo geralmente ocorre na fase inicial e apresenta mau prognóstico. Assim, foi detectada e comparada a expressão NEDD9 por análise imuno-histoquímica em 67 cancro do colo do útero e do colo do útero 22 tecidos normais, bem como linhas celulares de cancro do colo do útero e a linha de queratinócitos não-tumor. Os nossos resultados mostraram que a proteína NEDD9 foi sobre-expresso na maioria dos tecidos de carcinoma cervical e células em comparação com os tecidos do epitélio normal e queratinócitos não-tumorais. Além disso, descobrimos que NEDD9 superexpressão foi correlacionada com metástases em linfonodos, gradação histológica e estágio FIGO de pacientes com carcinoma do colo do útero. Nossos resultados foram semelhantes aos relatados por Lucas JT, Jr. et al [13], em CECP e por Kim M et al [10] no melanoma e sugerem que NEDD9 superexpressão podem envolver na progressão e metástase de câncer cervical.

NEDD9 proteína conserva um domínio NH2-terminal de homologia de Src 3 (SH3), que se liga à proteína contendo motivos poliprolina tais como FAK. FAK é uma das mais importantes de proteínas associadas NEDD9 especialmente na adesão focal [4]. Natarajan M et al [9] pensou que NEDD9 agiu efectores a jusante como específicas de FAK que promoveram a migração de células de glioblastoma e invasão. Encontramos no estudo que NEDD9 e FAK distribuída de forma semelhante em citoplasma das células de carcinoma SiHa HPV16 cervicais-positivo (dados não mostrados), sugerindo que talvez algumas ligações especiais entre NEDD9 e FAK. interferência de RNA (RNAi), é uma ferramenta poderosa para o silenciamento de genes específicos. Vários estudos [9,10,14,25,34-38] demonstraram que siRNAs específicos visando mRNA do gene NEDD9 são capazes de regular negativamente a expressão de NEDD9. Aqui, utilizamos o RNAi como uma ferramenta para investigar o papel de NEDD9 na progressão do cancro do colo do útero. Além disso, um vector de transferência do gene de lentivírus foi utilizado para sobre-expressar exogenamente NEDD9 no estudo. Em nossos experimentos, visando gene NEDD9 siRNAs efetivamente inibiu ambas mRNA e expressão de proteína de NEDD9. FAK e SRC foram implicados como alvos importantes de NEDD9 e eles foram fosforilada e ativada mutuamente, o que foi considerado como o “processo de regulação core” da NEDD9 [7]. Na verdade, as funções das proteínas de FAK e SRC dependem da sua fosforilação da tirosina em alguns resíduos de aminoácidos específicos nas proteínas (por exemplo, SRC de Tyr416 e Tyr397 da FAK). Assim, detectamos a fosforilação de tirosina de proteína FAK e SRC seguinte para baixo-regulação ou regulação positiva de NEDD9 e descobriu que o silenciamento de NEDD9 resultou em desfosforilação de tirosina, em vez de diminuir a expressão de ambos FAK e SRC. Curiosamente, a sobre-expressão de NEDD9 conduziu à fosforilação da tirosina de FAK e SRC. Além disso, também descobrimos tirosina-fosforilação em vez de expressão de NEDD9 foi inibida enquanto a fosforilação de tirosina da FAK-SRC ou foi suprimida por inibidores selectivos, tais como PF-228 e PP2. Muitos grupos têm encontrado NEDD9 é uma molécula a jusante da FAK e SRC que promover a migração e sinalização relacionados com a invasão [39,40]. No entanto, vários estudos têm mostrado recentemente que NEDD9 provavelmente agiu como sinal a montante da FAK e SRC [6,41]. Persistentemente reduzida FAK [6] e SRC [41] activação foi mostrado em células derivadas de NEDD9 estirpe knockout. Nossos resultados sugerem que pode haver um ciclo de feedback positivo de fosforilação de tirosina entre NEDD9 e FAK ou SRC. Assim, a fosforilação da tirosina era contínua reforçada através do assim chamado “processo de regulação do núcleo” e, finalmente, formar sinais de invasão e metástase

.

Desde a sua análise funcional inicial, em 1996, [4,5], NEDD9 foi associado com a migração , invasão e metástase em diferentes estudos. Law et al. descoberto pela primeira vez NEDD9 pode regular a polarização celular [4], que era um passo indispensável no processo de migração celular. A migração celular é a base da invasão de células cancerosas e metástases. Até agora, NEDD9 foi encontrada para participar nas metástases do cancro no glioblastoma [9], o melanoma [10], e cancro da mama. Actualmente, crê-se que a proteína NEDD9 está associado com a migração, invasão e metástases de células cancerosas [7,42]. Nossos resultados mostraram que a proteína NEDD9 foi sobre-expresso em tecidos de cancro do colo do útero com metástase. Além disso, a inibição da expressão NEDD9 por RNAi atenuada migração e invasão de células de cancro cervical. As células submetidas epitelial-mesenquimal transição (EMT) perdem a sua morfologia epitelial e adquirir um fenótipo móveis, que desempenha um papel chave na invasão e metástase [43] do cancro. Vimentina e E-caderina eram importantes biomarcadores da transição epitelial-mesenquimal (EMT). A análise Western blot mostrou que shRNA contra NEDD9 reduzida expressão de vimentina e aumento da expressão de E-caderina e a sobre-expressão regulada positivamente NEDD9 vimentina e sub-regulada de E-caderina, que é similar ao relatado por aqueles Tikhmyanova N [21]. Além disso, para baixo-regulado E-caderina através de superexpressão de NEDD9 foi significativamente regulada em virtude do inibidor da FAK ou SRC. Nem NEDD9 tirosina-fosforilada nem totais foram significativamente regulada, enquanto a E-caderina foi suprimida. Os nossos resultados sugerem que a sobre-expressão NEDD9 promove a migração e a invasão de células de cancro cervical, provavelmente, através, pelo menos parcialmente, a transição epitelial-mesenquimal (EMT) via. E-caderina é uma proteína a jusante do NEDD9 e pode ser um modulador chave de migração de células de cancro NEDD9-mediada e invasão.

é bem sabido que o papilomavírus humano (HPV) é o factor etiológico mais importante no colo do útero cancro [44]. A infecção por HPV de alto risco (HR-HPV), em especial os tipos de HPV 16 e 18, é causalmente associada ao desenvolvimento de câncer cervical. Vários relatórios estabeleceram que o HPV de alto risco (HR-HPV) as estirpes particularmente dos tipos de HPV 16 e 18 são oncogénicos, que depende dos oncogenes virais E6 e E7 que têm como alvo proteínas p53 e supressores de tumor pRb [45]. Dada a importância de E6 /E7, a hipótese que havia algumas ligações entre E6 /E7 e NEDD9 no início do estudo. No entanto, nós não estabelecer uma conexão entre E6 /E7 e NEDD9.