Abstract

A agressividade do pâncreas ductal adenocarcinoma (PDA) é caracterizada pelo seu elevado potencial metastático e da falta de terapias eficazes, que é o resultado de uma falta de compreensão dos mecanismos envolvidos na promoção metástases PDA. Foram identificados anexina A2 (ANXA2), um membro da família de proteínas de ligação a Anexina de fosfolipidos dependentes do cálcio, como uma nova molécula que promove a invasão e metástases de PDA. Encontrámos ANXA2 ser um antigénio associado a um PDA reconhecido por soros de pós-tratamento dos pacientes que demonstraram sobrevivência prolongada após o tratamento com uma vacina específica do PDA. ANXA2 aumentos de superfície celular com desenvolvimento PDA e progressão. Knockdown de expressão ANXA2 por RNA de interferência ou bloquear com anticorpos anti-ANXA2 inibe

in vitro

invasão de células de PDA. Além disso, pós-vacinação inibe o soro do paciente

in vitro

invasão de células PDA, sugerindo que os anticorpos anti-ANXA2 terapêuticos são induzidos pela vacina. Além disso, a localização da superfície celular de ANXA2 é tirosina 23-fosforilação dependente; e tirosina 23 fosforilação é necessário para a invasão de PDA. Demonstrou-se que é necessário tirosina 23 fosforilação resultando na expressão de superfície de ANXA2 para induzida por TGF-p, a transição epitelial-mesenquimal Rho-mediada (EMT), que liga a função celular de ANXA2 que foi mostrado previamente para ser associado a pequenos rearranjos do citoesqueleto regulada-GTPase , ao processo de TEM em PDA. Finalmente, usando modelos do rato PDA, mostramos que shRNA knock-down de

ANXA2

, uma mutação na tirosina 23, ou anticorpos anti-ANXA2, inibir metástases PDA e prolongar a sobrevivência mouse. Assim, ANXA2 faz parte de uma nova via molecular metástases PDA subjacentes e um novo alvo para o desenvolvimento de terapêuticas PDA

Citation:. Zheng L, Foley K, Huang L, Leubner A, Mo G, Olino K, et ai. (2011) tirosina 23 Localização de superfície celular fosforilação dependente de anexina A2 É necessário para invasão e metástases de cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (4): e19390. doi: 10.1371 /journal.pone.0019390

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de março de 2011; Aceito: 28 de março de 2011; Publicação: 29 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Zheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo SPORE NCI em Gastrointestinal Cancers P50 CA062924-14 (EMJ), Fundação Lustgarten (EMJ), Fundação Broad (EMJ), NCI R01 CA88058 (EMJ), Fundação Viragh, NIH 1K23 CA93566-01A1 (DL), ASCO Jovem Investigator Award (LZ), NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant (LZ), o Sol Goldman Pancreatic Cancer Center (LZ). Dr. Jaffee é o primeiro a receber o Dana e Albert “Cubby” Broccoli Endowed Professorship. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Eu li política da revista e têm os seguintes conflitos: Sob um acordo de licenciamento entre BioSante e da Universidade Johns Hopkins, a Universidade tem o direito de marco miliário pagamentos e royalties sobre as vendas do produto vacinal descrito neste manuscrito. Não temos quaisquer outros conflitos de interesse relevantes a serem divulgados. P. Illei deu uma palestra patrocinada pela Leica Microsystems. Isto não altera a nossa adesão a todas as PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) continua a ser um câncer letal com uma taxa de sobrevida em 5 anos global de 5% [1]. Incapacidade de diagnosticar cedo, elevado potencial metastático, e conta a resistência aos medicamentos para a sua baixa taxa de sobrevivência. Embora seja bem estabelecido que a patogênese da PDAs segue etapas graduais que exibem aumento atipia celular e acumulam mutações clonais ou expressão aberrante de oncogenes ou genes supressores de tumor, tais como

K-Ras

,

p16

,

p53

,

e DPC4 /SMAD4

[2], as drogas que atuem sobre essas anormalidades moleculares ainda não traduzido em respostas clínicas melhoradas [3]. A natureza agressiva do PDA é caracterizado pela sua elevada incidência de metástases no momento do diagnóstico inicial e incidência elevada de início metástases após ressecção cirúrgica. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares subjacentes à sua invasão e processos metastáticos. Uma melhor compreensão destes mecanismos é essencial para o desenvolvimento de tratamentos inovadores e melhorados para PDA.

abordagens de tratamento imunoterapia do cancro estão em desenvolvimento para o PDA. Desenvolvemos um alogênico, fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) secretoras vacina PDA para pacientes com PDA [4], [5], [6]. Fase I e II ensaios que avaliam esta vacina em pacientes com PDA ressecado demonstraram ambas as respostas clínicas e imunológicas [4], [5]. Esta abordagem imunoterapia fornecida reagentes de linfócitos imunizados para a identificação de novos antigénios PDA que estão sendo testados como alvos para a terapia PDA [7], [8]. Os potenciais alvos terapêuticos identificados até agora também forneceram pistas importantes para o estudo dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento PDA e metástases. Relatamos aqui a utilização de uma abordagem proteómica funcional que identificado anexina A2 (ANXA2) como um novo alvo PDA candidato da resposta imune. Além disso, mostramos que a tirosina 23 dependentes de fosforilação localização na superfície celular de anexina A2 é necessário para epitelial para mesenquimal transição, invasão e metástases formação de PDAs.

Resultados

Identificação de ANXA2 como um antigénio associado a tumores PDA candidato novo e biomarcador

Usamos imunizados soros de dois indivíduos que demonstraram tanto evidências de respostas imunes celulares pós-vacinação e prolongada sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global (OS) num estudo de fase II de um secretoras de GM-CSF PDA vacina de células inteiras [4] para o rastreio de extractos celulares integrais a partir das linhas celulares de vacina PDA que serviram como o proteoma. Os extractos de proteína foram separados por electroforese bidimensional (2-DE); e análise de imunotransf erência foi realizada para comparar o reconhecimento do antigénio pelo soro pré e pós-vacinação. proteínas reconhecidas por soros pós-vacinação soros em relação ao pré-vacinação foram identificados por espectrometria de massa. ANXA2 era uma proteína identificada nos imunotransfer�cias soro pós-vacinação de ambos os pacientes avaliados. Para avaliar ainda mais a prevalência de pós vacinação respostas humorais ao ANXA2, ANXA2 recombinante purificado foi usado para o rastreio pré-vacinação e pós-vacinação soros de 16 pacientes adicionais tratados neste estudo de fase II por ELISA e Western blot (Figura S1). anticorpos anti-ANXA2 induzida pela vacina, medidos por um ELISA em sanduíche, foi detectado em 6 de 7 pacientes que demonstraram uma DFS superior a 36 meses, [4], e apenas em um dos outros 9 pacientes que não demonstram a longo prazo DFS ( Tabela 1). Estes dados fornecem a primeira evidência de que ANXA2 é um alvo do anticorpo de respostas imunes contra o PDA.

ANXA2 é referido como sendo sobre-expresso numa variedade de cancros incluindo PDA quando comparado com tecidos normais [9]. No entanto, ANXA2 é normalmente uma proteína residente citoplasmática e luminal no tecido pancreático, e estudos anteriores [9] não determinaram se a expressão ANXA2 superfície celular é um padrão dominante nos tecidos PDA. Portanto, analisamos o local de expressão ANXA2 por imuno-histoquímica (IHQ) nos tumores ressecados de 52 dos 60 pacientes tratados em nosso estudo de Fase II para quem amostras estavam disponíveis para a coloração. Descobrimos que as células epiteliais do ducto pancreático normais apresentam coloração citoplasmática e luminal fraca por IHQ, enquanto que na superfície celular localizadas ANXA2 aumenta com a progressão de lesões pancreáticas intraepiteliais para invasivo PDA (Figura S2). Especificamente, 39 (75%) de 52 amostras de tecido de tumor pancreático fresco testados aumentaram a expressão de superfície celular de ANXA2 (Figura S2). Estes dados fornecer um apoio adicional de que a expressão de superfície ANXA2 está associada ao desenvolvimento PDA e como tal pode servir como um alvo imunológico.

A inibição da ANXA2 suprime o

in vitro

invasão de células PDA

a seguir, investigou se a localização na superfície celular de ANXA2 desempenha um papel biológico no facilitando a invasão PDA. ANXA2 tem sido relatado para se ligar fosfolípidos associados a membrana e têm diversas funções celulares, incluindo a activação do plasminogénio, a fibrinólise, transporte de membrana, o rearranjo do citoesqueleto, a angiogénese, a adesão celular e migração. ANXA2 também funciona como um receptor de elevada afinidade para vários ligandos extracelulares que foram implicados no desenvolvimento do cancro, a invasão e metástases [10], [11], [12], [13]. Para testar diretamente se ANXA2 está envolvido em PDA invasão, expressão ANXA2 foi derrubado em células PDA por interferência de RNA (Figura 1A). Knock-down de

ANXA2

suprimiu a

in vitro

invasão de células de PDA em um ensaio de câmara de Boyden (Figura 1B e Figura S3). A indução de anticorpos contra ANXA2 que é observada em pacientes vacinados com o DFS prolongada (Tabela 1) sugerem que os anticorpos anti-ANXA2 pode ter um efeito anti-tumor directo. Por isso, testou ambos os anticorpos policlonais e rato monoclonal anti-ANXA2 coelho e descobriu que eles podem inibir especificamente

in vitro

invasão de células PDA (Figura 1C, D). Além disso, soros de pacientes imunizados que demonstraram uma resposta pós-vacinação para ANXA2 semelhante inibida

in vitro

invasão de células PDA (Figura 1E). Os dados apresentados ligação medida do aumento da expressão na superfície celular de ANXA2 com capacidade de invasão PDA e sugere que as respostas de anticorpos induzidos pela vacina pode inibir este aspecto da progressão PDA. No entanto, o mecanismo pelo qual ANXA2 mediada invasão PDA ocorre ainda a ser explorado. Curiosamente, a capacidade invasiva de células de PDA não está correlacionada com a sua taxa proliferativa sugerindo um mecanismo independente (Figura S3). Para descobrir outros mecanismos de regulação que são responsáveis ​​pela capacidade de invasão de células de PDA, examinámos ainda mais a localização sub-celular de ANXA2 em várias linhas celulares de PDA por coloração fluorescente com anticorpos anti-ANXA2 (Figura S4). ANXA2 está predominantemente localizada na membrana celular em todas as linhas celulares encontrados 8 PDA ter alta capacidade de invasão, enquanto ANXA2 está presente predominantemente no citoplasma das linhas de células com baixa capacidade de invasão (Figura S4 e Tabela S1). Estes dados suportam ainda um papel para ANXA2 translocação do citossol para a superfície celular /membrana no reforço da invasão de células de PDA.

. A análise de transferência de Western que mostra que

ANXA2

siARN inibe a expressão de ANXA2 numa linha celular de PDA. Os extractos celulares totais de Panc10.05 tratadas com ARNsi de controlo e

ANXA2

siRNA, respectivamente, foram transferidas por anti-ANXA2 anticorpos (painel superior) e soro policlonal de coelho por anticorpo policlonal de coelho anti-GAPDH (painel inferior). B.

In vitro

ensaio de invasão mostrando que

ANXA2

siRNA inibe a capacidade de invasão da linha celular 10.05 PDA. células invadidas foram medidos por ensaios MTT e normalizada para o número de células totais. anticorpos anti-ANXA2 C. policlonais inibir a capacidade de invasão de células Panc10.05. anticorpos monoclonais anti-ANXA2 D. ratinho (mAb) inibir a capacidade de invasão de células de rato e Panc02 Panc10.5 humanos. Para C e D, anticorpo de coelho anti-ANXA2, controlo Ig de coelho, rato mAb anti-ANXA2 (clone: ​​ZO14), ou controlo de isotipo de IgG1 de ratinho foi adicionado no meio de cultura a uma concentração final de 25 ug /mL durante toda a

in vitro

ensaios de invasão, respectivamente. E. Apenas pós-vacinação de soros de pacientes (3,009 e 3,028) que demonstraram respostas de anticorpos anti-ANXA2, mas não a partir de pacientes (3.037 e 3.039) que não demonstram respostas de anticorpos anti-ANXA2, inibem a invasão das células Panc10.05. soros vacinação pré e pós foram adicionados ao meio de cultura a uma razão de 01:50. experiências em triplicado foram feitas para B-E.

A fosforilação de ANXA2 em Tyr23 promove a localização da superfície da célula de ANXA2 e a capacidade de invasão de células de PDA

ANXA2 é um substrato para Src quinase, que fosforila ANXA2 em Tyr23 ambos

in vivo

e

in vitro

[10], [11], [12], [13], e Tyr23 fosforilação tem sido sugerido para ser importante para espalhamento de células normais e ramificação morfogênese [14], [15]. ANXA2 também é relatado para ser tirosina fosforilada quando se localiza na superfície da célula sob o stress [16]. Uma vez que as células malignas imitam frequentemente as células normais que tenham sido sujeitas a uma variedade de estímulos de stress, postulamos que ANXA2 é translocado para a superfície da célula, como uma proteína tirosina-fosforilada durante a tumorigénese bem. Para testar isto, a fracção eluída da superfície celular de células de ANXA2 Panc10.05 PDA, que têm a localização na superfície celular de ANXA2 (Figura S4 e Tabela S1), encontrado e a fracção da superfície celular da proteína ANXA2 é, de facto, uma tirosina proteína fosforilada (Figura 2A). Em contraste, ANXA2 não podia ser eluída a partir da superfície da célula de células Panc 3.11, uma linha celular de PDA que demonstraram localização citoplasmática de ANXA2 (Figura S4). Para testar se a fosforilação de ANXA2 em Tyr23 é importante para a sua localização à superfície celular do PDA, geramos um painel de plasmídeos expressando quer de tipo selvagem ANXA2 (ANXA2

WT), a proteína mutante ANXA2 (ANXA2

Y23A) na qual Tyr23 foi alterado para um resíduo de alanina fazer um mutante não fosforilável, ou a proteína mutante ANXA2 (ANXA2

Y23E) na qual Tyr23 foi alterado para um resíduo ácido glutâmico imitando a fosforilação constitutiva. Quando as células foram transfectadas com Panc10.05 estes plasmídeos expressam GFP ANXA2 etiquetado por [17], ANXA2

WT-GFP e ANXA2

Y23E-GFP localizada predominantemente para a superfície celular de células de PDA. Em contraste, ANXA2

Y23A-GFP localizada no citoplasma (Figura 2B). Estes resultados foram confirmados por meio de um lentivírus que expressam constitutivamente ANXA2

WT, ANXA2

Y23A, ou ANXA2

Y23E nas células PDA (Figura S4). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a fosforilação em Tyr23 resulta na localização de ANXA2 na superfície da célula.

. células Panc10.05 e Panc3.11 foram incubadas quer com EGTA contendo tampão ou tampão EGTA-livre. Duas eluições diferentes a partir de duas linhas celulares diferentes de PDA, como indicado, foram imunoprecipitados por anticorpos anti-ANXA2 (pistas 1-4) ou anticorpos anti-fosfotirosina (anti-Ptyr) (pistas 9-12). Após eluição, as duas linhas de células de PDA foram lisadas e os lisados ​​foram imunoprecipitados por anticorpos anti-Ptyr (pistas 5-8). ANXA2 B. GFP-marcado em células Panc10.05. painéis superiores: sinais GFP; painéis inferiores: sobreposto imagens de sinais de GFP e coloração com DAPI de núcleos. expressão C. FLAG-marcado ANXA2 em células Panc10.05 transfectadas apenas com o vector plasmídeo baseado em pcDNA (pistas 1,5,9,13), o plasmídeo portador ANXA2

WT-FLAG (pistas 2,6,10, 14), o plasmídeo portador ANXA2

Y23A-FLAG (pistas 3,7,11,15) ou o plasmídeo portador ANXA2

Y23E-FLAG (pistas 4,8,12,16). Os extractos celulares totais (WCE) (pistas 1-4), fracções de membranas celulares (pistas 5-8, 13-16), ou fracções citoplásmicas (pistas 9-12) foram isolados por fraccionamento bioquímico das células Panc10.05 PDA, respectivamente e imunoprecipitadas utilizando tanto anticorpos anti-FLAG M2 (faixas 1-12) ou anticorpos anti-fosfotirosina (anti-ptyr) (pistas 13-16). Os imunoprecipitados foram apagados utilizando anticorpos anti-FLAG M2. D.

In vitro

invasão de células Panc10.05. E.

In vitro

invasão de células Panc3.11. Para ambos D e E, as células foram transfectadas com o vector de plasmídeo baseado em vazio pcDNA (pistas 1,2), o plasmídeo que transporta ANXA2

WT-FLAG (pista 3), o plasmídeo que transporta ANXA2

Y23A-FLAG ( pista 4), ou o plasmídeo portador ANXA2

Y23E-FLAG (pista 5). Pista 1 foi também co-transfectados com o siRNA de controlo precipitação. Lanes 2-5 também foram cotransfectadas com

ANXA2

siRNA duplex. Os resultados de experiências em duplicado estão apresentados.

Para determinar se a mudança em ANXA2 localização que ocorre como um resultado da Tyr23 fosforilação afecta a capacidade de invasão de células de PDA, um conjunto de plasmídeos que expressam FLAG-exógeno etiquetado ANXA2 incluindo ANXA2

WT-FLAG, ANXA2

Y23A-FLAG, e ANXA2

Y23E-FLAG foram desenvolvidos. Estes vectores são resistentes porque a interferência de ARN de mutações silenciosas no local alvo do siRNA. células Panc10.05 PDA transfectadas com estes plasmídeos foram fraccionados em fracções de membrana citoplasmática e células (Figura S4). Em primeiro lugar, confirmou que apenas ANXA2

WT-FLAG e ANXA2

Y23E-FLAG, mas não ANXA2

Y23A-FLAG, localizar a fração de membrana celular (Figura 2C). Como esperado, a proteína ANXA2

WT-FLAG é tirosina fosforilada na fração de membrana celular. Em seguida, descobriu-se que co-transfecção do plasmídeo pcDNA expressar ANXA2

WT-FLAG ou ANXA2

Y23E-FLAG, mas não ANXA2

Y23A-FLAG, com o siRNA (para inibir ANXA2 endógena), inverteu inibição mediada por siARN da invasão de células Panc10.05 (Figura 2D). No entanto, em células com fraca capacidade de invasão e só localização citoplasmática de ANXA2, tais como Panc3.11 (Tabela S1), o co-transfecção com ANXA2

Y23E-FLAG ignora o mecanismo de regulação da fosforilação imitando fosforilação constitutiva e promove a invasão de Panc3.11 células (Figura 2E). Estes dados sugerem que a Tyr23 ANXA2 fosforilada confere capacidade de invasão de PDA.

ANXA2 contribui para o epitelial-mesenquimal as células de transição de PDA

fosforilado ANXA2 desempenha um papel na dispersão celular em processos de morfogénese normal [14] , [15]. Os dados até agora apoiam um papel para ANXA2 fosforilada em PDA invasão. O epitelial para mesenquimal (EMT), que regulamenta o processo de morphogenic normal durante reestruturação desenvolvimento e tecido embrionário, e os passos iniciais de invasão e metástases são sugeridas para imitar EMT [18]. Por isso, procurou-se determinar se ANXA2 é necessária para a EMT em células de PDA. EMT é caracterizada pela supressão da transcrição de marcadores epiteliais, tais como a E-caderina e a indução de marcadores de mesenquimais, tais como lesma e vimentina. ANXA2 foi reportado para mediar EMT-TGFp activado durante o processo de desenvolvimento da válvula cardíaca [19]. Além disso, o TGF-p é relatado para induzir EMT em células cultivadas PDA [20], [21]. Para examinar se ANXA2 tem um papel direto no processo EMT de invadir células PDA, um vetor lentiviral contendo

ANXA2

shRNA foi usada para atingir a supressão de longo prazo de ANXA2 em células PDA (Figura S3). -PCR em tempo real A análise mostrou que a E-caderina foi suprimida, enquanto que lesma e vimentina foram induzidas durante EMT induzida por TGF-p em células Panc10.05 com shRNA controle, mas não em indivíduos infectados com

ANXA2

shRNA (Figura 3A ). Além disso, a expressão da proteína E-caderina foi suprimida em células tratadas com TGFp com shRNA controle, mas permaneceu inalterada em células tratadas com TGFp que também expressas

ANXA2

shRNA (Figura 3B, C). Como previsto, as células PDA sem

ANXA2

shRNA perder seu fenótipo adesão célula-célula e de dispersão em torno do deslizamento cultura após o tratamento TGF, uma reminiscência de um padrão de EMT (Figura 3B). Embora ANXA2 ainda não tenha sido mostrado para ser envolvido em SMAD4 EMT-mediada, tem sido mostrado para ser envolvido em Rho GTPases pequenas) (mediada por separação celular, uma característica de EMT [15]. Portanto, também se avaliou Rho medeia ANXA2 EMT-associado em PDA e verificou que a activação de Rho não é detectada nas células de PDA com inibição de shRNA ANXA2 após o tratamento TGFp (Figura 3C). Estes resultados demonstram que a perda de expressão ANXA2 leva à perda de EMT TGFp-Ró-mediada em células de PDA.

. A análise quantitativa PCR em tempo real da E-caderina, lesma, e expressão de mRNA vimentina em células Panc10.05 PDA com e sem knockdown de ANXA2 por shRNA. Os rácios relativos de expressão de ARNm de TGF-p1 com tratamento contra TGF-p1, sem tratamento são mostrados. Os dados foram normalizados com expressão β-actina. B. O mesmo par de células PDA empregues no painel A foram tratados com TGF-p1 de 0, 36, ou 72 horas, respectivamente, e, em seguida, colhidas para a imunocoloração com anticorpos anti-E-caderina e anticorpos secundários conjugados com PE. DAPI foi utilizado para corar os núcleos. C. O mesmo par de células PDA empregues no painel A foram tratados com TGF-p1 de 0, 36, ou 72 horas, respectivamente, e em seguida colhido. Uma fracção de extracto celular foi utilizado para a análise de Western Blot e foi corada com anticorpos anti-E-caherin, anti-RhoA, B, C, ou anticorpos anti-p-actina como controlo interno, respectivamente. O extrato de células remanescente foi submetido a um pull down ensaio através de uma coluna de afinidade que se liga especificamente activado, formas GTP-bound de Rho. Isto foi seguido por análise Western blot com anticorpos anti-Rho. Note-se que anti-Rho anticorpos reconhecem Rho A, B e C, cujos pesos moleculares são ligeiramente diferentes, o que resulta em duas bandas no gel. Controle designa as células com shRNA controle;

ANXA2

shRNA designa as células com

ANXA2

shRNA. D. quantitativo em tempo real A análise de PCR de E-caderina, lesma, e a expressão de ARNm em vimentina um par de linhas celulares Panc10.05 PDA infectadas com lentivírus que expressam o tipo selvagem ANXA2 (ANXA2-WT) ou Y23A ANXA2 mutado (ANXA2-Y23A ), respectivamente. Os rácios relativos de expressão de ARNm de TGF-p1 com o tratamento (indicada com +) em comparação com o tratamento sem TGF-p1 (indicado com -) são mostrados. Os dados foram normalizados com expressão β-actina.

A seguir, analisou se Tyr23 fosforilação é importante para EMT ANXA2 mediada em células de PDA. Observou-se que o ANXA2 endógena não se localiza para a superfície celular nas células que expressam a variante de perda de Y23A local tirosina ANXA2

(Figura S4). Além disso, a transfecção com ANXA2

Y23A-FLAG inibe a invasão de células Panc10.05 (Figura S4), sugerindo que ANXA2

Y23A tem um efeito negativo dominante. Consistente com os dados publicados [22], verificou-se que ANXA2

Y23A ainda se pode ligar ao seu parceiro de S100A10 /p11 [23] no citosol, mas não na membrana celular (Figura S5). Portanto, overexpressed, ANXA2 citoplasmática-localizada

Y23A pode sequestrar toda a S100A10 /p11 no citosol, conferindo assim um efeito negativo dominante. Portanto, aproveitando o efeito negativo dominante de ANXA2

Y23A, e empregando este ANXA2

Y23A mutante, que demonstrou ainda que EMT é induzida por TGF-p em células que expressam ANXA2

WT, mas não em células que expressam ANXA2

Y23A (Figura 3D). Assim, estes dados demonstram ainda que a fosforilação de Tyr23 ANXA2 promove o EMT de células PDA e é um mecanismo através do qual concebível ANXA2 localiza na membrana celular PDA e confere um potencial para células para invadir PDA.

e Expressão fosforilação da tirosina de ANXA2 são necessários para PDA metastático

in vivo

invasão local por células tumorais é um passo conhecido no processo de metástase. Nossos dados demonstram que ANXA2 facilita a invasão de células PDA

in vitro

. Nós portanto empregue um modelo de murídeo transplantáveis ​​cancro pancreático de metástases (Figura S6) para avaliar o papel da expressão ANXA2, fosforilação, e a localização da superfície da célula no processo de metástase PDA

In vivo

. Neste modelo, 100% dos murganhos morreu com metástases do fígado em aproximadamente 4-6 semanas (Figura 4A) após a injecção do baço de 2 × 10

6 Panc02 PDA células de murino. células Panc02 infectado com um expressando lentivírus GFP transportando shRNA específico para

ANXA2

knockdown ou shRNA controle foram classificadas para as células GFP positivas por FACS.