Abstract

A capacidade-homing tumor de monócitos torna um sistema de entrega de celular potencial de terapias alternativas de câncer, embora sua capacidade migratória pode ser prejudicada seguinte captação de reagente. Abordagens que melhoram homing tumor monócitos e promover a sua migração irá melhorar o valor clínico destas células como operadoras de celular. Estudos anteriores demonstraram que a irradiação (IV) pode promover a agregação dos macrófagos em regiões hipóxicas. Para investigar se IR aumenta a infiltração de monócitos derivadas da medula óssea (BMDMs) em tumores, a infiltração de BMDMs a partir de ratinhos transgénicos GFP- num modelo TRAMP-C1 adenocarcinoma da próstata de murideo foi examinado por microscopia de fluorescência. IR não aumentou o número de BMDMs que se infiltrou inicialmente, mas fez aumentar a retenção de monócitos nos tumores tratados com IR de até 2 semanas. Também mostrou que BMDMs pode levar até vários imagiologia e agentes terapêuticos, embora a mobilidade de BMDMs diminuiu com o aumento da carga. Quando BMDMs foram diferenciadas in-tratados IR meio condicionado-tumoral (IR-CM)

in vitro

, a inibição mediada por carga de nanopartículas de migração foi atenuada. Estes BMDMs IR-CM diferenciadas entregue vesículas encapsulando doxorubicina de polímero para a terapia de radiação (RT) induzida por regiões de tumor hipóxicas, e aumentada a eficácia da RT. A retenção prolongada de monócitos nos tecidos tumorais irradiadas ea capacidade de IR-CM para aumentar a capacidade migratória de BMDMs carga-laden sugerem que monócitos pré-condicionadas por IR-CM pode potencialmente agir como portadores celulares para terapia-alvo seguinte RT convencional.

Citation: Jiang PS, Yu CF, Yen CY, Woo CW, Lo SH, Huang YK, et al. (2015) A irradiação aumenta a capacidade dos monócitos como nanopartículas de operadora para terapia do câncer. PLoS ONE 10 (9): e0139043. doi: 10.1371 /journal.pone.0139043

editor: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Alemanha |

Recebido: 09 de junho de 2015; Aceito: 07 de setembro de 2015; Publicação: 29 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Jiang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho é apoiado pelo NSC 101-2627-N-007-001, INDH-EX100-9827BI e 102N2767E1 do Conselho Nacional de Ciência, Saúde Nacional Instituto de Pesquisa e Tsing Hua Universidade Nacional, respectivamente, Taiwan, a Chi-Shiun Chiang, e CIRPG3D0141 e CMRPG3E1301 de Chang-Gung Memorial Hospital de Ji-Hong Kong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a tendência de sangue monócitos /macrófagos para se infiltrar tumores e acumular nas regiões de hipoxia [1, 2] fez essas células um potencial veículo de celular para a segmentação agentes terapêuticos aos locais tumorais [3, 4] e, portanto, solicitado a investigação sobre a utilização de monócitos ou macrófagos como veículos de entrega em terapêutica antiviral [5] ou anticancro [3, 4, 6, 7]. O conceito de adoptively transferência

ex vivo

-generated macrófagos em pacientes com câncer foi proposta muito tempo atrás. Este tipo de transferência adoptiva foi realizada pela primeira vez no modelo de melanoma B16, em que a infusão de

ex vivo

-activated macrófagos suprimida metástases pulmonares [8]. Muthana

et al

. [4], recentemente demonstrou uma aplicação clínica promissora para os macrófagos derivados de monócitos do sangue humano, que foram capazes de entregar vírus oncolítico para as áreas hipóxicas de tumores da próstata humanos após a terapia num modelo de xenoenxerto de ortotópico. Isto indica que os monócitos podem ser utilizados como transportadores celulares para o tratamento de tumores hipóxicos. Embora os relatórios demonstraram que os macrófagos associados a tumores (TAMs) são preferencialmente localizados nas regiões hipóxicas [2], que demonstraram anteriormente que a associação de TAM com hipóxia é dependente do tipo de tumor e pistas microambiente locais [9, 10]. Abordagens que podem melhorar o tráfico e tecido retenção de monócitos dentro das regiões de hipóxia vai aumentar o valor clínico do uso de monócitos como operadoras de celular na terapia do câncer.

O recrutamento de várias células derivadas da medula óssea transmitidas pelo sangue (BMDCs) em tecidos de tumor tem sido descrita em numerosos modelos de cancro em resposta a sinais gerados por inflamatórias tecidos tumorais. Depois de se infiltrarem os tumores, monócitos /macrófagos, em seguida, migrar ao longo de gradientes definidos quimiotáticos [11], como gradientes de HIF-1 [2, 12], VEGF [13] áreas, ou SDF-1 [14], para segmentar. Os tratamentos que podem suscitar reacções inflamatórias, assim como sinais de hipoxia podem ser usados ​​para melhorar a eficácia de monócitos como transportadores celulares. A terapia de radiação (RT) é um protocolo comum na terapia do cancro e podem gerar respostas inflamatórias [15]. Na verdade, temos mostrado previamente que os tratados com radiação, mas não anti-angiogênese tratados com agente, tumores [10] ou tecidos [16] promover a acumulação de CD68

+ TAM em regiões de hipóxia avascular [9]. Isso indica que os tumores ou tecidos tratados com radiação produzir fatores específicos que atrair e reter os macrófagos em avascular, locais de tumor hipóxicas.

A capacidade de engolir várias partículas torna macrófagos superiores como veículos, em comparação com outros tipos de células [17-20 ]; por conseguinte, a utilização de macrófagos como transportadores celulares para as nanopartículas terapêuticas ou de imagem foi examinada em vários modelos [5, 6, 21-24]. Em adição ao facto de que eles são bons transportadoras, a mobilidade das células seguintes pré-carregamento com reagentes é um outro factor que determina a sua utilidade na clínica; por exemplo, a mobilidade dos macrófagos alveolares diminui após a absorção de partículas [25]. No entanto, poucos estudos têm investigado as alterações na mobilidade de macrófagos após a absorção de drogas terapêuticas. Aqui, nós exploramos a mudança na mobilidade macrófagos seguinte absorção de nanopartículas, e avaliou os efeitos da irradiação (IR) sobre o recrutamento e retenção de monócitos derivadas da medula óssea (BMDMs) em um modelo de tumor de próstata murino.

Materiais e Métodos

células e Animais

a linha de células de cancro da próstata TRAMP-C1 foi comprado da coleção American Type Tissue (ATCC; CRL-2730). De seis a oito semanas de idade C57BL /6J ou murganhos C57BL /6-Tg (CAG-EGFP) ratinhos 1Osb /J foram adquiridos a partir do centro de Animais de Laboratório Nacional, Taiwan. As recomendações do guia aprovado para o cuidado e uso de animais de laboratório pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional Tsing Hua, Taiwan (número aprovado: IACUC: 10012), foram seguidas em todos os momentos. Os tumores foram gerados por inoculação intramuscular de 3 × 10

6 células viáveis ​​na coxa. Os tumores na coxa foram medidos por grosseiramente calibre em três eixos ortogonais, para determinar os volumes tumorais.

Preparação de monócitos derivadas da medula óssea (BMDMs).

Células da medula óssea foram recolhidas a partir de murganhos C57BL /6J ou camundongos C57BL /6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb /J por rubor os fémur ea tíbia, com 2% de soro fetal bovino (FBS) em Roswell Park Memorial Institute meio (RPMI). As células foram então cultivadas em meio de diferenciação (meio RPMI contendo 10% de FBS, 10 ng /ml de ratinho recombinante de M-CSF (R D)) durante 24 h. As células não aderentes foram recolhidas e cultivadas em placa de cultura de fixação ultrabaixa (Cat #:. 28009033, Corning). As células foram adicionalmente diferenciadas em meio de diferenciação durante 7 dias. O meio de diferenciação foi mudado a cada 2 dias. As células foram então cultivadas mais um dia em meio condicionado antes da experiência. O meio condicionado foi feita de 50% de meio de diferenciação e 50% de meio de células tumorais irradiadas ou não irradiadas. As células foram irradiadas em fase log em 70 Gy ou simulada irradiadas usando uma fonte de cobalto com uma taxa de dose de 10 Gy /minuto na ciência e tecnologia nuclear Development Center, Universidade Nacional Tsing Hua, Taiwan. Um dia após a irradiação, o meio foi recolhido, centrifugado para remover os detritos, e passado através de 2 um filtro.

A citometria de fluxo de ensaio

-se alíquotas de células (5 x 10

5) foram bloqueadas em soro de cabra normal a 10% em PBS durante 15 minutos à temperatura ambiente, seguido por incubação com um anticorpo conjugado com corante fluorescente: anti-murganho de CD11b anticorpos monoclonais conjugados com FITC, PE-conjugado anti-rato de anticorpo monoclonal de CD45, conjugado com FITC F4 anti-rato /80 anticorpo monoclonal, as células de rato anti CD68 conjugados com FITC anticorpo monoclonal, ou anti-murganho de anticorpo monoclonal CD206 conjugado com PE durante 45 minutos em gelo. Todos os anticorpos foram adquiridos a BD Biosciences (San José, CA, EUA). As células foram lavadas três vezes em PBS e analisadas por citometria de fluxo FACSCantoII (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA)).

A absorção de nanopartículas por BMDMs

Vários nanopartículas, tais como perfluropentane Dio-marcado gotícula preparado pelo Prof. Chi-Kuang Yeh [26], 3,3-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) bolhas de polímero -laden PAAC-d25 e doxorrubicina (Dox) -loaded vesículas PAAC-d15 (PAAC-Dox) preparados pelo Prof. Hsin -chen Chiu [27, 28] foram cultivadas com BMDMs durante 4 h. BMDMs pré-carregado com PAAC-Dox foram utilizados para

in vitro

estudo.

In vitro migração ensaio

O ensaio de migração foi realizada como os procedimentos descritos na publicação anterior { Wang, 2012 # 250}. Cada ensaio foi realizado em triplicado e repetidos 3 vezes.

In vivo Modelo de tumor

Os tumores foram deixados crescer para um tamanho de 5 mm de diâmetro e, em seguida, tratada por 6-MV raios-X a partir de um acelerador linear e uma taxa de dose de 2-3 Gy /min e um bolus de 1,5 cm na superfície. Os produtos químicos ou BMDMs (5 x 10

6 células /ratinho) foram intravenosamente (i.v.) injectado a 1, 4 e 7 dias após a dose única de 25 Gy. A quantidade de Dox dentro de 5 x 10

6 células de BMDMs (isto é. BMDMs-PAAC-Dox) foi determinada por DOX intensidade de fluorescência a 560 nm de lisados ​​celulares e a concentração de Dox de todos os tratamentos foi ajustada para se certificar de que todos os ratos foram injectados com mesma quantidade de Dox, que era equivalente a 1 mg Dox /kg de peso corporal. O tamanho do tumor foi medido duas ~ três vezes por semana por compassos de calibre antes de serem sacrificados para análise histológica.

A imuno-histoquímica e análise de imagem

A preparação do tecido e procedimentos de coloração foram as mesmas conforme descrito na publicação anterior {Chen , 2009 # 176}. hipoxia do tumor foi estudado por via i.p. injecção de 4 mg de cloridrato de pimonidazole (Hypoxyprobe ™ -1 Kit, Hypoxyprobe, Burlington, MA, EUA) em 0,1 ml de solução de 1 h antes da colheita do tumor. Os tecidos foram removidos e colocados em frio paraformaldeído a 4% durante a noite e, em seguida, o processamento de inclusão em parafina ou PTU. Dez micrômetros secções de criostato foram fixadas em metanol a -20 ° C durante 10 min, e depois re-hidratadas em PBS. A ligação não específica foi bloqueada por incubação em secções de 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS durante 30 min. Pimonidazole (PIMO) foi detectado com anticorpo de ratinho (Hypoxyprobe) e de cabra anti-ratinho IgGγ1 Alexa 488 (Invitrogen). Para detectar hipoxia do tumor e a sua associação com células endoteliais vasculares, co-coloração foi realizada com um anticorpo monoclonal de ratinho (Hypoxyprobe-1 Kit; Chemicon) e um anticorpo de rato anti-ratinho CD31 (BD Biosciences). Para identificar macrófagos, rato anti-F4 /80 (Serotec, Oxford, Reino Unido), de rato anti-CD68 (Serotec, Oxford, Reino Unido), de rato anti-CD11b (biociências BD) e de rato anti-CD45 (BD foram utilizados biosciences). Os anticorpos primários foram detectados utilizando anticorpos secundários marcados com os fluorocromos Alexa Fluor 594 (Molecular Probes), Alexa 488, ou anti-coelho FITC (BD Biosciences). Para quantificar eventos positivos, cada tumor foi seccionados, 5 seções 100 mm além foram coradas, as imagens foram capturadas por AxioCam MRC-5 câmera em um microscópio de fluorescência Axiovert40 (Cuidados Zeiss, Güttingen, Alemanha) ou Laser Scanning microscópio confocal (FluoView 1000, Olympus, Japão), e o número total de evento positivo foi analisada por imagem-Pro 6 (Media Cybernetics) por rato (n ≧ 3 ratos por grupo).

a análise estatística

as análises estatísticas foram realizados utilizando o software GraphPad Prism 5 (GraphPad software, Inc., CA, EUA). Para todas as comparações, a significância estatística foi testada por ANOVA de uma via ou teste t de Student, e

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A infiltração e diferenciação de BMDMs em tumores estabelecidos

Para examinar se BMDMs poderia agir como portadores celulares em radioterapia do cancro, GFP-BMDMs se por via intravenosa (iv) injectado em ratos C57BL /6J com diâmetro tumores TRAMP-C1 5-mm na coxa após uma única dose de 25 Gy de radiação. A microscopia de fluorescência do tumor mostraram que a GFP

+ células começaram a aparecer nas bordas tumorais 1 dia após a injecção (Fig S1), apesar de não haver diferença significativa entre o controlo e os tumores tratados com IR (Fig 1AA 1AB e). Uma semana após a injecção (Fig 1AC 1AD e), o número de GFP

+ células aumentou e eles foram indiscriminadamente distribuído por todo o tecido do tumor. Embora estes GFP

+ células ainda podia ser detectada em tumores tratados com IR após duas semanas (Figura 1A-1F), apenas alguns permaneceram nos tumores de controlo (Figura 1A-1E). Contando de GFP

+ células confirmou que os tumores tratados com IR teve mais

células GFP + do que tiveram os tumores de controlo depois de ambos os 1 e 2 semanas (Fig 1B).

(A) microscopia de fluorescência de detecção de de GFP-BMDMs dentro dos tecidos de tumor cerebral em um dia (a e b), uma semana (c e d), ou duas semanas (e e F), após a injecção intravenosa de 2 x 10

6-GFP BMDMs. A seta aponta para as células ampliadas na praça interna. A barra de susto = 50 mm. (B) A quantificação de GFP + células dentro dos tecidos tumorais. Os dados representam o número médio de GFP + células de cada secção do tumor inteiro de 3 tecidos tumorais foi contado sob 40X len objectivo. Barra: SE de 3 tumores de cada tratamento. ***: P 0,005 pelo teste t de Student.

Para melhor caracterizar o fenótipo da infiltração GFP-BMDMs, citometria de fluxo (Fig 2) e imuno-histoquímica (IHQ) (S2 Fig) foram usadas para avaliar as alterações fenotípicas GFP-BMDMs

in vitro

e

in vivo

, respectivamente. Após 8 dias de diferenciação

In vitro

, todos GFP-BMDMs expressa CD45 e CD11b, enquanto que 85,4% ± 1,9%, expresso F4 ​​/80 e 61,0% ± 1,7%, expresso CD68

+ (Fig 2A). Quantificação da coloração nos tecidos de tumor demonstraram que 97% de GFP

+ células em tumores de controlo também expressa CD45, 85%, expresso CD11b, 62%, expresso F4 ​​/80, e aproximadamente 47% eram CD68

+ (Figura 2B) . Estes rácios não se alterou ao longo do tempo, embora estas proporções foram ligeiramente mais baixos em comparação com os

in vitro

resultados. tratamento IV (25 Gy) não alterou significativamente a proporção de CD45

+ GFP

+ e CD11b

+ GFP

+ células, embora houvesse um aumento significativo no número de CD68

+ GFP

+ e F4 /80

+ GFP

+ células 1 semana após o IR (Fig 2B).

(a) A percentagem de GFP + células co-expressa CD45, CD11b, antigénio F4 /80, ou CD68, tal como testado por citometria de fluxo para os monócitos diferenciados a partir das células da medula óssea colhidas de ratinhos C57BL /6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb /J

in vitro. Bar: SE de 3 experiências independentes. (B) A percentagem de GFP + células CD45 co-expressa, CD11b, F4 /80, ou antigénio CD68 examinada por imuno-histoquimica (IHC), dentro dos tumores retirados de um dia ou uma semana após 25 Gy de irradiação (IV) ou vergonha irradiada ( Ao controle). A porcentagem média de cada marcador de superfície da GFP + células de 5 campos aleatoriamente selecionados de cada tumor de 3 tecidos tumorais foi contado sob 40X len objectivo. Bar: SE de 3 amostras de tumor. ***:. P 0,005 pelos testes ANOVA

irradiado TRAMP-C1 meio condicionado-tumoral promove a migração de BMDMs direção condicionado tumor médio

Para examinar se microambientes tumorais produzem fatores que promovem a migração de monócitos, a capacidade migratória de BMDMs em vários meios condicionados foi examinada através de um ensaio de câmara de Boyden. meio de TRAMP-C1-condicionado (t-CM) foi mais eficaz do que o meio normal de cultura (CTRL) ou meio contendo 10 ng /ml de RM-CSF a eliciar a migração BMDM (Fig 3A). No entanto, a taxa de migração de BMDMs em relação irradiado forma TRAMP-C1-condicionado (IR-CM) ou um outro meio condicionado por murino ALTS1C1 linha celular de astrocitoma (A-CM) foi semelhante àquela em que estas células que migraram em direcção ao T-CM. Isto indica que microambientes tumorais expressam factores que atraem os monócitos, e explica porque GFP-BMDMs têm uma taxa de infiltração inicial semelhante para o controlo e irradiadas com TRAMP-C1 tumores. No entanto, estes dados não podem explicar por que os tumores irradiados contêm mais GFP-BMDMs em 1 e 2 semanas após a RT. Continuar a analisar se os tecidos irradiados afetar BMDM capacidade migratória, BMDMs foram pré-condicionadas em meios condicionados diferentes durante 1 dia antes do ensaio de migração. Descobrimos que BMDMs pré-condicionado no T-CM demonstrou maior capacidade migratória em direção a T-CM do que meio de diferenciação normal (CTRL), e esta capacidade foi reforçada se BMDMs foram primeiro cultivadas em IR-T-CM (Fig 3B). No entanto, ambas as pré-condições não afectou a migração de BMDMs para meio de cultura normal (Fig S3). Além disso, este efeito foi específico do tumor, tal como células migraram mais rapidamente para meio TRAMP-C1-ar, do que para o meio condicionado-ALTS1C1 (IV-A-CM * na Fig 3B). Juntos, estes resultados indicam que, depois de entrar microambientes tumorais irradiadas, os macrófagos podem obter uma maior capacidade de migrar no interior dos tumores.

(A) A comparação da capacidade de migração de monócitos em relação a forma condição diferente no interior da câmara inferior. CTRL: meio de cultura celular Regular. RM-CSF: meio de cultura celular normal contendo 10 ng /ml de RM-CSF. T-CM: medium TRAMP-C1condition sham-irradiado. IR-T-CM: medium condição TRAMP-C1 70 Gy irradiado. A-CM: medium condição ALTS1C1 irradiado-Sham. (B) A influência do pré-condição na capacidade de migração BMDM. CTRL *: BMDMs foram pré-condicionados no soro diferencial normal e depois examinados para a migração para o meio de cultura regulares normal. CTRL: BMDMs foram pré-condicionadas em meio diferencial normal e depois examinados para a migração para T-CM. T-CM: BMDMs foram pré-condicionadas em T-CM, durante 24 horas e depois examinados para a migração para T-CM. IR-T-CM: BMDMs foram pré-condicionadas em irradiado T-CM, durante 24 horas e depois examinados para a migração para T-CM. IR-A-CM *: BMDMs foram pré-condicionadas em irradiado T-CM, durante 24 horas e depois examinados para a migração para A-CM. Bar: SE por 8-10 campos selecionados aleatoriamente de cada poço de 3 experiências independentes. **: P 0,01; ***: P 0,005; NS:. P 0,05 por um teste ANOVA maneira

Para explorar ainda mais os efeitos da pré-condicionado sobre a capacidade migratória de macrófagos, citometria de fluxo foi utilizado para examinar a expressão de diferenciação associados-macrófago marcadores CD45, CD11b, CD68, F4 /80 e CD206 tentar caracterizar os fenótipos de macrófagos. A percentagem de cada marcador de superfície não diferiram significativamente entre os BMDMs de controle e os pré-condicionado no IR-T-CM (Fig 4A). Além disso, o fluxo de histogramas de citometria de mostrar que a intensidade média de fluorescência (MFI) destes marcadores de superfície em BMDMs controle versus IV-CM BMDMs também não diferiram significativamente (S4 figura), com a excepção de CD68 (Figura 4B) e F4 /80 ( Figura 4C). O pico CD68 única (MFI: 770) em BMDMs controle aumentado e dividida em dois picos, ou seja, CD68

médio e CD68

picos de alta, com as IMFs de 787 e 4337, respectivamente (Fig 4B). O MFI de F4 /80 diminuiu 9,7-5,7. Embora não tenhamos sido capazes de identificar o principal fator que contribui para esta diferença, estes resultados indicam que a cultura de um dia em RT-CM durante a diferenciação pode alterar o fenótipo e migratórias características de BMDMs.

(A) A percentagem de células contendo BMDM CD45, CD11b, CD68, F4 /80, ou antigénios de superfície CD206 foi examinado por citometria de fluxo. CTRL: células derivadas de medula óssea foram diferenciadas em meio normal de diferenciação BMDM durante 8 dias. IR-t-CM: células derivadas de medula óssea foram diferenciadas em meio normal de diferenciação BMDM durante 7 dias e ainda cultivadas em meio condição TRAMP-C1 irradiado (IR-t-CM) durante 24 horas. (B) O histograma da intensidade de anticorpo anti-CD68 conjugado com FITC para BMDM diferenciado de forma condição diferente. (C) O histograma da intensidade de anticorpo /80 conjugado com FITC anti-F4 para BMDM diferenciado de forma condição diferente. Bar:. SE de 3 experimentos independentes

BMDMs Pré-condicionado recuperados de induzida por absorção de perda de migração

Muitos estudos têm mostrado que os monócitos e macrófagos têm uma grande capacidade para a tomada de vário nanopartículas [17-20]. Neste estudo, BMDMs foram capazes de levar até nanopartículas (S5 FIG), tais como bolhas de DIO-carregados PAAC-D25 polímero, vesículas PAAC-d15 Dox-carregados, e gotículas perf DIO-rotulados. Em modelos experimentais com vesículas PAAC-d15 Dox-carregados e gotículas perf DIO-rotulados, a mobilidade BMDM diminuiu depois de tomar-se as partículas (Fig 5a), como mostrado através de ensaios de migração, e um ensaio de titulação mostrou que a mobilidade BMDM negativamente correlacionada com a quantidade de partículas pré-carregada (Fig 5B e 5C). Embora esses dados confirmam que BMDMs podem ser portadores celulares para a criação de imagens ou nanopartículas terapêuticas, eles também indicam que BMDM migração é alterado após a absorção de carga. No entanto, a perda de migração induzida por carga útil foi atenuado em BMDMs IR-T-CM-derivados, embora essas células eram ainda mais lento do que BMDMs un-carregado, pré-condicionado (Fig 5D)

.

(A) A taxa de migração de BMDM é diminuída após uptaking-se as vesículas PAAC-d15 Dox-carregados ou gotículas perf Dio-lableled. (B) Um ensaio de titulação para a relação inversa entre a quantidade de vesículas PAAC-D15 Dox-carregados (tal como mostrado pela MFI de Dox no eixo esquerdo medido por citometria de fluxo) e o número de BMDM migraram através da câmara de Boyden (como mostrado pela as contagens /campo no eixo da direita). (C) Um ensaio de titulação para a relação inversa entre a quantidade Dio-rotulados gotículas perfluoropentano (como mostrado pela MFI de DiO no eixo esquerdo) e o número de BMDM migraram através da câmara de Boyden (como mostrado pelas contagens /campo no eixo direito ). (D) A comparação da taxa de migração de BMDM pré-cultivadas em regulares (CTRL) contra RI-T-CM (pré-condição) durante 24 horas. Bar: SE por 8-10 campos selecionados aleatoriamente de cada poço de 3 experiências independentes. ***: P 0,005; **: P 0,01 por testes ANOVA

entrega BMDM de nanopartículas terapêuticas aumenta a eficácia da radiação therap

y

Para determinar se pré. BMDMs condicionado pode levar nanopartículas carregadas com fármaco como um adjuvante para a radioterapia, doxorrubicina (Dox) foi encapsulado primeiramente em vesículas PAAC-D15, que pode impedir a citotoxicidade induzida por Dox em macrófagos por até 72 h

in vitro

( dados não mostrados). BMDMs foram primeiro pré-cultivadas em RI-T-MC para um dia, em seguida, com vesículas PAAC-D15 Dox-encapsulada (PAAC-Dox) durante 4 h antes da injecção. A concentração de vesículas PAAC-Dox foi determinado por uma curva de titulação (Figura 5) para optimizar a carga Dox contra a atenuação da taxa de migração. A concentração de Dox dentro BMDMs foi quantificado espectrometricamente e foi utilizado para avaliar a quantidade de Dox e PAAC-Dox administrada (equivalente a 1 mg Dox /kg de peso corporal). Livre Dox, PAAC-Dox, BMDMs, ou BMDMs rolamento PAAC-Dox (BMDMs-PAAC-Dox) foram injectados intravenosamente em ratinhos com 5 mm de diâmetro tumores TRAMP-C1 após 1, 4 e 7 dias de uma dose única de 25 terapia de radiação Gy. A curva de crescimento do tumor mostra que livre Dox, PAAC-Dox, e BMDMs-PAAC-Dox sozinho (Figura A e B em S6 figura), mas não PAAC, BMDMs, ou BMDMs-PAAC (dados não mostrados), a redução do crescimento do tumor. Uma dose única de 25 Gy um tumor de aproximadamente 5 mm de diâmetro (IR) retardou o crescimento do tumor durante cerca de 4 dias (Fig 6A). Este efeito de IR foi ainda aumentada quando Dox, PAAC-Dox, ou BMDMs-PAAC-Dox foram administrados depois de IV. A comparação dos volumes dos tumores a seguir a cada tratamento no fim da experimentação (Figura 6B) mostraram que os adjuvantes, livre Dox, PAAC-Dox, e BMDMs-PAAC-Dox, aumentou significativamente o atraso de crescimento de tumor induzida por IR. supressão de crescimento tumoral máxima foi atingida após a administração IR com de BMDMs-PAAC-Dox.

(A) curvas de crescimento do tumor de tumores TRAMP-C1 crescem subcutaneamente na coxa após vários tratamentos de combinação. IR: 25 Gy de radiação foi dado quando o diâmetro do tumor é de cerca de 5 mm. PBS, Dox, PAAC-Dox ou BMDMs-PAAC-Dox foi administrado por via intravenosa em 1, 4 e 7 dias após o tratamento com radiação. Os dados representam a média de três a cinco ratos de cada grupo de dados representativos conjunto de 3 experiências independentes repetidas. (B) Comparação do volume de tumor no final das experiências. Bar: SE. **: P 0,01; ***: P 0,005; n.s .: P 0,05 por testes ANOVA. (C) e (D) representativas imagem fluorescente de tecidos de tumor obtidos a partir de um dia após a última administração do PAAC-Dox. (E) e (F) imagem fluorescente representativas de tecidos tumorais obtidas a partir de um dia após a última administração de BMDM-PAAC-Dox. barra de escala = 50 um. Comparação de DOX intensidade de fluorescência dentro de PIMO negativo contra PIMO região positiva após uma injecção (L) ou três injecções de (H) do PAAC-Dox contra BMDMs-PAAC-Dox entre tumor com (IR) e sem (w /o de IV) 25 Gy de irradiação. Os dados representam a intensidade média Dox fluorescente dentro PIMO- ou PIMO + região de 5 campos aleatoriamente selecionados de cada tumor de 3 tecidos tumorais foi analisada por Imagem Pro 6 sob mesmo tempo de exposição de 40X de imaging lente objetiva. Bar: SE. ***: P 0,005; **: P 0,01; *: P 0,05 por testes ANOVA

Para examinar melhor a distribuição espacial da Dox entregues sob diferentes protocolos, tecidos tumorais 1 dia após cada injecção foram submetidos a coloração imuno-histoquímica (IHQ).. PAAC-D15 vesícula-encapsulado Dox entregue por BMDMs co-localizada com CD11b

+ macrófagos no dia 1 após a primeira injecção (Figura C em S6 figura), confirmando que as vesículas PAAC-D15 pode evitar citotoxicidade Dox-mediada no transportador durante até 72 h. IHC revelou ainda que Dox com ou sem encapsulamento vesícula polimérica, entregue pela circulação, foi distribuído principalmente dentro de um intervalo de 100 mm de CD31

+ vasos (Fig 6c) e em regiões negativas PIMO (Fig 6D). Quando Dox foi encapsulado no interior de vesículas PAAC-D15 e transportada por BMDMs, no entanto, o sinal de Dox poderia ser encontrado tanto quanto 100 um de distância dos vasos (Figura 6E) e no interior da PIMO

+ região de hipoxia (Figura 6F). Para confirmar se o efeito melhorado de IR e BMDMs-PAAC-Dox foi associada com o tropismo hipóxica de BMDMs, a intensidade do sinal Dox fluorescente no PIMO

+ e PIMO

– regiões 1 dia após o primeiro ou o último injecção (Figura 6G e 6H) foi comparada nos grupos de tratamento com radiação e sem pré-exposição. Descobrimos que o Dox entregue por vesículas poliméricas foi homogeneamente distribuída dentro de tumores de tratamento única (isto é, sem IR). Não foi observada diferença significativa entre PIMO

+ e PIMO

– regiões em tumores de tratamento único após 1 ou 3 injeções. Por outro lado, a intensidade de fluorescência em tumores Dox-tratamento único entregues por BMDMs-PAAC foi maior em PIMO

+ regiões independentemente do ponto de tempo após o tratamento. Pré-exposição dos tumores a RI aumentou a distribuição de Dox entregue por vesículas PAAC-D15 para o PIMO

– regiões 1 dia após a primeira injecção, mas teve um efeito menor após 3 injecções. Em contraste, a pré-exposição dos tumores a RT não afectou a acumulação de Dox em PIMO

+ regiões para tecidos obtidos 1 dia após a primeira injecção, embora a intensidade Dox relativa em PIMO

regiões + foi reforçada após 3 injecções .

pesquisadores Discussão

a capacidade dos macrófagos para engolir partículas estranhas e se infiltram tumores levou para investigar macrófagos como potenciais operadoras de celular para agentes terapêuticos ou de imagem. Embora um recente relatório Choi

et al

. [21] confirmou o potencial terapêutico de macrófagos peritoneais de LP-Dox-carregados em retardar o crescimento do tumor, o efeito era ainda muito limitada. No estudo actual, demonstra-se que BMDMs pré-cultivadas em meio condicionado de células tumorais irradiadas podem potenciar a distribuição de um fármaco terapêutico para regiões hipóxicas, e que estas células podem ser um adjuvante eficaz para a terapia de radiação em um modelo de tumor da próstata de murideo.

a primeira

in vivo

experimento utilizando BMDMs GFP-tagged demonstrou que GFP-BMDMs foram capazes de se infiltrar crescente tumores, embora eles estavam situados principalmente na borda do tumor, ou seja, áreas com maior perfusão [29]. O número de infiltração GFP-BMDMs em tumores de controlo permaneceu a mesma na semana 1, mas foi reduzida em 2 semanas após a injecção. Isto pode explicar por que as injecções semanais de BMDMs durante um período de 5 semanas foram necessárias para observar o atraso no crescimento significativo no estudo anterior [21].

No presente estudo, IR não afectou a infiltração BMDM inicial, mas os tumores irradiados foram capazes de atrair consistentemente BMDMs por um longo período de tempo e em tecidos mais profundas, do que eram tumores de controlo, para um máximo de cerca de 1-2 semanas. Isto pode ser uma vantagem de combinar a entrega de drogas BMDM mediada com RT. O nosso modelo terapêutico que demonstram que a eficácia da RT foi aumentada após 3 injecções de BMDMs PAAC-Dox-carregados. Comparação de Dox densidade PIMO

+ contra PIMO

– regiões mostra claramente que BMDMs pré-condicionados podem entregar drogas para as áreas de hipóxia mais eficaz do que a regiões não-hipóxicos (Fig 6). De interesse, a última injecção foi menos eficaz do que a primeira injecção (dia 2 versus dia 8 da Fig 6G e 6H, respectivamente), e IV reduziu significativamente a acumulação Dox nos tecidos quando a droga não foi entregue por BMDMs. Isto é provavelmente relacionado com a redução de IV-mediada de densidade de microvasos [10]. Em contraste, IR não influenciou acumulação Dox quando foi entregue por BMDMs, e a última injecção foi mais eficaz do que o primeiro. Estes dados indicam que tecidos irradiados expressar fatores que promovem a infiltração BMDM, bem como fatores que podem aumentar a segmentação dessas células para regiões tumorais hipóxicas.