Abstract

Fundo

Há relatos conflitantes sobre a função de miR-20a em uma variedade de tipos de câncer e nós já encontramos a ser desregulada em esporádicos contra câncer de tireóide papilar familial . Neste estudo, estudamos a expressão de miR-20a em amostras normais, benignas e malignas da tireóide, e seu efeito sobre as células cancerosas da tiróide

in vitro

e

in vivo

.

Metodologia /Principais achados

A expressão de miR-20a no tecido normal, benignos e malignos da tireóide foi determinada por RT-PCR quantitativo. células de câncer de tireóide foram transfectadas com miR-20a e o efeito sobre a proliferação celular, a formação esferóide tumor e invasão foi avaliado. Os genes alvo de miR-20 foram determinados por análise de expressão de ARNm de todo o genoma, com sobre-expressão de miR-20a em células de cancro da tiróide e do banco de dados de previsão alvo. Os genes alvo foram validados por PCR quantitativa e imunotransferência, e ensaios de luciferase. expressão de miR-20a foi significativamente maior no cancro da tiróide anaplásico do que no câncer diferenciado da tiróide, e os tecidos tireoidianos benignos e normais. significativamente inibiu a proliferação de células de câncer de tireóide miR-20a

in vitro

(p 0,01) e

in vivo

(p 0,01), formação esferóide tumor (p 0,05) e invasão (p 0,05) em várias linhas celulares de cancro da tiróide. Descobrimos que

LIMK1

foi alvo de miR-20a em linhas celulares de cancro da tiróide e knockdown direta de LIMK1 recapitulou o efeito de miR-20a em células de cancro da tiróide.

Conclusões /Significado

para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar que miR-20a desempenha um papel como um supressor de tumor em células de câncer de tireóide e as metas

LIMK1

. Nossos resultados sugerem a expressão regulada positivamente de miR-20a no cancro da tiróide anaplásico neutraliza a progressão do cancro da tiróide e pode ter potencial terapêutico

Citation:. Xiong Y, Zhang L, Kebebew E (2014) miR-20a é regulada em anaplásico Câncer e Metas tireóide

LIMK1

. PLoS ONE 9 (5): e96103. doi: 10.1371 /journal.pone.0096103

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 31 de janeiro, 2014; Aceito: 03 de abril de 2014; Publicado em: 23 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health, National Cancer Institute. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de tireóide é o câncer endócrino mais comum e uma das que mais crescem diagnósticos de câncer nos Estados Unidos [1], [2]. cancros da tiróide são originários a partir de células foliculares e células parafoliculares [3], [4]. cancros da tiróide provenientes de células foliculares respondem por mais de 95% de todos os casos de câncer de tireóide e são classificados em quatro grandes grupos histológicos (câncer de tireóide papilar (PTC), carcinoma folicular (FTC), carcinoma de células Hürthle (HCC), e carcinoma da tiróide anaplásico (ATC)). MicroRNAs (miRNAs) foram mostrados para ser desreguladas em cancros da tiróide originário a partir de células foliculares [5] – [7]. MiRNAs são pequenos, RNAs não codificadoras, que são cerca de 21 nucleótidos de comprimento e regulam a expressão do gene [8], [9]. Geralmente, miARNs ligam à região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) do gene-alvo, conduzindo a tradução reprimida ou a degradação de ARNm [9], [10].

miR-20a é um membro do aglomerado de miR-17-92 localizado no cromossoma 13. estudos anteriores demonstraram que o miR-20 pode funcionar para promover ou inibir as características de fenótipo maligno de células de uma maneira tipo específico de célula [11] – [13]. Por exemplo, a sobre-expressão de miR-20a inibe a proliferação celular, invasão e metástase tumoral em linhas celulares de cancro da mama [11], [12]. Por outro lado, suprime o miR-20a

expressão E2F1

na linha de células B humana P-493-6, um factor de transcrição que promove a progressão fase G1-S em células de mamíferos [14]. Esta constatação sugere que a função de miR-20a pode ser diferente, dependendo do tipo de célula. Nós já tinha encontrado miR-20a a ser regulada em PTC familiar, em comparação com casos esporádicos, que são pensados ​​para ser mais agressivo [3], [15]. Takakura et al. [16] também descobriram que miRNAs do cluster miR-17-92 (miR-17-3p, -17-5p, -18, -19a, -20, -19b e -92-1) foram sobre-expressos em células ATC linhas.

neste estudo, caracterizamos a expressão de miR-20a em amostras normais, benignas e malignas da tireóide, e estudou o seu efeito sobre o câncer de tireóide células

in vitro

e

In vivo

. Nós também realizada uma análise de genes alvo miR-20a, utilizando banco de dados de previsão de destino e expressão do genoma com superexpressão de miR-20a, e validou os genes-alvo com ensaio de luciferase. Por fim, mostramos que LIMK1 recapitula os efeitos de miR-20a em células de cancro da tiróide.

Materiais e Métodos

amostras de tecido da tiróide humana e experiências com animais

amostras de tecido tireoidiano foram congeladas rapidamente no momento da tireoidectomia sob um protocolo aprovado pelo Escritório de Assunto humano de investigação no National Institutes of Health Clinical Center, após consentimento informado por escrito. Todas as amostras de tecido foram submetidos a avaliação secundária histologia adicional por um patologista endócrino para confirmar o diagnóstico e identificar amostras com células de tumor maior do que 80%. As amostras de tecido foram classificados como, benigna (bócio multinodular, adenoma folicular, adenoma de células Hürthle) normal, câncer diferenciado da tiróide [DTC] (classic PTC, variante folicular do PTC, FTC) e ATC. tecido da tiróide normal foi obtido a partir de pacientes submetidos a tireoidectomia para doença benigna ou maligna do lóbulo da tiróide contralateral. Ao todo, 8 ATC, 22 DTC, 24 benignas e 11 amostras de tecido da tireóide normais foram analisados.

O Comitê Nacional Animal Care Cancer Institute e utilização aprovados os protocolos de cuidados com os animais ea manipulação no presente estudo. Qualquer rato experimentando sinais neurológicos significativamente anormais, hemorragias a partir de qualquer orifício, mobilidade reduzida, perda de peso rápida, debilitar diarreia, pêlos arrepiados, postura arqueada, respiração difícil, letargia, decúbito persistente, icterícia, anemia, trauma auto-induzido, torna-se moribundo ou caso contrário, torna-se incapaz de obter comida ou água, ou com um tumor de 2 cm ou mais de diâmetro foi imediatamente sacrificados por CO

2 câmara.

linhas de células e condições de cultura

tiróide humana linhas celulares de cancro XTC-1 (HCC) (gentilmente fornecido pelo Dr. H. Clark Orlo (San Francisco, CA)) [17], FTC-133 (FTC) (gentilmente cedido pelo Dr. Peter Goretzki (Alemanha)), e TPC-1 (PTC) (gentilmente fornecida pelo Dr. Nabuo Satoh (Japão) [18]) foram mantidas em DMEM com 4500 mg /L de D-glucose e L-glutamina, e 110 mg /L de piruvato de sódio, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), hormona estimulante da tiróide (TSH) (10 mU /mL), penicilina (10000 U /ml), estreptomicina (10.000 U /mL), Fungizona (250 mg /mL) e insulina ( 10 ug /ml) numa incubadora humidificada padrão, a 37 ° C em 5% de CO

2 e 95% de O

2 atmosfera. meio isento de soro (meio DMEM-F12), suplementado com quatro hormonas (insulina [10 ug /ml], somatostatina [10 ng /mL], transferrina [5 ug /mL], e hidrocortisona [0,36 ng /ml]), foi utilizado para os estudos de genómica funcional. A linha celular humana ATC C643 foi gentilmente cedido pelo Dr. Rebecca Schweppe, com a permissão do Dr. N.-E. Heldin (Suécia) [18], e foi mantida em meio RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 10% de FBS. Todas as linhas celulares foram autenticadas pela curta repetição em tandem em 9 de Outubro de 2013 ea linha de células XTC-1 também foi confirmado para expressar tireoglobulina e sódio iodo symporter conforme relatado anteriormente [17].

Mirna transfecção

miARN maduro precursor (pré-miR-20a; Applied Biosystems, Foster City, CA) foi transfectado para células a uma concentração de 25 nM utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguindo o protocolo do fabricante. Um oligonucleótido não representando qualquer miRNA conhecido (Pre-miR miRNA Precursor Moléculas-Negativo Controle # 1; Applied Biosystems, Foster City, CA). Foi utilizado como controle negativo

SiRNA transfecção

LIMK1 siRNA #A (ID s8188), #B siRNA (ID s8189) e siRNA #C (ID s 8190) (Applied Biosystems, Foster City, CA) foram transfectados em células a uma concentração de 60 nM utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad , CA), seguindo o protocolo do fabricante. Silenciador Escolha Controlo Negativo # 1 siRNA (Applied Biosystems) foi utilizado como um controlo negativo.

Isolamento de ARN e quantitativo em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi isolado a partir das linhas de células usando o TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA). A TaqMan miARN Ensaio (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) foi utilizado para medir o nível de expressão de miARN. O ARN total foi transcrito de forma inversa com um iniciador específico do miARN, seguido por PCR em tempo real com sondas TaqMan. U6 foi usado como um controle endógeno. A quantidade relativa de mRNAs em

LIM quinase 1