Abstract

Objectivo

O tratamento de câncer colorretal (CRC) continua a ser um desafio clínico, pois mais de 15% dos pacientes são resistentes a 5-fluorouracil (5-FU) quimioterápico baseados regimes, e as taxas de recorrência de tumores pode ser tão elevada quanto 50-60%. células-tronco cancerosas (CSC) são capazes de sobreviver quimioterapias convencionais que permite a regeneração dos tumores originais. Por isso, investigamos a eficácia do 5-FU e polifenóis planta (curcumina) no contexto da reparação de incompatibilidade DNA (MMR) o status ea atividade CSC em culturas 3D de células CRC.

Métodos

High densidade culturas 3D do CRC linhas de células HCT116, HCT116 + ch3 (complementada com cromossomo 3) e seus correspondentes clones isog�nicas resistentes a 5-FU-químico derivativos (HCT116R, HCT116 + ch3R) foram tratados com 5-FU sem ou com curcumina em os ensaios de tempo e dose-dependente.

resultados

pré-tratamento com a curcumina aumentou significativamente o efeito do 5-FU sobre as células HCT116R e HCR116 + ch3R, em contraste com 5-FU sozinho como evidenciado pelo aumento da desintegração de colonospheres, reforçada por apoptose e inibir o seu crescimento. A curcumina e /ou 5-FU afetou fortemente as células CRC MMR-deficientes em culturas de alta densidade, no entanto células CRC MMR-proficientes foram mais sensíveis. Estes efeitos da curcumina em reforçar a quimiossensibilidade de 5-FU foram ainda apoiada pela sua capacidade para suprimir eficazmente piscinas CSC como evidenciado pela diminuição do número de células positivas para a CSC marcadoras, destacando a adequação deste modelo de cultura 3D para avaliar a expressão do marcador de CSC no fim de

configuração vivo

.

Conclusão

Nossos resultados ilustram a quimioterapia novos efeitos e previamente não reconhecidos de curcumina no reforço quimiossensibilização a 5-FU-based on DNA MMR-deficiente e sua quimio contrapartes resistentes ao alvejando a sub-população CSC. (246 palavras em abstracto)

Citation:. Shakibaei M, Buhrmann C, Kraehe P, Shayan P, Lueders C, Goel A (2014) curcumina Chemosensitizes 5-fluorouracil resistentes MMR deficiente em células humanas do cancro do cólon em alta As culturas de densidade. PLoS ONE 9 (1): e85397. doi: 10.1371 /journal.pone.0085397

editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Recebido: 25 de outubro de 2013; Aceito: 27 de novembro de 2013; Publicação: 03 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shakibaei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro mais frequente. cancro que afecta igualmente homens e mulheres em todo o mundo [1]. As terapias correntes para o tratamento do cancro colo-rectal compreendem principalmente quimioterapias baseados em 5-fluorouracilo, que são utilizados individualmente ou em combinação com oxaliplatina (FOLFOX) ou agentes anti-angiogénicos e /ou agentes anti-factor de crescimento da epiderme [2]. Embora as taxas de incidência de cancro do cólon ter diminuído um pouco, as terapias atuais estão associados a efeitos colaterais significativos, despesa elevada e as taxas de recorrência mais de 50%, principalmente devido ao desenvolvimento de chemoresistance adquirido para quimioterápicos convencionais [3], [4]. Estas limitações destacar a necessidade imperiosa e urgente para identificar e desenvolver novos e estratégias de tratamento seguras que podem ajudar a superar chemoresistance e melhorar a resposta das células tumorais a drogas anti-tumorais.

Carcinogênese acredita-se ser um processo de várias etapas que resulta de uma acumulação progressiva de alterações genéticas em diferentes genes (por exemplo, genes associados à metástase, oncogenes, genes supressores de tumores) que conduzem a conversão progressiva de células saudáveis ​​para as células tumorais [5], [6]. Agora é ainda mais reconhecido, que as alterações epigenéticas, como metilação aberrante DNA, modificações de histonas, remodelação cromossomo e danos ao sistema de reparo incompatível (MMR), também influenciam marcadamente desenvolvimento CRC, [5], [7]. Danos no sistema de MMR causa instabilidade genética, pois é importante para a prova de ler erros de síntese de DNA durante a replicação, levando a fenótipos celulares alterados, a suscetibilidade aumentada para a transformação neoplásica e facilitar o desenvolvimento de células quimio-resistentes [8], [9].

Durante tumorigénese e disseminação de tumor, incluindo cancro do cólon, células de cancro exige capacidade de auto-renovação, semelhante à que é exibida por células estaminais. É agora amplamente aceite que a patogénese do cancro, na maioria dos tumores, incluindo CRC, é accionado por um subconjunto de células tumorais que apresentam haste características de células semelhantes a células estaminais fisiológicos, incluindo a capacidade de auto-renovação e pluripotência [10], [11] e que essas células-tronco cancerosas (CSC) têm o potencial para invadir e formar metástases à distância [12], [13], [14]. No cólon, estes CSC cólon aberrante diferenciar gerar uma massa de células tumorais com a maior fracção composta por células mais diferenciadas e uma pequena fracção de células estaminais, o que eventualmente substituir as células estaminais do cólon saudáveis ​​e toda a cripta colónica é colonizado por haste do cancro células e sua progénie [10]. Um conjunto de marcadores específicos foram definidos para a CSC cólon, incluindo CD133

+, CD 44

+, CD166

+ e ALDH1

+ [15], [16]. Relapse de tumores após a quimioterapia aparentemente bem-sucedido é acreditado para ser em virtude de CSCs quimio-resistentes que escapam morte por drogas quimioterápicas [17]. Portanto, os novos agentes terapêuticos que podem direcionar com sucesso CSCs, é muito provável que a estratégia terapêutica mais promissora em encontro este tremendo desafio clínico.

literatura emergente sugere que muitos componentes da dieta podem regular directa ou indirectamente respostas inflamatórias no intestino por modular a função da barreira intestinal [18]. Além disso, vários compostos dietéticas que ocorrem naturalmente têm sido mostrados como anti-cancro agentes terapêuticos [19], [20], [21], [22]. Na verdade estão surgindo evidências de que a quimioterapia convencional no CRC beneficia significativamente através de tratamentos de combinações com alguma dessas que ocorrem naturalmente polifenóis [5], [23], [24]. Um desses botânico, curcumina (diferuloylmethane), uma especiaria amarela derivado dos rizomas de

Curcuma longa

, tem uma longa tradição como um agente anti-inflamatório no sistema ayurvédico indiano de medicina tradicional. Além disso, vários estudos têm demonstrado que a curcumina actua como um potente quimio e radiossensibilizador em vários cancros humanos [25], [26] e pode inibir o crescimento de células do sistema de MMR deficientes em células de cancro do cólon [27], [28]. Num estudo anterior, demonstrou-se que a curcumina reforçada a quimiossensibilidade de 5-FU em linhas celulares de cancro colorrectal, visando NF-kB, Src e produtos de genes regulados de NF-kB-dependentes [5]. Além disso, foi mostrado que a segmentação de células cancerígenas do cólon com 5-FU e oxaliplatina (FOLFOX) em combinação com a curcumina atenuada de EGF-R, IGF-1R e Akt sinalização e células positivas marcadamente reduzida cancro marcador de células-tronco e causou desintegração de colonospheres [ ,,,0],23], [24].

Demonstrámos recentemente que o tratamento combinado de curcumina com 5-FU induz citotoxicidade mais significativa na MMR de ADN deficientes em culturas em monocamada de CRC, em comparação com cada um dos agentes individualmente [5]. Por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi investigar se a curcumina por si só ou em combinação com 5-FU pode afectar células cancerígenas do cólon ADN MMR deficientes em que são inerentemente resistentes a 5-FU na modulação colonosphere formação e actividade de CSC em culturas 3D.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Cultura celular

células cancerígenas do cólon humano (HCT116; MMR deficiente) foram obtidos a partir European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK). HCT116 + CH 3, é uma linha celular de MMR-proficientes, que foi criada no laboratório pela transfecção estável de cromossoma 3 tendo uma cópia de tipo selvagem do gene da

hMLH1

, como descrito anteriormente [29]. Nós também gerou 5-FU derivados resistentes destas linhas celulares, referidas como HCT116R e HCT116 + ch3R respectivamente, que foram criados por meio do tratamento repetitivo de linhas celulares parentais a concentrações crescentes de 5-FU durante um período de 10-12 meses. Ambas as linhas celulares parentais resistentes e 5-FU foram utilizados para investigar a eficácia do indivíduo e combinado com 5-FU e tratamentos curcumina. As células foram mantidas em frascos de cultura de tecidos em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; 4,5 g de D-glucose /L) suplementado com 10% FBS e 1% de antibiótico /antimicótico numa incubadora humidificada a 37 ° C numa atmosfera de ar a 95% e 5% de CO

2. O meio foi mudado de três em três dias, e as células foram passadas utilizando tripsina /EDTA.

Anticorpos

os anticorpos monoclonais para ALDH1 foram adquiridos a Acris Anticorpos GmbH (Herold, Alemanha). Os anticorpos monoclonais para CD44 e CD133 foram adquiridos a Abcam PLC (Cambridge, Reino Unido). Os anticorpos para a p-actina (A5316) foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). anticorpo monoclonal anti-PARP [poli (ADP-ribose) polimerase] (7D3-6) foi adquirido da Becton Dickinson (Heidelberg, Alemanha). fosfatase alcalina ligada ovelhas anti-ratinho e de coelho de ovelha anti-anticorpos secundários para imunotransferência foram adquiridos a Millipore (Schwalbach, Alemanha). Todos os anticorpos foram utilizados a concentrações e diluições recomendadas pelo fabricante.

meios de cultura, produtos químicos, e citocinas

O meio de crescimento (F-12 de Ham /meio de Eagle modificado por Dulbecco (50:50) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), 25 ug /ml de ácido ascórbico, 50 UI /ml de estreptomicina, 50 IU /ml de penicilina, 2,5 ug /mL de anfotericina B, aminoácidos essenciais e L-glutamina) foi obtido da Seromed (Munique, Alemanha). Tripsina /EDTA (CE 3.4.21.4) foi adquirido a partir de Biochrom (Berlim, Alemanha). Epon foi obtido a partir de Plano (Marburg, Alemanha). 5-FU foi adquirido a partir de Sigma (Munique, Alemanha). A curcumina (BCM-95) foi uma oferta generosa da Dolcas Biotech (Landing, NJ, EUA). A curcumina foi preparada por dissolução em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de caldo de 5,000 uM e armazenadas a -20 ° C. As diluições em série foram preparadas em meio de cultura.

Um estoque de 100 mM de 5-FU foi preparada em DMSO absoluto e armazenados a -20 ° C. A concentração de DMSO era inferior a 1% do tratamento medicamentoso. Para o tratamento, o 5-FU foi diluída em DMEM e adicionadas às culturas para dar a concentração final desejada. Após 70-80% de confluência, as células foram tratadas com 5-FU ou a curcumina individualmente, ou a sua combinação.

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada pela 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) método de absorção como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, HCT116, as células HCT116 + ch3 e as linhas celulares de quimio-resistentes a 5-FU foram semeadas numa placa de 96 poços (1000 por poço) e expostas a diferentes concentrações de cada um de 5-FU ou a curcumina, em triplicado para os períodos de tempo indicados para se obter a IC

50 valores de crescimento celular (50%) as concentrações inibidoras. Além disso, num outro conjunto de experiências, as células foram pré-tratadas com 5 uM curcumina durante 12 h e, em seguida, co-tratados com diferentes concentrações de 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 uM) durante 24 h para se obter o dose óptima para o tratamento de combinação. As células foram lavadas duas vezes com PBS e, subsequentemente, a solução de MTT (5 mg /mL) foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada durante 2 h a 37 ° C. O tampão de lise (20% SDS e 50% de formamida de dimetilo) foi adicionado, e as células foram incubadas durante a noite a 37 ° C. A absorvância da suspensão de células foi medida a 570 nm (OD570) usando Revelação de 96 poços Multiscanner leitor de placas (Bio-Rad Laboratories Inc. Munique, Alemanha). Os dados obtidos foram calculados e foram representados como a percentagem de sobrevivência em relação aos controles. Esta experiência foi repetida 3 vezes de forma independente, ea análise estatística foi feito para obter os valores finais.

Formação e inibição da Colonosphere Colonies

Para o ensaio formação colonosphere tumor, 10 gota l, cerca de 2 milhões células, HCT116, HCT116 + CH3 e às respectivas linhas celulares derivadas de quimio-resistentes a 5-FU foram plaqueadas sobre um filtro de celulose em cima de uma ponte de malha de aço [31]. meio de cultura celular atingiu a interface do meio de filtro e as células foram alimentadas por meio de difusão. Este modelo permite que as células se agregam e formam um sedimento distinta, que foi examinada após 1-10 dias. O suas respectivas linhas celulares de quimio-resistentes a 5-FU HCT116, HCT116 + CH3 e foram tratados com curcumina (20 uM), 5-FU (5 ^ M) ou a sua combinação (curcumina 5