Abstract

Fundo

células-tronco do câncer de pâncreas (CSCs) representam uma pequena subpopulação de células de câncer pancreático que têm a capacidade de iniciar e propagar a formação de tumores. No entanto, os mecanismos pelos quais CSCs pancreáticas são mantidos não são bem compreendidos ou caracterizados.

Métodos

A expressão de receptores Notch, ligantes, e genes alvo de sinalização Notch foi quantificado na CSC e não populações de CSC 8 xenoenxertos pancreáticas humanas primárias. Um inibidor de gama-secretase (GSI), que inibe a via de Notch e um shRNA alvo o gene alvo do entalhe HES1 foram utilizados para avaliar o papel da via do Notch na CSC manutenção da população e o crescimento do tumor pancreático.

Resultados

componentes da via Notch foram encontrados para ser regulada em CSCs pancreáticas. A inibição da via de Notch utilizando quer um inibidor de gama secretase ou HES1 shRNA em células de cancro do pâncreas reduziu a percentagem das CSCs e tumorsphere formação. Por outro lado, a activação da via de Notch com um ligando peptídico de Notch exógeno aumentou a percentagem de CSCs bem como tumorsphere formação. O tratamento in vivo de tumores pancreáticos ortotópicos em NOD /SCID com GSI bloqueou o crescimento do tumor e reduziu a população CSC.

Conclusão

A via de sinalização Notch é importante para manter a população CSC pancreático e é um potencial alvo terapêutico no cancro pancreático

Citation:. Abel EV, Kim EJ, Wu J, Hynes M, Bednar F, Proctor E, et al. (2014) O Caminho Notch é importante para manter a população de células-tronco cancerosas no câncer de pâncreas. PLoS ONE 9 (3): e91983. doi: 10.1371 /journal.pone.0091983

editor: Martin Fernandez-Zapico, Centro de Schulze para novas terapias, Clínica Mayo, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de janeiro de 2014; Aceito: 15 de fevereiro de 2014; Publicação: 19 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Abel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Prêmio Randy Pausch Família AACR-PanCAN Inovação (DMS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta causa mais comum de morte por câncer nos Estados Unidos, apesar de estar a 10

th diagnóstico de câncer mais comum [1]. A taxa de mortalidade elevada é em parte devido ao facto de a grande maioria dos cancros pancreáticos são diagnosticados numa fase avançada. Mas, pelo menos, igualmente importante é que o câncer de pâncreas são geralmente apenas minimamente sensível à quimioterapia e radioterapia. Há evidências crescentes de que esta resistência à terapia é pelo menos em parte devido à resistência inerente de uma subpopulação de células cancerosas que são tumorigénico e partilham muitas propriedades com células-tronco e células-tronco cancerosas, portanto, foram rotulados (CSC). câncer de células estaminais foram isoladas pela primeira vez na leucemia mielóide [2] e foram mostradas para compartilhar propriedades de células-tronco, tais como o potencial de auto-renovação e a capacidade de diferenciar e proliferar. Subsequentemente, CSCs também foram identificados em uma ampla gama de tumores sólidos incluindo cancro da mama, cérebro, fígado, cólon, próstata, melanoma, tumores do pâncreas e [3] – [10] _ENREF_3. as células-tronco do câncer de pâncreas (CSC) foram isolados primeiramente de cancros pancreáticos humanos usando a ESA perfil marcador

+ /CD44

+ /CD24

+ [10]. Estes marcadores positivos CSCs eram capazes de formar tumores em ratinhos NOD /SCID que apareceu histologicamente semelhante ao tumor primário, sugerindo multi-potência com a reconstituição dos vários tipos de células tumorais. Em evidência vitro para um fenótipo de células-tronco, tais como a auto-renovação foi demonstrada pela capacidade de formar esferas de tumor

in vitro

em contraste com a ESA

– /CD44

– /CD24

– células que não podia.

Ele permanece incompletamente compreendida como pancreático células-tronco cancerosas são mantidos em um tumor heterogêneo. Um contribuinte potencial para a manutenção CSC é a via de sinalização Notch. No pâncreas de desenvolvimento normais, a via de sinalização Notch foi demonstrado ser um importante regulador do equilíbrio entre a auto-renovação e diferenciação [11] – [13]. Existem 4 membros da família de receptores de Notch de mamífero (NOTCH 1-4), que são processados ​​de forma semelhante e activado por meio de uma série de eventos de clivagem. O receptor de Notch madura é composta por duas subunidades que são gerados como resultado de um evento de clivagem inicial por convertase tipo furina [14]. activação Notch via de sinalização ocorre quando um receptor Notch se liga a um dos cinco ligandos Notch conhecidos [Jagged1 (JAG1), jagged2 (JAG2), semelhante a delta 1 (DLL1), semelhante a delta 3 (DLL3), e a delta-4 semelhante (Dll4)]. ligação ao ligando provoca uma alteração conformacional no receptor Notch que permite que uma segunda clivagem pelo factor de necrose tumoral-alfa da enzima de conversão (TACE) [15]. Um terceiro evento de clivagem é realizada por um de gama-secretase (presenilina), que liberta o domínio intracelular de Notch permitindo-se translocar para o núcleo para activar a expressão de genes alvo [16].

A inibição da sinalização de Notch via resulta em esgotamento dos multi-potentes células progenitoras pancreáticas [11], [13]. Por outro lado, a activação induzida Notch impede a diferenciação epitelial pancreática e resulta no aumento da manutenção de células progenitoras indiferenciadas pancreático [12]. Com base em características fenotípicas similares exibidas pelos CSCs, a via de sinalização Notch foi avaliada quanto ao seu papel na CSC auto-renovação. Ambos os da mama e do cérebro CSCs foram mostrados para ter aumentado activação via Notch [17], [18]. Inibição in vitro da via de sinalização Notch nestes dois tipos de tumor resulta na diminuição da auto-renovação, demonstrada pela diminuição do tumorsphere formação. Nossa hipótese é que a via de sinalização Notch é ainda regulada positivamente no CSC pancreática e contribui para a função pancreática e CSC tumorigênese câncer pancreático.

Neste estudo, foi avaliado o papel da via Notch em manter a população CSC e seus efeitos de inibição do crescimento do tumor pancreático. Nós detectar a regulação positiva de vários componentes da via de Notch em CSCs pancreáticas e demonstram que a inibição por um inibidor de gama secretase ou shRNA para HES1, um gene alvo chave Notch, reduz pancreático CSC auto-renovação e tumorigenicidade. O tratamento in vivo de tumores pancreáticos ortotópicos estabelecidos com um inibidor de gama-secretase e reduz o crescimento do tumor combinação com quimioterapia citotóxica aumenta ainda mais a resposta anti-tumoral. Nossos resultados sugerem que a sinalização Notch é fundamental para a manutenção CSC pancreáticas e que a segmentação da via de sinalização Notch em câncer pancreático tem um potencial terapêutico promissor.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

amostras de tecido de adenocarcinoma do pâncreas foram obtidos a partir de pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos dentro da Universidade de Michigan Health System. consentimento informado por escrito de todos os sujeitos da pesquisa foi obtido antes da coleta do tecido, e todos os protocolos que envolvem amostras de pacientes foram revistos e aprovados pelos Institutional Review Boards da Universidade de Michigan Medical School (IRBMED). Original, cópias impressas de todos os formulários de consentimento informado por escrito são mantidos dentro de um arquivo seguro na Universidade de Michigan. Os Institutional Review Boards da Universidade de Michigan Medical School (IRBMED) determinou que este estudo está em conformidade com as orientações aplicáveis, estado e regulamentos federais, e da Universidade de Michigan Federalwide Assurance (FWA) com o Departamento de Saúde e Serviços Humanos (HHS). O IRBMED também aprovou todos os documentos consentimento por escrito, bem como os processos de aprovação, para este estudo. O número Universidade de Michigan Federalwide Assurance para este estudo é FWA00004969, eo número de identificação estudo da Universidade de Estudos de Michigan é HUM00025339.

Anticorpos e reagentes

Merck gama secretase inibidor (MK-0752) foi fornecido pelo Dr. Max Wicha (Universidade de Michigan) e foi usado para o

in vitro Comprar e

ex vivo

estudos. Gamma RO4929097 inibidor secretase foi gentilmente cedido pela Roche (Indianapolis, IN) e foi usado para o

in vivo

estudos. ratinho conjugado com PE anti-CD44 humano e de ratinho conjugado com FITC de anticorpos de CD24 anti-humanos foram adquiridos a B.D. (Franklin Lakes, NJ). APC de ratinho conjugado SEC anti-humano foi adquirido a partir de Miltenyi Biotech e rato anti-ratinho biotinilada H2K foi adquirido a Southern Biotech. HES1 anticorpo utilizado para transferência de Western foi obtido do Dr. Xing Ventilador (Universidade de Michigan) ou adquiridos a partir de MBL International (Woburn, MA). Notch1 e anticorpos Notch1 clivados foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA) e anticorpos β-actina foi adquirido de Sigma (St. Louis, MO). Matrigel foi adquirido a B.D. (Franklin Lakes, NJ). Hes1 shRNA clone V2LHS 249784 foi comprado da Open Biosystems (Huntsville, AL). A /peptídeo delta Serrate /Lag-2 (DSL) (sequência CDDYYYGFGCNKFCRPR) foi sintetizado pela Facilidade de Estruturas de Proteínas da Universidade de Michigan.

A aprovação do protocolo

protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Universidade para o use e tratamento dos animais (UCUCA) na Universidade de Michigan e protocolos de lentivírus foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) da Universidade de Michigan.

Preparação de suspensões de células únicas de células tumorais

Individual suspensão de células de células tumorais foi preparado tal como descrito [10] com as seguintes modificações. tecido pancreático adenocarcinoma xenoenxerto humano foi triturada primária completa e, em seguida, suspenso em 200 unidades /ml de colagenase IV ultrapura (Worthington Biochemicals, Freehold, NJ) em meio 199 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após a digestão enzimática a 37 ° C durante 45 a 60 minutos e dissociação mecânica por pipetagem a cada 15 minutos, com uma pipeta de 10, o digerido e dissociado células foram filtrados através de um restritor de células de malha de nylon de 40 um (BD Franklin Lakes, NJ) e lavada com HBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA) duas vezes. As células foram em seguida ressuspensas em 2% de FBS em HBSS para as experiências.

A citometria de fluxo

A citometria de fluxo foi realizada como descrito anteriormente [10]. As células dissociadas foram contadas e transferidas para tubos de 5 mL, lava-se com HBSS /FBS a 2% por duas vezes e ressuspensas em HBSS /2% de FBS, para uma concentração de 1 milhão de células por 100 uL. Sandoglobin (1 mg /mL) foi adicionado à amostra a uma diluição de 1:50 e a amostra foi incubada em gelo durante 20 min, em seguida, lavadas duas vezes com HBSS /2% de FBS. Anticorpos de rato conjugado com PE anti-humano CD44, conjugado com FITC de rato anti-CD24 humano, de APC de ratinho conjugado SEC humano anti-rato e anti-ratinho biotinilada H2K foram adicionados na diluição conforme indicado, e a amostra foi incubada durante 45 min sobre gelo e, em seguida, lavadas duas vezes com HBSS /2% de FBS. Estreptavidina conjugada com APC-Cy7 foram adicionados na diluição de 1:200 e a amostra foi incubada em gelo durante 15 minutos. Depois de lavar duas vezes com HBSS /2% de FBS, as células foram ressuspensas em HBSS FBS /2% contendo 3 uM 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). A citometria de fluxo foi realizada utilizando um FACSAria (B.D., Franklin Lakes, NJ). dispersão lateral e perfis de dispersão para a frente foram usadas para eliminar dobletes celulares

Quantitative PCR

Primers para componentes da via Notch foram selecionados a partir de um banco de primer. (Wang Seed, 2003) e sintetizados pela Invitrogen (Carlsbad, CA). O ARN total foi extraído a partir de células estaminais do cancro ordenados e células estaminais não-cancerosas utilizando um kit RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA), conforme instruído. A transcrição reversa de cDNA foi realizada usando High-Capacity cDNA de transcrição reversa Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA) conforme indicado. qPCR foi realizado em Rotorgene 6000 (Qiagen, Valencia, CA) utilizando uma mistura de PCR verde SYBR de alimentação principal (Applied Biosystem, Foster City, CA) seguindo as instruções do fabricante, com todas as reacções normalizadas para GAPDH. As condições utilizadas para qPCR foram de 95 ° C durante 10 minutos preensão, 40 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 15 segundos, e 72 ° C durante 20 seg.

culturas Tumorsphere

Established tumorspheres com cancro pancreático [10] foram mantidas em meios de esfera, como descrito anteriormente [19], [20] com modificações [50% NeuralBasal (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de suplemento N 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2% de suplemento B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% de antibiótico-antimicótico (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ng /mL BMP4 (Sigma), 10 ng /ml de LIF (Sigma), 20 ng /mL de bFGF humana 2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), todos em 01:01 de DMEM /F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA)]. Tumorspheres foram passadas a cada 6 dias. Para Passaging, tumorspheres foram dissociadas com 0,05% de tripsina durante 2-5 min e, em seguida, imediatamente lavados duas vezes com 40 mL de PBS. As células foram então passados ​​através de um filtro de células de malha de nylon de 40 mm, contados e banhado em meio esfera fresco em Costar ultra-baixo apego 6 bem placas (Corning, Lowell, MA).

tratamento GSI de tumorsphere células

Tumorspheres foram dissociadas em células isoladas e re-suspensas em meio contendo esfera GSI nas concentrações indicadas, durante os períodos de tempo indicado. As células foram então observadas ao microscópio ou colhidas para análise.

Western blotting

As células tratadas com ou sem GSI em várias doses foram lisadas em tampão de lise (Tris 20 mM pH 7,5 /NaCl 150 mM /12 mM de EDTA /10% glicerol /1% de Triton X-100), contendo um cocktail inibidor da protease (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) e PhosphoStop (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). A concentração proteica foi medida usando um ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Cinquenta ug de proteína foram misturadas com um volume igual de 2x tampão de SDS carregamento (Invitrogen, Carlsbad, CA) e fervidos durante 5 min antes da aplicação da amostra para SDS-PAGE. Após SDS-PAGE, a proteína de gel foi transferido sobre uma membrana de nitrocelulose Hybond C Extra (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA), utilizando um aparelho de mancha de Bio-Rad (BioRad, Hercules, CA) durante uma hora. A membrana foi bloqueada com 5% de leite seco em TBST durante uma hora, lavadas duas vezes em TBST, e, em seguida, incubadas com anticorpos (1:1000) em 5% de BSA, a 4 ° C durante a noite. A membrana foi lavada três vezes em TBST e, em seguida, incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) em leite em pó a 5% à temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavagem três vezes em TBST, a mancha foi incubada durante 5 minutos com SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL) e um filme de raios-X (Scientific Denville, Metuchen, NJ) foi então desenvolvida.

shRNA transductioin

Lentivírus constrói vector pGIPZ contendo Hes1 shRNA ou shRNA controle foram feitas no núcleo Vector na Universidade de Michigan. Transdução foi realizada utilizando um Kit ViraDuctin Lentivírus transdução (Biolabs celulares, Inc. San Diego, CA) como instruído.

A apoptose ensaio

células Tumorsphere transduzidas com controlo ou Hes1 shRNA foram cultivados em meio esfera contendo 4 ug /mL de puromicina para 4 dias, seguido por tripsinização e lavagem PBS. As células foram filtrados através de uma malha de nylon de 40 ^ m a obter suspensões de células únicas. As células individuais resultantes foram fixadas com etanol gelado a 50% em PBS durante a noite. As células foram então coradas com PI e FITC-anexina V utilizando uma anexina V:. FITC Apoptosis Detection Kit II comprado de BD Biosciences (San Jose, Califórnia)

tratamento DSL de tumorspheres

Spheres foram dissociadas em células isoladas e re-suspensas em meio contendo o peptídeo esfera DSL nas concentrações indicadas durante os tempos indicados. As células tratadas foram observadas ao microscópio ou colhidas para análise

.

Ex vivo tratamento GSI de tumorspheres e implantação em NOD /SCID

Células individuais dissociados de tumorspheres foram cultivados em meio esfera contendo DMSO ou 8 GSI uM durante 48 horas antes de ser dissociadas com tripsina e corados com DAPI e um anticorpo para H2K. As células foram classificadas por FACS e as células DAPI negativo e H2K negativos foram recolhidas para se obter um live pura, a população de células de cancro pancreático humano. Após lavagem com HBSS, as células escolhidas foram re-suspensas em meio de esfera. A viabilidade celular foi validado utilizando azul de Tripano (Invitrogen, Carlsbad, CA). Quarenta mil células em 50 mL meio foram misturados com um volume igual de Matrigel e injectado por via subcutânea para a região de midflank de NOD /SCID, utilizando uma agulha de calibre 23. Cinco ratinhos foram injectados para cada grupo de tratamento. O tamanho do tumor foi medido semanalmente. Os tumores não foram autorizados a ultrapassar os 2 cm de diâmetro antes da eutanásia. Além disso, os animais foram monitorados diariamente pela Universidade de Michigan pessoal veterinário e sacrificado a qualquer sinal de perigo ou perda de peso. No final do estudo os animais foram sacrificados por asfixia com dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical para garantir a morte.

ortotópico implantação de células de tumor pancreático para NOD /SCID e GSI tratamento

células de tumor pancreático incubadas com lentivírus que expressam luciferase dia para o outro foram lavadas com soro livre HBSS e suspensas numa mistura de PBS /Matrigel (01:01 em volume), na concentração de 10 milhões de células /ml para implantação. Os ratinhos foram anestesiados com uma injecção intraperitoneal de 100 mg /kg de cetamina e 5 mg /kg de xilazina, e uma pequena incisão subcostal esquerda foi realizada. 500.000 células tumorais granel num volume de 50 ul foram injectadas na cauda do pâncreas, usando uma agulha de calibre 30. Buprenorfina foi administrada a cada 6 horas para a primeira pós-cirurgia de 24 horas para aliviar a dor. O tratamento com a quimioterapia foi iniciada 2 semanas após os tumores eram detectáveis. Três tumores humanos de baixa passagem individuais pancreáticas xenoenxerto foram incluídos na análise. Havia 4 grupos de ratos: controle, RO4929097 (GSI), gemcitabina, e GSI mais gemcitabina, com 5 ratos por grupo. Os animais foram avaliados pelo crescimento do tumor e imagiologia bioluminescente foi avaliado semanalmente. GSI (30 mg /kg) foi administrado por sonda oral na frequência de 5 dias em 2 dias de folga. Este esquema foi utilizado para minimizar a diarreia induzida por GSI secundária a hiperplasia das células caliciformes [21]. Gemcitabina (50 mg /kg) foi entregue semanalmente por injecção intraperitoneal, como descrito anteriormente [22]. O tratamento foi administrado durante 4 semanas em que os animais foram sacrificados ponto por asfixia com dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical para garantir a morte. Antes do sacrifício, os animais foram monitorados diariamente pela Universidade de Michigan pessoal veterinário e sacrificado a qualquer sinal de perigo ou perda de peso. A necropsia foi realizada e os tumores foram excisados ​​para análise.

Imagiologia bioluminescente

imagiologia bioluminescente ortotópicos de tumores implantados em murganhos foi realizada utilizando um IVIS da Xenogen 200 Imaging System (Xenogen Biosciences, Cranbury, NJ) como descrito anteriormente [23].

imunohistoquímica

As amostras de tecido foram fixados em formalina a 10% tamponada com fosfato e embebidos em parafina. , secções embebidas em parafina fixadas com formalina foram cortadas de 4 mm de espessura, montadas em lâminas de poli-L-lisina-revestidas (Sigma), e secou-se durante a noite a 37 ° C. Os cortes foram desparafinados em xileno em seguida, re-hidratadas de acordo com procedimentos histopatológicas padrão, e coradas com H E. A imunodetecção foi feito utilizando o Kit de DakoCytomation LSAB + de acordo com o protocolo do fabricante (Dako, Dinamarca). As lâminas foram então contrastadas com hematoxilina e cobertas com VectaMount meios de montagem (Vector Labs, Burlingame, CA). Cada secção corada foi então avaliada por microscopia.

Ensaio TUNEL

análise de TUNEL foi realizado utilizando o kit Promega ensaio de TUNEL (Promega, San Luis Obispo, CA) de acordo com as instruções do fabricante. núcleos de células apoptóticas foram visualizados como um sinal de fluorescência amarelo-verde em microscopia de fluorescência. os núcleos das células foram contrastadas com DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA).

reagentes adicionais

RO4929097 para o trabalho in vitro foi comprado de Selleck Chemicals (Houston, TX).

oligonucleótidos por qRT-PCR

foram usadas as seguintes sequências: 5′-HES1 GAGAGGCGGCTAAGGTGTTTG-3 ‘e 5′-CTGGTGTAGACGGGGATGAC-3′, 5’-GLI1 GGCTGGACCAGCTACATCAAC-3 ‘e 5’-3-TGGTACCGGTGTGGGACAA ‘, 5′-GCAAATGAAAGCCAGGGAAC Gli2-3′ e 5’-ATCTCAGGAAGGCGATGAAC-3 ‘, 5′-PTCH1 TATCCAGCACTTACTTTACGACCT-3′ e 5’-ATCCTGAAGTCCCTGAAGCC3 ‘, 5′-e GAPDH TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3′ e 5’-3-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG ‘.

a análise estatística

os dados são expressos como a média ± sE Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo

t

teste de Student e

Χ

2 análises ou o teste de Mann-Whitney quando apropriado, e definido como

P Art 0,05.

resultados

via de sinalização Notch é regulada em células-tronco do câncer de pâncreas

a via de sinalização Notch foi mostrado para ser ativado em células de câncer pancreático [24]. Nossa hipótese é que componentes da via de sinalização Notch pode ser ainda regulada na subpopulação de células-tronco do câncer de pâncreas. Usando xenoenxertos de cancro do pâncreas humanos primários a partir de 8 diferentes tumores de pacientes foram avaliados os níveis de componentes da via de sinalização Notch expressão em células-tronco cancerosas em comparação com as células tumorais em massa. Os tumores dos xenoenxertos foram isolados e transformados em suspensões de células individuais que foram então ordenadas com base no perfil de triplo-marcador CD44 + /CD24 + /SEC + para obter separadamente os CSCs e não-CSCs (Figura 1A). A análise por RT-PCR quantitativa de ARN obtido a partir de CSCs e não-CSCs para a expressão de componentes da via de sinalização de Notch foi realizada. Os resultados sugerem a regulação positiva de componentes da via de Notch em CSCs acima que de não-CSCs (Figura 1B). CSCs em seis de oito tumores expressa pelo menos um receptor de Notch em um nível 1,5 vezes relativamente não-CSC. De modo semelhante, pelo menos um ligando de Notch foi regulada positivamente 1,5 vezes na CSC sobre o não-CSC em seis de oito tumores. De nota, não se detectou expressão de qualquer receptor de ligando Notch4 DLL3 em qualquer CSC ou compartimentos não CSC em qualquer dos xenoenxertos primárias testadas (dados não mostrados). Houve uma média de 1,75 vezes maior expressão do gene alvo via Notch Hes1 nos CSCs em comparação com não-CSCs. Estes resultados sugerem que os CSCs diferencialmente expressar níveis mais elevados de componentes da via de Notch e que o percurso é correspondentemente activada, como mostrado pela expressão aumentada de HES1.

. A análise de citometria de fluxo. células de xenotransplante de cancro dissociadas de baixa passagem humanos pancreáticas foram coradas com DAPI e anticorpos para H2K, ESA, CD44 e CD24. células mortas DAPI positivas e células de rato positivo H2K ambos foram eliminados da análise. A população CSC (com marcador de superfície ESA

+ /CD44

+ /CD24

+) foi fechado por ambos P5 e P7, ea população não-CSC a partir P6. níveis B. transcrição de componentes da via Notch em CSC, em comparação com a não-CSC obtido por qPCR, normalizados para GAPDH. A mudança dobra média entre tumores é representado por uma barra horizontal.

inibição da via Notch

Com base na observação de que a sinalização Notch componentes da via está regulada no câncer de pâncreas e, em particular CSC pancreático , estudamos também a contribuição da ativação da via Notch para a função CSC pancreático. Gama secretase catalisa o terceiro passo de clivagem do receptor Notch que liberta o domínio intracelular de Notch. Este passo permite que o receptor de Notch para, em seguida, transloca para o núcleo e activar a sinalização de Notch, resultando na sobre-regulação da expressão do gene alvo. A inibição da gama-secretase, com um inibidor de gama-secretase pode, assim, bloquear a activação da via de sinalização de Notch. A incubação de tumorspheres cancro do pâncreas com doses crescentes de GSI reduziu os níveis do gene alvo Notch HES1 expressão de uma forma dependente da dose (Figura 2A, B) (p 0,001 versus controlo). Tendo confirmado que GSI podem inibir a sinalização Notch em células de cancro do pâncreas, o próximo avaliou o efeito da inibição da via de Notch especificamente no compartimento do CSC. pancreáticas células cancerosas tratadas com GSI mostraram uma redução significativa nos CSCs com a ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ perfil marcador em comparação com células não tratadas (controle 2,76 ± 0,16% vs. 1,43 ± 0,15% com GSI p = 0,013) (Figura 2C, D). Este resultado sugere um papel para a ativação da via Notch na manutenção CSC.

A. tumorspheres de células do cancro do pâncreas primários (derivados de paciente 5) foram cultivadas em meio esfera contendo diferentes concentrações de GSI como indicado, durante 48 horas antes da análise de Western blot com um anticorpo para HES1 ou β-actina. B. A quantificação dos níveis de ARNm após o tratamento HES1 GSI durante 48 horas (* p 0,001 versus controlo). células de cancro do pâncreas na forma C. esfera foram tratados com veículo de controlo (DMSO) ou 8 uM GSI durante 48 horas. A análise FACS de células de DMSO tratados de controle (

painel superior

) e GSI trataram células (

painel inferior

). população CSC com marcador de superfície da ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ foi identificado por essas células em ambos os portões P5 e P7. D. Quantificação da ESA

+ /CD44

+ /CD24

+ população CSC após o tratamento GSI (* p = 0,013 vs. DMSO) DMSO e.

Um dos definindo características de CSCs é auto-renovação, que pode ser ensaiada in vitro por medição tumorsphere formação através de múltiplas passagens. CSCs pancreáticas identificados com a ESA perfil marcador

+ /CD44

+ /CD24

+ tem a capacidade de formar esferas em condições de não aderentes que os distingue de células-tronco não-cancerosas, que não têm essa capacidade [10]. Tendo em inibição dependente da dose observado da via de Notch com doses crescentes de IGS e uma diminuição resultante da percentagem de CSC pancreático, foi avaliado o impacto funcional sobre a função CSC, testando os efeitos da GSI em tumorsphere ensaios. Consistente com um efeito dependente da dose sobre a inibição da via de Notch, o tratamento de células de cancro do pâncreas com GSI causou uma diminuição dependente da dose na frequência formação tumorsphere primário (Figura 3A, p 0,01 vs. controlo)

.. células de câncer pancreático tumorspheres cultivadas durante 5 dias em meio esfera contendo concentrações indicadas de GSI. Imagens representativas de tumorspheres primários que se desenvolveram a partir de 1000 células por cavidade de cultura com concentrações crescentes de GSI. A quantificação de número de tumorspheres primárias (barras pretas) formados em cada concentração com 1000 células semeadas por poço (* p 0,01 vs controlo). tumorsphere formação secundária (barras cinzentas) do tumorspheres tratados com GSI foram dissociadas em células isoladas, lavadas e cultivadas durante 5 dias em meio normal sem GSI esfera (** p 0,01 vs controlo). B. Tumorspheres tratada com GSI a concentrações crescentes coradas com iodeto de propídio (PI) e FITC-anexina V (ANV) e analisadas por citometria de fluxo para avaliar a extensão da apoptose (* p . 8 0,05 uM versus controlo, ** p 0,01 16 pM vs. controlo). C. análise do ciclo celular de tumorspheres pancreáticas tratados com controle de DMSO ou GSI em 0, 24, 48 e 72 horas. (* P 0,01 vs controlo). células de cancro do pâncreas D. cultivadas com quer 8 uM GSI ou controlo veículo (DMSO) durante 48 horas injectadas subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID. Imagens representativas de ratinhos implantados com células a partir dos grupos de tratamento indicados colhidas 21 dias após a injecção. As setas indicam a localização dos tumores. tumor de série dos tamanhos medições de ratinhos tratados com controlo de DMSO ou GSI em pontos de tempo indicados. N = 5 (* p 0,01 vs controlo).

Para determinar se a inibição observada da formação tumorsphere foi preservado após a exposição transitória a Notch inibição, tumorspheres tratados foram dissociadas em células isoladas e re -cultured em meios esfera normal sem GSI. Notavelmente, o efeito sobre a formação tumorsphere foi preservada mesmo após a remoção do inibidor de gama-secretase, como evidenciado pela diminuição da geração de tumorspheres secundários (Figura 3A, p 0,01 vs controlo).

Um efeito de GSI sobre apoptose poderia explicar esta redução na tumorsphere formação. Com efeito, observou-se um aumento da taxa de apoptose baseado em PI e AnnexinV coloração de células a partir de tumorspheres tratados com GSI em comparação com tumorspheres tratados com veículo (Figura 3B, p 0,05 8 pM vs. controlo, p 0,01 16 uM versus ao controle). Este resultado sugere que a apoptose contribui para a diminuição da capacidade de formação de tumorsphere as células tratadas com GSI. Também foi realizada análise do ciclo celular na ausência e presença de GSI, que revelou aumento acumulação de células em G1 com GSI em relação ao controle (p 0,01). progressão do ciclo celular prejudicada pode, portanto, também contribuem para a redução da tumorsphere formação com a inibição da via de sinalização Notch com GSI (Figura 3C).

Para validar ainda mais este observado efeito funcional in vitro inibição da via Notch, estudamos se o pré-tratamento com GSI podia inibir a formação de tumores in vivo. Neste ensaio, foram pré-tratadas células cancerígenas pancreáticas estabelecidos como tumorspheres com GSI durante 48 horas e, em seguida, implantadas células viáveis, tratados subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID (5 ratinhos por grupo). As células que foram não tratadas formaram tumores 5 dias mais cedo do que os pré-tratados com GSI e cresceram significativamente maior (p 0,01) do que aqueles que emana a partir de células pré-tratadas com IGS (Figura 3D)

inibição da via de Notch usando HES1. shRNA

Tal como observado na Figura 1B, o nível de mRNA de Hes1, um alvo /efetoras direta de Notch de sinalização luminosa, foi regulada em CSCs em comparação com não-CSCs em vários xenoenxertos primários. A sobre-regulação de HES1 foi consistentemente observado em xenoenxertos, em contraste com outros objectivos, tais como Notch Hey1 e Heyl (dados não mostrados). A fim de avaliar se os efeitos observados do GSI foram especificamente o resultado de inibir a via de sinalização Notch e não efeitos fora do alvo, utilizou-se construções de lentivírus que expressam controle e Hes1 shRNA visar especificamente Hes1. Knockdown de HES1 por shRNA foi confirmada em ambos os ARNm (p .001 controlo vs) e níveis de proteína (Figura 4A, B) e não afecta a clivagem de Notch1 a montante (Figura 4B). Regulação negativa do HES1 resultou na formação tumorsphere prejudicada (Figura 4C, D, P 0,001 versus controlo). Fornecendo mais evidências de que a activação da via de Notch contribui para a função pancreática CSC

. células de câncer pancreático transduzidas com controlo ou Hes1 shRNA colhidas após cultura durante 4 dias. HES1 níveis de transcritos quantificado por qRT-PCR, normalizadas para GAPDH (* p 0,001 versus controlo). B. Os lisados ​​celulares foram transferidas para HES1 Ocidental, Notch1, clivado Notch1, ou β-actina.