Sumário

O epitelial para mesenquimal transição (EMT) é um processo de desdiferenciação que tem sido implicada na metástase e a geração de células cancerosas iniciar (CICs) em tumores sólidos. Para examinar EMT no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), utilizou-se um sistema de três células de cultura tridimensional (3D), em que as células foram co-estimuladas com factor de necrose tumoral alfa (TNF) e factor de crescimento transformador beta (TGF-p). culturas NSCLC esferóides exibir expressão elevada de fatores de mestre-chave de transcrição EMT,

TWIST1

,

SNAI1 /Tablet Snail1,

SNAI2 /Slug

e

ZEB2 /SIP1

, e são altamente invasivo. culturas mesenquimais NSCLC apresentam características CIC, exibindo elevada expressão de fatores de transcrição

KLF4

,

SOX2

,

POU5F1 /Oct4

,

MYCN

, e

KIT

. Como resultado, estes CIC putativo exibir um câncer fenótipo “stem-like” através da formação de metástases pulmonares sob diluição limitante celular. O factor de transcrição pleiotrópico, NF-kB, tem sido implicada na metástase de EMT e. Assim, começou a desenvolver um modelo de NSCLC de caracterizar ainda mais o papel da activação do NF-kB, no desenvolvimento de AIC. Aqui, demonstramos que a indução de EMT resultados em culturas em 3D constitutivo a actividade de NF-kB. Além disso, a inibição do NF-kB, resultou na perda de

TWIST1

,

SNAI2

, e

ZEB2

indução, e uma falha de células para invadir e metastizar. Nosso trabalho indica que o NF-kB é necessário para NSCLC metástase, em parte, por fatores de transcrição mestre-switch transcricionalmente upregulating necessários para EMT

Citation:. Kumar M, Allison DF, Baranova NN, Wamsley JJ, Katz AJ , Bekiranov S, et al. (2013) NF-kB regula mesenquimais transição para a indução de células de iniciação não-pequenas células do cancro do pulmão. PLoS ONE 8 (7): e68597. doi: 10.1371 /journal.pone.0068597

editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Janeiro, 2013; Aceito: 30 de maio de 2013; Publicação: 30 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kumar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho era financiado pelo National Institutes of Health concede R01CA132580, R01CA104397 (a MWM) e R01CA136705 (a DRJ). Todos os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

desenvolvimento do cancro da neoplasia maligna pré-cedo para doença metastática total é um processo em múltiplos passos que envolve interacções tumor epitelial-estromal, angiogénese, e infiltração de células pró-inflamatórias associadas ao tumor [1], [2]. Uma hipótese emergente propõe que este meio de interacções célula-célula, factores de crescimento e citocinas conhecido como o microambiente do tumor, estimula a morfogénese no interior das células tumorais a que se refere a como a transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) [3] – [5]. EMT induz uma redistribuição intracelular de arquitectura, diminuição da adesão célula-célula, e perda de polarização celular. As células de carcinoma, que tenham sido submetidos a EMT são caracteristicamente móveis, altamente invasivo e metastático. Ao longo dos últimos anos, EMT, também tem sido reconhecido como um programa de diferenciação atribuídos a geração de células de iniciação de cancro ou de iniciação do tumor (CICs) que são importantes na manutenção do cancro “stemness” [6] – [9] .

Embora várias citocinas e factores de crescimento induzem EMT, um dos factores mais bem estudados é factor de crescimento transformante beta (TGF-p) [2], [3], [10] – [13]. A estimulação das células com TGFp resulta na expressão dos factores de transcrição EMT-mestre de comutação, TWIST1, SNAI1 /Snail, SNAI2 /Slug, e ZEB2 /SIP1 que em conjunto regulam genes diferencialmente para promover o fenótipo mesenquimal [10], [12]. Embora a pesquisa extensiva detalha a capacidade de TGF-p para induzir EMT, evidências indicam que o factor de necrose tumoral (TNF) potencia ainda mais a transição [14], [15]. Durante a progressão da doença, a secreção de TGF-p dentro do microambiente do tumor ocorre por meio de vários tipos de células diferentes, incluindo fibroblastos associados a tumores, enquanto a secreção de TNF tem origem a partir de macrófagos associados a tumores M2 [3], [16], [17]. Uma hipótese vigente no campo é que a exposição de células cancerosas a estas citocinas dentro do microambiente do tumor EMT promove, desdiferenciação, e a formação de CICs [2], [5], [17].

TNF é um potente citoquina pró-inflamatória que estimula cascatas de sinalização para activar factor nuclear kappa B (NF-kB). Como factor de transcrição, NF-kB desempenha um papel essencial na expressão de genes envolvidos na iniciação e progressão do cancro. Regulação positiva da actividade de NF-kB ocorre frequentemente em tumores sólidos e hematológicos primários, correlacionando diretamente com morfologia diferenciada-de, estágio do tumor avançado, e mau prognóstico clínico [18]. Importante, NF-kB tem sido associada a AIC mamárias [19], [20]. NF-kB induz e sustenta EMT em sistemas modelo por meio de dois mecanismos, supra-regulação de factores de transcrição-mestre de comutação EMT [21] – [24] e estabilização de Snail [25]. NF-kB é composto por cinco membros da família REL: RelA /p65, RelB, CREL, p50 e P52. Em células não estimuladas, subunidades IkB inibitórios associar com dímeros de NF-kB e sequestram-los no citoplasma. Após a estimulação celular por citocinas pró-inflamatórias, IκBα é fosforilado pelo complexo cinase IkB (IKK), ubiquitinadas pelo SCF-ligase E3 tipo, E3RS

IkB /β-TRCP e degradado pelo proteassoma 26S [26]. Liberado NF-kB, em seguida, transloca para o núcleo para ativar a expressão do gene através do recrutamento de coactivators transcrição [27]. O nosso laboratório mostrou que a modificações pós-tradução em RelA são necessários para a actividade completa de transcrição NF-kB [27] – [30]

Embora EMT em modelos de cancro da mama requer a actividade de NF-kB [31], o papel de. este fator de transcrição para estimular EMT e desenvolver CICs em NCSLC não foi estudada em detalhe. No entanto, existe uma forte evidência para a presença de células estaminais /progenitoras NSCLC em adenocarcinomas primários e linhas celulares estabelecidas [32] – [35]. Aqui, demonstramos que a activação coordenada de TNF e de TGF-p cascatas de sinalização induz eficazmente EMT e a expressão de genes relacionados à desdiferenciação e stemness. Além disso, mostra-se que células mesenquimais NSCLC possuem constitutivamente activa NF-kB, e que a inibição do NF-kB diminui EMT, formação de CIC, e o potencial metastático.

Materiais e Métodos

cultura celular e reagentes

NSCLC linhas A549, H359, H1299, H157 e foram obtidos a partir de ATCC e mantidas como culturas 2D em DMEM (Cellgro), FBS a 10% (Invitrogen) e penicilina /estreptomicina (Invitrogen). Os anticorpos utilizados incluem: E-caderina (BD Pharmingen- 610404), N-caderina (BD Pharmingen- 610.920), Vimentin (V6630), fibronectina (BD Pharmingen- 610.078), α-tubulina (Sigma T6793), HMGA2 (Biocheck 59170AP ), TWIST1 (Cell Signaling 4119), Snail1 (Cell Signaling 4719), SIP1 (SCBT sc-48789), Slug (Abcam ab27568), IκBα (PS32, Cell Signaling 2859), IκBα (SCBT sc-371), RELA (pS536 , Cell Signaling 3031), RELA (SCBT sc-372) e M2-Flag (Sigma F1804). inibidores da protease BaculoGold foram obtidos da BD Biosciences. TGF (PHG 9204) e TNF (PHG 3015) foram adquiridos a partir de tecnologias Invitrogen /Life. Todos os outros produtos químicos eram da Sigma.

tridimensionais culturas esferóides multicelulares

tridimensionais culturas esferóides multicelulares foram criados usando um método de suspensão de gotículas modificado [36]. As células foram cultivadas a cerca de 80% de confluência em placas de cultura de tecidos padrão. As células foram, subsequentemente, tratadas com tripsina, ressuspendidas em meio DMEM /FBS a 10%, e contados. Para criar 25.000 esferóides de células, a suspensão de células foi diluída até uma concentração de 1.000.000 células /ml, e 25 uL da suspensão de células foram pipetadas para a parte inferior de uma tampa de placa de cultura de tecidos estéreis de 10 cm. Cada tampa detém aproximadamente cinquenta gotículas. Depois de carregar as gotículas, a tampa foi colocada sobre uma placa de cultura de tecidos contendo 6 mL de PBS estéril e incubada durante 48 horas para facilitar a agregação celular e formação de esferóides. Os esferóides recém-formados foram então transferidas para placas de 10 cm de suspensão contendo DMEM e FBS a 2% para impedir a ligação de células ao prato. placas de suspensão foram feitos através da adição de 8 mL de solução de poli-HEMA (P3932 Sigma-Aldrich, 10 mg /ml) em 95% de etanol a placas de poliestireno prato de petri estéreis (Fisher Scientific). As placas foram então incubadas durante 24 horas em um ambiente estéril para permitir que o etanol se evaporar. Antes da utilização, as placas foram lavadas com PBS estéril para remover o etanol residual ou qualquer outros contaminantes. Cada placa suspensão suporta até 100 esferóides. Após a transferência, os esferóides foram tratados com veículo ou com 10 ng /mL de TNF e 2 ng /ml de TGF-p, e incubou-se durante 48 horas. Após a incubação, as células foram submetidas a um segundo tratamento de veículo ou TNF e TGFp, e incubadas durante 48 horas adicionais. Os esferóides foram então recolhidas e analisadas por vários ensaios.

Microscopia de imunofluorescência

As células A549 foram semeadas em lamelas de vidro e submetidos a EMT indução ou deixada sem tratamento. Após a indução, as células foram fixadas em metanol a 100% e, posteriormente, incubadas com anticorpos primários para o domínio extracelular da E-caderina (SCBT, SC-7870). Um AlexaFlour-conjugado, anticorpo de cabra anti-coelho (Invitrogen) foi utilizado como anticorpo secundário, e de imunofluorescência indirecta da E-caderina foi fotografada utilizando um microscópio de fluorescência Nikon E3800.

migração e invasão

in vitro

migração e invasão ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante (BD Biosciences). culturas 2D e 3D foram desagregados por tripsina e posteriormente contados. 1 × 10

5 células (migração) ou 1 × 10

4 células (invasão) foram semeadas em DMEM simples no topo poço de uma placa de controle Transwell (BD 354578) ou placa invasão Matrigel (BD 354480). O poço do fundo foi carregado com DMEM contendo 10% de FBS como um quimioatractor, e as placas foram incubadas durante oito horas (migração) ou vinte e quatro horas (invasão) a 37 ° C e 5% de CO

2. Em seguida, as células no lado superior da membrana foram removidos e as restantes células foram fixadas em metanol a 100% e coradas com violeta de cristal a 0,1%. As células marcadas foram analisados ​​e quantificados utilizando Adobe® Photoshop.

Tumor modelo

monocamada (2D) e 3D culturas A549 que tinham sido deixados sem tratamento ou tratados com TNF e TGF foram tratadas com tripsina, ressuspendidas em DMEM /FBS a 0,5%, e cuidadosamente contadas e diluídas no volume apropriado para injecção. As células foram por via subcutânea (SC) injetado em outbred fêmea Crl: ratos nus nu /nu (Charles River). Cinco ratinhos foram injectados por condição experimental. Todos os estudos em animais foram realizados tal como três experiências independentes. Os ratinhos foram sacrificados quarenta dias pós-injecção. Os tumores primários SC foram removidos e pesados. Além disso, os pulmões foram removidos e fixados em formalina, e metástases pulmonares superfície foram contadas. Para quantificar a quantidade de carga total do tumor no tecido formalina pulmão fixo, o DNA genómico foi extraído [37] e ensaiado quanto à presença de material genómico humano, tal como descrito usando quantitativo em tempo-polimerase verdadeira reacção em cadeia (QRT-PCR), primers específicos para humanos endógena retrovírus-3 (ERV3, Tabela S1) [38], [39].

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com a recomendação do Comité de animal Cuidado e Uso (ACUC) da Universidade de Virginia. O protocolo foi aprovado pelo ACUC Número 3914. Todos os experimentos foram encerrados após 40 dias em que os tumores SC época eram menos de 1,0 cm

3 em tamanho; Assim, a restrição a carga tumoral. Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e sofrimento.

QRT-PCR, imunotransfer�cias e eletroforética ensaios de mudança de mobilidade (EMSAs)

QRT-PCR e immunoblot experimentos foram realizados como descrito anteriormente [28 ]. Os iniciadores de PCR estão apresentados na Tabela S1. Os extractos nucleares foram preparados a partir de esferóides utilizando A549.V e linhas celulares A549.I tratados com ou sem TNF e TGFp. ensaios EMSAs e supershift foram realizados como descrito anteriormente [40].

Estatísticas

Se for caso disso, as comparações entre os grupos experimentais foram realizados através da realização de um estudante de uma cauda

t

teste no Microsoft Excel. Os dados para todos os experimentos foi considerado estatisticamente significativo quando p . 0,05

Resultados

Um modelo para estudar EMT em NSCLC

TNF foi mostrado para potenciar EMT mediada por TGF através a activação de vias co-estimuladoras [15]. Para confirmar esta observação em nosso modelo tridimensional (3D), um timecourse foi realizada utilizando ambas as citocinas em conjunto e isoladamente. culturas esferóides multicelulares foram criados usando um método de suspensão de gotículas modificado [36]. Após dois dias, esferóides foram suspensas em placas revestidas com poli-HEMA e tratou-se a cada dois dias, com as citocinas indicadas para induzir EMT (Figura 1A). Foram coletadas amostras de não tratados (0 dias) e as culturas tratadas com citocinas (1-8 dias). Epitelial (caderina-E) e mesenquimais (N-caderina, vimentina, fibronectina) marcadores foram medidos por immunoblot. O tratamento com TNF resultou num aumento modesto em N-caderina e fibronectina, mas não demonstrou diferenças de outros marcadores (Figura 1B). Consistente com a indução de EMT, TGFp tratamento resultou em uma perda de expressão de E-caderina e um aumento em N-caderina, vimentina, e fibronectina. Além disso, a co-estimulação com TNF e TGFp produziu um fenótipo mais mesenquimais e persistiu ao longo do curso tempo oito dias (Figura 1B). Importante, a estimulação com TNF e TGFp eficazmente induzida EMT em ambas as linhas de células A549 e H358 dentro de quatro dias de tratamento, em comparação com H1299, já que mostra as alterações na E-caderina e vimentina (Figura 1C). Com base em resultados na Figura 1, utilizou-se o período de quatro dias durante os experimentos remanescentes.

(A) Um cronograma ilustra o procedimento utilizado para criar uma população de células mesenquimais tridimensional a partir de monocamadas confluentes. culturas (B) Spheroid de células A549 foram tratados, com TNF, o TGF-p, ou ambas as citocinas cada quarenta e oito horas para os tempos indicados. análise Immunoblot mudanças medidas em epitelial (E-caderina) e mesenquimais (N-caderina, vimentina, fibronectina) marcadores mais de um timecourse oito dias. culturas (C) 3D de várias linhas celulares de NSCLC (A549, H358, H1299) foram incubadas durante noventa e seis horas na ausência ou presença de TNF e de TGF-p. marcadores epiteliais e mesenquimais foram posteriormente medido por immunoblot. Os resultados da Figura 1B e 1C são exemplos representativos de pelo menos três experiências independentes; α-tubulina actua como um controlo de carga de proteína.

culturas 3D sofrer EMT de forma mais eficiente do que as culturas 2D

Para determinar se as culturas de A549 3D sofrer EMT de forma mais eficiente do que duas dimensões (2D ) culturas em monocamada, medimos a expressão de marcadores epiteliais e mesenquimais em resposta à estimulação com TNF e TGF-p, como descrito na Figura 1. a seguir ao tratamento de citocinas, culturas 3D mostram uma perda significativa de

CDH1 /e-caderina

expressão quando comparado a culturas 2D (Figura 2A). Além disso, os esferóides também possuem aumento da expressão de marcadores mesenquimais

VIM

,

HMGA2

, eo mestre-switch EMT fatores de transcrição,

TWIST1

,

SNAI1 /Snail1

,

SNAI2 /Slug

e

ZEB2 /SIP1

(Figuras 2A e 2B). A análise de imunotransferência de culturas esferóides confirmar que a expressão de ARNm diferencial resultou numa alteração correspondente dos níveis de proteína (Figura 2C). Adicionalmente, examinámos as alterações na morfologia celular e a localização da E-caderina por meio de microscopia. Ambas as culturas 2D e 3D foram tratados com citocinas, tal como descrito, tripsinizadas, re-semeadas em lamelas de vidro e coloração de imunofluorescência indirecta foi realizada dezoito horas mais tarde. Como esperado, não tratadas e amostras de monocamada esferóides A549 mostrou robusta expressão de E-caderina, embora a localização juncional apareceu reduzido em células a partir das culturas em 3D (Figura S1). Além disso, as células derivadas de esferóides tratados com citocinas exibida perda aumentada de caderina-E, quando comparado com as amostras tratadas 2D, o que sugere que as culturas foram submetidos 3D EMT mais eficiente. Os resultados apresentados na Figura 2 e Figura S1 ilustram a indução de EMT significativa em culturas de 3D tal como medido por alterações em marcadores mesenquimais, EMT interruptor principal da expressão do factor de transcrição, e morfologia celular.

(A e B) de monocamada (2D) e as culturas em 3D de células A549 foram deixados sozinhos (No Add) ou tratadas com TNF e TGF (TNF /TGF) por noventa e seis horas. Expressão de marcadores epiteliais (

CDH1

), marcadores mesenquimais (

VIM, HMGA2

), e os fatores de mestre-chave de transcrição EMT (

TWIST1, SNAI1, ZEB2, SNAI2

) foram medidos por qRT-PCR. (C) A análise de imunotransferência de culturas A549 3D, deixado sozinho (No Add) ou tratadas com TNF e TGF (TNF /TGF), foi realizada em E-caderina, Vimentin, HMGA2, TWIST1, Snail1, SIP1, Slug, e α- tubulina. Os resultados na Figura 2A e 2B foram normalizados para

GAPDH

, e são calculadas a média ± DP, * p 0,05, n = 3. Imunotransferência na Figura 2C são exemplos representativos de pelo menos três experiências independentes

.

células mesenquimais NSCLC são genes invasivos e endogenamente expressa conhecidos para promover propriedades estaminais-como

Fenotipicamente, células mesenquimais têm taxas de migração alto e secretar enzimas que degradam a matriz extracelular para facilitar a invasão celular. Usando

in vitro

transpo� ensaios, medimos as migração e invasão características de células A549 cultivadas tanto como culturas 2D ou 3D. Curiosamente, não tratadas culturas esferóides 3D mostraram taxas de migração mais elevados do que as culturas em monocamada em 2D (Figura 3A, esquerda). No entanto, o tratamento das culturas com TNF e 3D TGFp potenciada ainda mais a migração quando em comparação com culturas não tratadas 3D. Esferóides tratados com citocinas invadiram através de Matrigel mais eficaz do que qualquer outra condição (Figura 3A, à direita). Além disso, citocinas tratada esferóides A549 exibido expressão regulada positivamente de

MMP9

,

LOX

, e

COL22A1

(Figura 3B), genes conhecidos para potenciar a invasão [41], [42 ]. Estes resultados demonstram que a cultura de esferóides 3D na presença de TNF e de TGF-p estabelece uma população mesenquimais altamente invasivo. Finalmente, esferóides tratados com citocinas mostrou upregulation endógena de marcadores associados com de-diferenciação e manutenção de CICs [43] – [48], incluindo

KLF4, SOX2, POU5F1 /Oct4, MYCN

, e

KIT

(Figura 3C). Os dados apresentados na Figura 3 indicam que a co-estimulação de esferóides com TNF e o TGF-p promove mudanças fenotípicas em células A549 que resultam num aumento da invasão e expressão de produtos de genes associados a propriedades de haste semelhante.

monocamada e 3D culturas A549 foram deixados sozinhos (No Add) ou tratadas com TNF e TGF (TNF /TGF) por noventa e seis horas. (A) As células foram desagregadas e subsequentemente submetido a ensaios de migração e invasão. (B e C) Expressão da invasão (

MMP-9, LOX, COL22A1

) e haste marcadores de células (

KLF4, Sox2, POU5F1, MYCN, e KIT

) foi medido por QRT- PCR. Os resultados na Figura 3 são calculados média ± SD, * p . 0,05, n = 3. Resultados de 3B e 3C foram normalizados para

GAPDH

As células mesenquimais são altamente metastático e câncer de exibição fenótipos iniciando

Para examinar se a indução de EMT promove o desenvolvimento de CICs

in vivo

, utilizamos um modelo de tumor xenoenxerto em ratinhos nus. TNF e TGFp tratadas culturas 2D e 3D foram desagregadas e as suspensões de células foram injectados SC no flanco direito de ratinhos nus. Quarenta dias depois, os animais foram sacrificados e os tumores foram ressecados e SC pesados ​​enquanto que os pulmões foram excisados ​​e marcados para metástases de superfície. Para nossa surpresa, TNF e células tratadas com TGFp não formam tumores SC para a mesma extensão como culturas 2D tratadas com citocinas (Figura 4A, esquerda). No entanto, o exame da superfície do pulmão nesses camundongos revelaram extensa metástase (Figura 4A, à direita). A única explicação plausível para estes resultados é que as células mesenquimais de culturas 3D invadiram e metástase para o pulmão sem desenvolver tumores SC.

(A) monocamada e 3D culturas A549 foram tratadas com TNF e TGF por noventa e seis horas . As células foram desagregadas e injectada SC em ratinhos nus (1 × 10

6 células /animal). Quarenta dias depois, os tumores foram ressecados SC primárias e pesados. Além disso, os pulmões foram removidos e o número de metástases de superfície eram determinar. (B) monocamada e 3D A549 culturas foram ou deixadas sem tratamento ou tratada com TNF e o TGF-p e o número de células limitadoras (1 × 10

3 /animal) foram injectados SC em ratinhos nu para avaliar a presença de AIC. Metástase foi avaliada por contagem de tumor de pulmão de superfície e carga tumoral pulmonar foi avaliada utilizando genómico QRT-PCR para detectar ADN humano no tecido pulmonar total. Os dados do peso e de metástases do pulmão Figura 4 são a média ± S.D. de cinco ratos por condição, * p 0,05, n = 3 experiências independentes. dados genómico qRT-PCR a partir de Figura 4B são normalizados para o tecido pulmonar total (mg).

de medição da extensão de metástases de células sob diluição limitante demonstra um teste de confiança para a presença de CICs enriquecidas em células epiteliais derivadas tumores [49]. Portanto, os experimentos foram repetidos usando um mil células por injecção SC. suspensões de células, derivadas de TNF e TGF-p esferóides tratados, produziu mais metástases pulmonares superfície sob diluição de células limitante do que monocamadas tratadas com citocinas ou culturas 3D não tratados (Figura 4B esquerda). Limitando os ensaios de diluição de células indicam que a indução de EMT em culturas 3D produz uma população CIC que metastiza para eficazmente pulmão. Como esperado, a análise de DNA isolado a partir de pulmões de rato confirmou a presença de carga metastática e verificou-se que as lesões eram de origem humana (Figura 4B direita). Concluímos a partir das experiências da Figura 4, que de-diferenciação, formação CIC e potencial metastático são significativamente melhoradas em culturas esferóides induzido por EMT.

NF-kB é constitutivamente activa em culturas 3D e é necessário para a indução de EMT

TNF, um potente ativador de NF-kB, aumenta a indução de EMT em linhas celulares de NSCLC. Portanto, avaliamos se os resultados de indução EMT na ativação da sinalização de NF-kB por immunoblot. Curiosamente, esferóides A549 mesenquimais apresentou actividade de IKK constitutiva, conforme medido por meio de anticorpos específicos de fosfo que detectam IκBα PS32 e RelA pS536 (Figura 5A e Figura S2A). Mudança no E-caderina e níveis Vimentina confirmou EMT eficiente nos esferóides tratados com citocinas. Além disso, as experiências de qRT-PCR demonstraram um aumento da expressão de genes de NF-kB-regulados

IL8

e

BIRC3 /cIAP2

em culturas mesenquimais 3D (Figura 5B). Colectivamente, estes dados indicam que a citocina-tratamento de culturas em 3D A549 resulta no aumento da fosforilação de substratos e IKK-regulada constitutiva de activação da transcrição NF-kB.

monocamada e 3D culturas de células A549 foram incubadas com citocinas durante noventa -seis horas. células mesenquimais A549 (A) exibir constitutiva NF-kB activado vias, conforme determinado utilizando anticorpos específicos para fosfo-IκBα e RelA. (B) brutas e TNF e TGF-p estimulada 2D e 3D culturas de células A549 foram colhidas e analisadas para a expressão de NF-kB genes regulados por qRT-PCR. (C e D) de três culturas dimensionais A549.V (controlo de vector) e A549.I (SR-IkB) foram incubadas durante noventa e seis horas na ausência ou presença de TNF e de TGF-p. (C) As imunotransferências confirmar a expressão da Bandeira marcado com SR-IκBα na linha A549.I, que bloqueada com sucesso translocação nuclear e de ligação ao ADN, tal como medido por EMSA. (D) QRT-PCR confirmou a incapacidade da célula A549.I para regular positivamente genes de NF-kB-regulados seguintes TNF e TGFp tratamento. Imunotransferência na Figura 5A é um exemplo representativo de três experiências independentes. Os resultados na Figura 5B e 5D são calculados média ± SD, * p 0,05, N = 3. Valores de RNA foram normalizados para

GAPDH

Para determinar a importância de NF-. atividade kB durante a indução da EMT em linhas celulares de NSCLC, piscinas clonais estáveis ​​expressando o super-repressor IκBα (SR-IκBα) foram gerados. O SR-IκBα é resistente à degradação proteossómica, e, consequentemente, sequestra NF-kB no citosol. As células que expressam a proteína SR-IκBα, por conseguinte, exibir uma inibição da transcrição NF-kB mediada por [50]. Figura 5C (top) confirma expressão de Flag-tag SR-IκBα em células estáveis ​​A549 (A549.I) em comparação com células de controlo de vector vazio (A549.V). Além disso, extractos proteicos nucleares a partir de culturas de esferóide A549.I, tratadas com TNF e TGFp, não tinha actividade de ligação de NF-kB de ADN em comparação com os extractos A549.V (Figura 5C, parte inferior). supershift experiências confirmam que a actividade de NF-kB é composto predominantemente de um complexo p50-RelA heterodímero (Figura S2B). ensaios de qRT-PCR mostram a indução mediada por citocina reprimida de

IL8

e

BIRC3 /cIAP2

em células A549.I quando comparado com células de controlo A549.V (Figura 5D). Em contraste com doses elevadas de TNF (100 ng /ml), baixas doses (10 ng /ml) não resultou em uma perda de viabilidade celular em linhas de A549.I, já que a expressão do gene de arrumação, HPRT, não se alterou e foi utilizado para normalização na Figura 5D. Estes dados verificar que a expressão de SR-IκBα na linha celular A549.I bloqueia eficazmente a actividade de transcrição NF-kB.

Caracterização de NF-kB na potenciação do fenótipo mesenquimal

NF-kB foi demonstrado que regulam a expressão de factores de transcrição-mestre de comutação EMT em vários sistemas modelo [21] – [24]. Portanto, a hipótese de que a inibição da actividade de NF-kB na linha celular A549.I iria diminuir a indução de EMT. A análise de imunotransferência confirmaram que as células A549.I falhar para regular negativamente a expressão de E-caderina ou regular positivamente os marcadores mesenquimais (vimentina, N-caderina e fibronectina) em comparação com células de controlo (Figura 6A). Além disso, as células A549.I tratados com citocinas mostrou apenas upregulation mínima de

TWIST1

,

ZEB2

e

SNAI2

expressão gênica seguinte TNF e tratamento TGF (Figura 6B). Estes resultados indicam que o NF-kB é necessário para upregulate

TWIST1

,

ZEB2

e

SNAI2

, enquanto expressão de

SNAI1

aparece independente do NF- transcrição kB-dependente na linha celular A549.I. Estes resultados sugerem que a expressão de factores de transcrição-mestre de comutação EMT críticos requer a actividade de NF-kB. Células

(A) A549.I não mostram alterações nos marcadores mesenquimais, como determinado por análise de imunotransf erência. (B) de NF-kB é necessário para regular a expressão de ARNm dos factores de transcrição-mestre de comutação. (C) culturas Spheroid de A549 e linhas de células H157, expressando vector vazio ou o super-repressor Bandeira-IkB, foram deixados sozinhos (No Add) ou tratadas com TNF e TGF (TNF /TGF) por noventa e seis horas. As células foram desagregadas e submetidas a ensaios de invasão. (D) A549.V e culturas A549.I 3D foram deixados sozinhos (No Add) ou tratadas com TNF e TGF (TNF /TGF) por noventa e seis horas. As células foram desagregadas e injectada SC em ratinhos nus (1 × 10

6 /animal). Quarenta dias depois, os animais foram sacrificados e o número de metástases pulmonares superficial foram calculados. Além disso, os tumores foram excisados ​​e SC peso tumoral determinada molhado. Os dados do peso e de metástases do pulmão Figura 6 são a média ± S.D. de cinco ratos por condição, * p 0,05, n = 3 experiências independentes. Os gráficos na Figura 6 são a média ± D.P., * P 0,05, de três experiências independentes. Dados com

P

valores superiores a 0,05 foram considerados não significativos (

ns

). experimentos QRT-PCR são normalizados para

GAPDH

expressão.

Em seguida, avaliamos se NSCLC necessário NF-kB para a invasão usando transpo� ensaios. Inibiu a actividade de NF-kB em células A549.I abolida através de invasão de Matrigel quando comparado com as linhas de controlo (Figura 6C). Este efeito não foi linha celular específica uma vez que uma outra linha NSCLC expressando o SR-IkB (H157.I) mostraram resultados similares como células A549.I. Como os dados apresentados na Figura 6 indicam que o NF-kB é necessário para NSCLC de se submeter EMT, foi testada a A549.V e A549.I células quanto à sua capacidade para metastizar para pulmonar utilizando um modelo do ratinho nu. Como esperado, as células tratadas com citocinas A549.I não conseguiu formar metástases do pulmão (Figura 6D, esquerda). A capacidade destas células para a metástase do pulmão não foi devido a uma perda de viabilidade celular ou uma incapacidade para formar tumores primários, uma vez que não tratada A549.I formado tumores SC com taxas de crescimento similares como células A549.V (Figura 6D, direita). Assim, os dados mostrados na Figura 6 indica que o TNF e de TGF-p tratadas culturas 3D NSCLC requerem NF-kB para regular positivamente factores interruptor principal da transcrição, EMT induzir, promover e propriedades invasivas. Além disso, sem a actividade de transcrição NF-kB células A549 perdem sua capacidade de metástase para pulmões, sem afetar o crescimento do tumor primário.

Discusson

NF-kB regula EMT para potenciar progressão metastática do NSCLC

Nós implementamos um sistema de cultura 3D simples e relativamente rápido para analisar a importância da sinalização de NF-kB durante a indução da EMT e propagação CIC dentro de linhagens de células NSCLC. Em resposta à exposição ao TNF e TGF-p, as culturas de A549 esferóides exibida uma perda de E-caderina e a expressão elevada de marcadores mesenquimais, N-caderina, vimentina, e fibronectina. O aumento da expressão de marcadores de proteína mesenquimais provavelmente ocorre devido à indução dos fatores EMT mestre-chave de transcrição,

TWIST1

,

SNAI1

,

SNAI2

e

. Além disso, as populações de esferóides de células A549 mesenquimais mostram elevada expressão de fatores de transcrição endógenos conhecidos para potenciar desdiferenciação, incluindo

KLF4

,

SOX2

,

POU5F1

,

MYCN

e

KIT

. Interessantemente, as células A549 mesenquimais de culturas esferóides não conseguiu gerar grandes tumores SC, em comparação com culturas 2D. Apesar deste efeito, as células A549 tratadas com citocinas 3D exibido lesões metastáticas superfície pulmonares elevadas. Estes resultados suportam a hipótese de que os CIC extravasado para o sistema circulatório e metastizar para o pulmão sem a formação de tumores SC. Nós ainda demonstrado que induzidas EMT culturas 3D A549 efetivamente metástases para pulmão sob limitantes diluições celulares, confirmando a presença de um “tronco-like” população CIC enriquecido.