Abstract

Meduloblastomas e glioblastomas, os tumores cerebrais primários mais comuns em crianças e adultos, respectivamente, são extremamente difíceis de tratar. Os esforços para identificar novas proteínas essenciais para o crescimento destes tumores pode ajudar a promover a compreensão da biologia dos tumores, bem como, identificar alvos para as terapias futuras. A recente identificação de múltiplos transcrição paisagens de interação proteína de factor-centric em células-tronco embrionárias identificou numerosas proteínas pouco estudados, que são essenciais para a auto-renovação dessas células estaminais. Para identificar novas proteínas essenciais para o destino das células de tumor do cérebro, foi examinada a interacção rede proteína do factor de transcrição, SOX2, em células de meduloblastoma. Para este efeito, Tecnologia Proteína Multidimensional Identificação (mudpit) identificou 280 proteínas associadas a SOX2 na linha de células de meduloblastoma DAOY. Para começar a entender os papéis de proteínas associadas ao SOX2 em câncer no cérebro, nós nos concentramos em duas proteínas associadas ao SOX2, Musashi 2 (MSI2) e ubiquitina específico Protease 9x (USP9X). Estudos recentes implicaram MSI2, uma proteína de ligação a ARN putativa, e USP9X, uma enzima deubiquitinating, em vários cancros, mas não tumores cerebrais. Nós demonstramos que o knockdown de MSI2 reduz significativamente o crescimento de células de DAOY, bem como as células de glioblastoma U118 e U87. Nós também demonstrar que o knockdown de USP9X em DAOY, U87 e células tumorais do cérebro U118 reduz fortemente o seu crescimento. Juntos, nossos estudos identificar um grande conjunto de proteínas associadas ao SOX2 em células de meduloblastoma DAOY e identificar duas proteínas, MSI2 e USP9X, que merecem uma investigação mais aprofundada para determinar se eles são potenciais alvos terapêuticos para o cancro cerebral

Citation.: Cox JL, Wilder PJ, Gilmore JM, Wuebben EL, Washburn MP, Rizzino a (2013) o SOX2-interactome em células de câncer de cérebro identifica o requisito de MSI2 e USP9X para o crescimento de células do tumor cerebral. PLoS ONE 8 (5): e62857. doi: 10.1371 /journal.pone.0062857

editor: Robert W. Sobol, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de dezembro de 2012; Aceito: 26 de março de 2013; Publicado em: 07 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cox et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Saúde (2011-29, 2012-33) Nebraska. EW foi apoiado em parte por uma bolsa de formação NCI (CA009476). JMG e MPW foram apoiadas pelo Instituto Stowers para a investigação médica. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Glioblastomas (GB) e meduloblastomas (MB) são altamente debilitantes doenças que são muito difíceis de tratar. Apesar de regimes terapêuticos melhorados, os pacientes com diagnóstico de GB, o tumor adulto cerebral primário mais comum, têm uma sobrevida média de 10-14 meses [1]. Tratamento de pacientes com MB, o câncer cerebral pediátrico mais comum, representa um problema adicional. As terapias atuais para MB causar uma diminuição dramática da função cognitiva e predispor os doentes para futuras neoplasias associadas ao tratamento [2]. Deste modo, existe uma necessidade premente para identificar novas proteínas e vias de sinalização que podem servir como novos alvos para a melhoria do tratamento de GB e MB. Relevantes para o trabalho descrito neste estudo, os níveis elevados da SOX2 factor de transcrição, que desempenha um papel crítico no desenvolvimento do sistema nervoso, têm sido mostrados para correlacionar com prognóstico clínico para pacientes com tumor cerebral [3]. O papel crítico da SOX2 em tumores cerebrais é suportado pela descoberta de que knockdown de SOX2 por RNA de interferência reduz o

in vitro

e

in vivo

crescimento de células GB [4]. Além disso, SOX2 é expressa em células MB [3] e, mais recentemente, nós determinamos que o knockdown de SOX2 em células DAOY MB reduz a sua proliferação (Cox e Rizzino, resultados não publicados).

Durante os últimos 10 anos , um esforço considerável tem se dedicado a compreender os mecanismos pelos quais fatores de transcrição essenciais medeiam os seus efeitos. Mais recentemente, avanços significativos têm sido feitas para paisagens mapeamento de interacção proteína-proteína de factores de transcrição essenciais num número de sistemas celulares. Por exemplo, o progresso tem sido feito grande para determinar o proteoma de factores de transcrição, em particular Sox2, Oct4 e Nanog, necessário para manter o auto-renovação e pluripotência das células estaminais embrionárias (ESC) [5] – [11]. A integração de interactoma para Sox2, Oct4 e Nanog, argumenta que esses fatores de transcrição de pluripotência associada fazem parte de uma paisagem interação proteína-proteína altamente integrado, que inclui muitos outros fatores de transcrição, cromatina máquinas remodelação, máquinas de reparo do DNA e proteínas de ligação RNA [9 ], [11] – [13]. Além disso, as telas proteomic imparciais para identificar proteínas que se associam com Sox2 no rato CES têm provado ser uma abordagem poderosa para a identificação de sub-estudado proteínas, tais como Banf1 e Musashi2 (MSI2), que influenciam de forma significativa o destino de ESC [11] – [ ,,,0],15]. Dado que os associados SOX2 com um conjunto diversificado de proteínas essenciais, é provável que a análise proteômica do SOX2-interactome nas células tumorais do cérebro poderia ajudar a identificar proteínas adicionais que influenciam o crescimento destes tumores.

Para melhorar a nossa compreensão de tumores cerebrais, o trabalho relatado neste estudo foi estabelecido para abordar duas questões. Qual é a composição do SOX2-interactoma na linha celular de tumor DAOY MB? a tela proteômica das proteínas associadas ao SOX2 ajuda pode identificar proteínas adicionais que são exigidos por células tumorais do cérebro? Nós relatamos que associa SOX2 com 280 proteínas em células DAOY. Além disso, demonstra-se que duas proteínas associadas a SOX2, MSI2 e Ubiquitina específico Peptidase 9x (USP9X), que tenham sido recentemente implicada no crescimento de outros tipos de cancro [16] – [21], são necessários para suportar o crescimento e sobrevivência de células DAOY e duas linhas de células tumorais GB, U87 e U118.

Procedimentos experimentais

Cultura de células

DAOY (HTB-186, ATCC, Manassas, VA), i- SOX2-DAOY, U87 (HTB-14, ATCC), U118 células (HTB-15, ATCC) e HEK293T (CRL-11268, ATCC) foram cultivadas, como descrito anteriormente [22]. partículas lentivirais foram produzidos, e as células foram infectadas, tal como descrito anteriormente [15]. O crescimento celular foi analisada utilizando o ensaio MTT, como descrito anteriormente [15], utilizando células replated 3-4 dias após a infecção lentivírus.

plasmídeo Produção

foi obtida FUW-tetO-SOX2 (20724) Addgene de (Cambridge, MA). vector pLVX-Tet-On® avançada foi obtido de Clontech (632.162, Mountain View, CA). Vectores para produzir lentivírus shRNA para MSI2 (RMM4534-NM_011443) e USP9X (RHS4533-NM_001039590) knockdowns foram obtidos a partir Abrir Biosystems (Huntsville, AL). Um previamente validado shRNA não específica (scrambled) foi utilizado como um controlo negativo em experiências de knockdown [23]. shRNA sequências são fornecidos na Tabela S4 suplementar.

Para manipular pLVX-tetO- (FS) SOX2, Strep e etiquetas Flag foram sequencialmente adicionados ao terminal N de SOX2 por duas rondas de PCR. A primeira PCR rodada usado FUW-tetO-SOX2 como um modelo, o iniciador a montante: CAAGAAGCTTGCC

AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG

GGCGGAATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAG (sublinhada: HindIII, em itálico: Strep-epitopo, negrito: CDS SOX2, negrito sublinhadas: mutação silenciosa para destruir um local BsrGI endógeno) e o iniciador a jusante: AGGACTCGAGCGCGGGACCACACCATGAAGG (sublinhado: Xhol). Este fragmento foi digerido com HindIII e XhoI e foi ligado nos locais de Bluescript KS + (Sratagene, Santa Clara, CA) correspondente. A segunda rodada de PCR, utilizando o plasmídeo intermediário como modelo, foi executado com o seguinte iniciador a montante: AAGGTCTAGATGTAC

ATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG

GGGTCGGCCGCC

AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG

(sublinhada: XbaI, cinza: BsrGI, negrito e itálico: epitopo-FLAG, em itálico: Strep-epitopo) e o iniciador a jusante que contém o local Xhol descrito acima. Este produto de PCR foi então digerido com XbaI e XhoI e foi ligado nos locais de Bluescript correspondente. O Flag-Strep com etiquetas extremidade 5 ‘de SOX2 foi isolado a partir deste vector intermediário e transferido para o vector FUW-tetO-SOX2 usando BsrGI e um sítio interno RsrII, para criar FUW-tetO- SOX2 (FS). (FS) SOX2 foi isolado a partir FUW-tetO- (FS) SOX2 usando EcoRI e ligado em pLVX-Tight-Puro (632162, Clontech), para criar pLVX-tetO- (FS) SOX2. Orientação foi verificada por sequenciação.

i-SOX2-DAOY Engenharia celular

células DAOY foram semeadas a densidade clonal e infectados com pLVX-Tet-On® lentivírus avançada para produzir rtTA-DAOY. As células foram realimentadas meio fresco 2-3 vezes por semana. Oito dias após a sementeira com uma densidade clonal, colónias individuais foram isoladas, e dois dias mais tarde, colónias isoladas foram expostas a G418 (300 ug /mL). Os clones rtTA-DAOY foram expandidas para ~ 2 semanas sob selecção de G418. células rtTA-DAOY foram semeadas a uma densidade clonal e infectadas com pLVX-tetO- (FS) SOX2. As células foram realimentadas meio fresco 2-3 vezes por semana. Oito dias após a sementeira, as células foram expostas a puromicina (5 ug /ml) durante 72 horas, após as quais 6 clones foram isolados. Cada clone foi cultivado em meio suplementado com doxiciclina (0,1 ug /ml) durante 24 horas e as proteínas nucleares foram isolados. expressão indutível de (FS) SOX2 foi verificada por análise de Western blot (dados não mostrados). Um único clone, designado por I-SOX2-DAOY, foi utilizado para a análise proteómica.

isolamento de proteínas e imunoprecipi tacão

homogeneização de Dounce foi usada para isolar proteínas nucleares para análise mudpit como descrito anteriormente [ ,,,0],24]. Para a imunoprecipitação, os extractos nucleares foram carregados em M2-grânulos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e lavou-se, e complexos de proteínas foram eluídos usando 3X péptido-Flag (Sigma-Aldrich), como descrito anteriormente [9]. suspenso diferencial entre as amostras induzidas (+ Dox) e não induzidas (-Dox) foi verificada por coloração de prata [9].

mudpit Identificação dos associados-SOX2 Proteínas

Protein Multidimensional Tecnologia de Identificação (mudpit ) análise foi realizada como descrito anteriormente [9]. Os conjuntos de dados MS /MS foram examinadas usando SEQUEST e

Homo sapiens

banco de dados de proteínas (NCBI, 2010-11-22 release). Factores distribuídos Abundância Normalized Spectral (dNSAF) foram calculados para cada proteína detectada, como descrito noutro local [25]. Três experiências independentes e análises estatísticas foram realizadas como descrito anteriormente [9]. A taxa de detecção falsa espectral foi determinada como descrito anteriormente [9], [26].

Análise Western Blot

análise de Western blot foi realizada tal como descrito anteriormente [9]. extractos de proteína nuclear e citoplasmática foram preparadas utilizando estojos de NE-PER (Thermo-Scientific, Rockford, IL) foi utilizada de acordo com o protocolo do fabricante para isolar proteínas por análise de Western blot, conforme descrito anteriormente [9]. Níveis relativos de proteínas detectadas foram determinados como descrito anteriormente [11]. Os anticorpos primários utilizados foram: a-MSI2 (ab83236, Abcam, Cambridge, MA), α-USP9X (ab56461, Abcam), α-USP7 (A300-033A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), α-Flag (F3165, Sigma -Aldrich), α-GAPDH (G8795, Sigma-Aldrich), α-INSENSIBILIZADO (ab4147, Abcam), α-SOX2 (abl5830, Abcam), α-MCL1 (sc-819, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , α-β-catenina (9562, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).

Análise de ARN

isolamento de ARN e síntese de ADNc efectuada tal como descrito anteriormente [9]. A expressão de genes de MSI2 e USP9X em DAOY, U87, U118 ou células tratadas com segmentação ou mexidos shRNA foram analisados ​​por SYBR Green (SuperArrayBioscience Corporation, Federick, MD) Tempo Real-quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (RT-qPCR) [9]. Os iniciadores utilizados para o passo de PCR na análise de ARN foram MSI2 H-MSI2-F (AAGTATTAGGTCAGCCCCAC) e H-MSI2-R (TTCTCAAAAGTGACAAAGCC). Os iniciadores utilizados para o passo de PCR na análise de ARN foram USP9X H-USP9X-F (CAGATGACCAAGATGCTCC) e H-USP9X-R (GGGGATACTTCTTCACTGCC). Primers para expressão de controle GAPDH foram descritos anteriormente [15].

Resultados

Engenharia de i-SOX2-DAOY Células e Análise mudpit de associado-SOX2 Proteínas

Para ajudar identificar novas proteínas essenciais para o crescimento de células de MB, examinámos o SOX2-interactoma em células DAOY MB. É importante ressaltar que fatores de transcrição, como SOX2, não funcionam isoladamente, mas funcionam como parte de grandes complexos de proteínas. A este respeito, estudos anteriores conduzidos com ESC sofrer diferenciação têm mostrado que Sox2 está presente em vários complexos de proteína de peso molecular grandes, algum superior a 880 kDa [27]. Para examinar a SOX2-interactoma, células DAOY foram manipuladas para a expressão induzível de SOX2 marcada com epitopo (I-SOX2-DAOY), porque os anticorpos dirigidos contra SOX2 não são adequados para o isolamento altamente específica e sensível de complexos SOX2-proteína. Isso nos permitiu isolar consistentemente SOX2 e suas proteínas associadas usando M2-esferas. Para o engenheiro i-SOX2-DAOY, as células DAOY foram sequencialmente infectado com um lentivírus para introduzir um constitutivamente expresso transativador inverter-tet e um segundo vector lentiviral que expressa uma Bandeira-Strep dupla marcada com epitopo forma de [SOX2 (fs)] SOX2 sob a controlo de um promotor indutível-Dox (Fig. 1A).

(a) diagrama esquemático do sistema lentiviral utilizada para introduzir um Dox-induzível, SOX2 marcado com epítopo em células DAOY MB. Dois vetores de lentivírus foram usadas para introduzir constitutivamente expresso transativador reverso-tet (rtTA) e (fs) SOX2 inducible [rotulada: Bandeira-SOX2]. (B) O protocolo usado para isolar complexos SOX2 em proteínas de células DAOY MB para análise mudpit jusante. (C) análise de transferência de Western de sondagem para SOX2 com um anticorpo Sox2. O nível de (FS) SOX2 foi comparado com o nível de SOX2 endógena, o qual foi definido como 1. (D) mancha de prata demonstrando o enriquecimento de proteínas após a indução de (FS) com SOX2 Dox e imunoprecipitação com M2-grânulos. A banda proeminente observada a -45 kDa é um contaminante comum quando M2-grânulos são utilizados para imunoprecipi tacão. * A posição estimada (FS) SOX2 é indicado por uma ponta de seta. (E) a análise Western blot sondagem para Flag-SOX2 para verificar a imunoprecipitação utilizando M2-esferas.

Para isolar (fs) SOX2 e seus complexos de proteínas associadas a partir de células i-SOX2-DAOY, (fs) SOX2 expressão foi induzida por 24 horas (0,1 ug /mL) Dox, e complexos de proteína SOX2 (FS) foram isolados a partir de extractos proteicos nucleares por imunoprecipitação utilizando M2-grânulos (Fig. 1B). Como um controlo, extractos nucleares foram preparados a partir de células I-SOX2-DAOY sem exposição a Dox (amostras não induzidas). Após indução com Dox, o nível de (FS) SOX2, que migra ligeiramente mais devagar do que SOX2, verificou-se ser -2,5 vezes mais elevada do que a de SOX2 endógeno (Fig. 1C). No entanto, se a expressão de SOX2 exógena reduz a expressão de SOX2 endógena tal como acontece no CES [11], os níveis totais de SOX2 nas células tratadas com Dox foi menos do que 2,5 vezes mais elevada do que nas células não tratadas DAOY. Importante, análise de mancha de prata de eluatos imunoprecipitadas demonstrado um enriquecimento significativo de proteínas isoladas quando (FS) SOX2 foi induzido (Fig. 1D). Como esperado, (FS) SOX2 podia ser prontamente detectada por análise de Western blot no induzida, mas não nos eluatos não induzidas (Fig. 1E). A banda proeminente observada a -45 kDa (Fig. 1D) é um contaminante comum quando M2-esferas são utilizados para imunoprecipitação [9], [11].

Para identificar proteínas que se associam com SOX2 no i-SOX2 células -DAOY, SOX2 complexos proteicos a partir de células I-SOX2-DAOY não induzidas e induzidas foram sujeitos a análise mudpit. Para ajudar a minimizar a variação experimental e para a análise estatística, análise mudpit foi realizada em três pares de amostras independentes. A taxa de detecção falsa espectral dos nossos telas proteomic foram de 0,27% ± 0,16% e 0,37 ± 0,08 para as amostras não induzidas e induzidas, respectivamente, conforme determinado pelo método de Elias e colegas [26]. As proteínas identificadas como proteínas associadas ao SOX2 foram agrupados em três categorias principais, em um esforço para minimizar a exclusão das proteínas associadas ao SOX2 de boa-fé: 1) proteínas identificadas apenas em nossas amostras induzidas em três mudpit analisa com o mais rigoroso significado BY-ajustado p 0,05 (Fig. 2A, Tabela suplementar S1); 2) proteínas identificadas apenas em amostras induzidas em três mudpit análises sem significância BY-ajustada (p 0,05), mas com significância do teste t (p 0,05) (Figura 2B, Quadro suplementar S2).; e 3) as proteínas que foram enriquecidos na amostra induziu mais do que 6 vezes (Fig. 2C, Tabela suplementar S3). Categoria 1 e 2 totalizaram 156 e 39 proteínas, respectivamente. Todas as proteínas na categoria 1 foi cumprida a exigência estatística utilizada para a categoria 2. Juntos, com a categoria 3, que incluiu 88 proteínas, um total de 283 proteínas associadas ao SOX2 foram identificados quando todas as três categorias foram combinadas.

(A ) as proteínas que foram identificados em todas as três eluatos M2-grânulo induzidas, mas não identificados em amostras não induzidas, como proteínas associadas a SOX2 por análise mudpit, que foram estatisticamente significativas de acordo com o método pOR-ajustado (p 0,05). NSAF valores das três réplicas são calculados e as barras de erro representam o desvio padrão. O enredo é dividido em dois; dos valores médios NSAF “da meia ascender esquerda para a direita, e dos valores médios NSAF ‘da metade direita ascender direita para a esquerda. (B) As proteínas identificadas em 3 de 3, Dox-induzida, mas não em não induzidas, repetições DAOY mudpit que foram estatisticamente significativas de acordo com o teste t de Student (p 0,05), mas não foram significativos de acordo com o DE-ajuste ( p 0,05). (C) As proteínas que foram identificados em todas as três induzida, mas, pelo menos, uma amostra mudpit não induzida, são representados de acordo com a dobra de enriquecimento (valores NSAF) em amostras induzidas por Dox em comparação com não induzido. Apenas proteínas com valores de enriquecimento 6 vezes foram incluídos. Proteínas representadas com uma faixa preta apresentaram valores de enriquecimento que foram estatisticamente significativas de acordo com o BY-ajuste (p 0,05). Proteínas representadas com barras cinzentas foram estatisticamente significativas de acordo com o teste t de Student (p 0,05), mas não significativa de acordo com a BY-ajuste (p 0,05).

Para entender melhor o biológico funções das proteínas associadas ao SOX2, realizamos gene classificação ontologia com banco de dados para visualização de anotação e Discovery Integrado (DAVID). Dada a localização ea função de SOX2 nuclear, não é de estranhar que a transcrição é uma das maiores categorias funcionais (Fig. 3). No entanto, as proteínas associadas a SOX2 têm sido associados a muitos outros processos celulares. Isto é semelhante ao da constatação de que as proteínas Sox2-associados em ESC mouse e em rato ESC submetidos a diferenciação estão envolvidos em um diversificado leque de funções [9], [11]. Nestes contextos celulares, uma percentagem semelhante de proteínas associadas a SOX2 participou nas categorias de processamento de RNA (6% a 9%) e o desenvolvimento (10% a 11%). No entanto, houve várias diferenças notáveis. A percentagem de proteínas associadas ao SOX2 que se enquadram na categoria de reparo do DNA representava 11% em ESC sofrer diferenciação [9], mas apenas 1% em células DAOY. A classificação para cada proteína associada ao SOX2 é fornecida na Tabela S5 suplementar.

análise Gene ontologia de proteínas associadas ao SOX2 identificados em células DAOY MB foi realizada utilizando o banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID). ontologia descrições específicas para proteínas associadas a SOX2 foram agrupados em 14 grandes categorias.

mudpit é um método altamente sensível que é capaz de detectar proteínas em amostras que não são prontamente detectadas por análise Western Blot. Por esta razão, foi utilizada uma abordagem bioquímica mais tradicional e proteínas selecionadas com valores NSAF modestos para validar a nossa identificação de proteínas associadas ao SOX2. Especificamente, MSI2, uma proteína que se encontra apenas nas nossas amostras induzidas (Fig. 2A), e USP7, enriquecido ~ 20 vezes (Fig. 2C), foram confirmados para associar com SOX2 através de co-imunoprecipitação utilizando extractos nucleares preparados a partir de células DAOY ( Fig suplementar. S1A). Também determinou que SOX2 é capaz de se associar com MSI2 e USP7 em outros contextos celulares. A este respeito, MSI2 USP7 e foram identificadas como proteínas associadas a SOX2 em uma única tela proteoma em proteínas associadas a SOX2 em células U87 (GB Wilder e Rizzino, resultados não publicados). Além disso, determinou-se que ectopicamente expressas associados Bandeira-SOX2 com USP7 endógena encontrado em células HEK293T (suplementar Fig. S1B). Nós também confirmou que ectopicamente expressas Bandeira-MSI2 co-imunoprecipitados ectopicamente expressa SOX2 em células HEK293T (suplementar Fig. S1C).

Integração de SOX2-proteína interactoma revela uma série de associar proteínas comuns

Além da tela a proteómica SOX2 realizado em células DAOY, temos conduzido recentemente análise mudpit para identificar proteínas associadas a SOX2 em vários outros contextos celulares, incluindo CES indiferenciada [11] e ESC sofrer diferenciação [9]. Mais importante, os três SOX2-interactoma identificados foram determinados utilizando os mesmos métodos para isolamento de proteínas e a análise proteomic, e uma taxa de detecção semelhante espectral falsa ( 0,4%) foi determinado em cada contexto independente [9], [11]. Em cada caso, a bandeira-marcado com epítopo SOX2 e suas proteínas associadas foram isolados utilizando M2-grânulos a partir de extractos nucleares preparados por homogeneização de Dounce, seguindo-se a análise utilizando o mesmo mudpit plataforma proteómica. Portanto, em comparação SOX2-interactoma identificadas em cada um desses contextos celulares (suplementar Fig. 2, suplementar S6 Tabela), porque as proteínas que se associam com SOX2 em vários contextos celulares também são susceptíveis de desempenhar papéis essenciais no comportamento de células de tumor cerebral. A este respeito, as células MB humanos e do rato ESC teve várias proteínas associadas ao SOX2 em comum, apesar das diferenças dramáticas no contexto celular. De 283 proteínas identificadas no SOX2-interactoma em células DAOY MB, 19 associado com SOX2 em, pelo menos, um outro contexto celular, incluindo MSI2 e USP9X, e duas associado com SOX2 em todos os três contextos celulares (suplementar Fig. S4, Tabela suplementar S6 ). Recentemente, mostrámos que Msi2 é necessária para a auto-renovação e pluripotência de rato CES [14] e, mais recentemente, foi determinado que o knockdown de Usp9x no rato CES aumenta substancialmente a diferenciação de ESC (resultados não publicados). Além disso, MSI2 USP9X e têm sido implicados em outros cancros [16] – [21], mas o seu papel em tumores cerebrais não foram examinados. Portanto, nós expandimos a nossa análise de proteínas associadas ao SOX2 determinando se a diminuição de expressão MSI2 e USP9X influencia o comportamento das células tumorais do cérebro.

Musashi-2 é necessário para a proliferação de células do cancro cerebral

relatórios anteriores demonstraram que MSI2 é essencial para a progressão da LMC [16] – [18], e o knockdown de outro membro da família, Musashi-1 (MSI1), interrompe a viabilidade das células DAOY MB e células GB [28], [29]. Para determinar se MSI2 é necessário para a proliferação de células DAOY MB, construções shRNA foram usadas para derrubar MSI2 endógena. Especificamente, os lentivírus que expressam constitutivamente shRNA contra MSI2 foram utilizados para infectar células DAOY MB. Duas construções independentes shRNA foram usadas para knockdown MSI2, e um previamente caracterizado shRNA não específica (scrambled) foi utilizado como um controlo [15], [23]. A seguir à selecção das células infectadas com puromicina, análise Western Blot demonstraram que isoformas MSI2 1 e 2 foram substancialmente derrubado (Fig. 4A). Esta redução na MSI2 foi verificada nos níveis de ARN por RT-qPCR (Supplemental Fig. S3A). Além disso, quando comparado com o crescimento de células infectadas DAOY com os vectores lentivirais shRNA mexidos, observou-se uma grande redução no crescimento quando as células foram infectadas com vectores lentivirais MSI2 shRNA (Fig. 4B). Além disso, microfotografias tiradas 7 dias após a infecção demonstraram que as células em que MSI2 tinham sido derrubadas eram planas e maior, uma reminiscência de células pós-mitóticas, quando comparados com o controle Scrambled (Fig. 4C).

(A ) análise de Western blot dos níveis MSI2 em toda célula DAOY extrai 96 horas após a infecção com lentivírus MSI2 shRNA mexidos ou. Duas isoformas foram detectadas: isoforma 1 (MSI2-1) e isoforma 2 (MSI2-2). GAPDH foi sondada como um controlo de carga. níveis MSI2 são quantificados, com os níveis encontrados no controle Scrambled definido para 1,00. (B) O crescimento das células foi examinada em triplicado pelo teste de MTT 6 dias depois de terem sido plaqueadas a 10

4 culas por po de uma placa de 12 poços. Os dados mostrados são médias em relação ao controlo da precipitação. As barras de erro representam o desvio padrão. Os valores de P foram determinados pelo teste t de Student e encontrado para ser 0,01 para ambos MSI2 shRNA 1 e 2. (C) Fotomicrografias de células DAOY MB após a infecção com não-específica ou (mexidos) ou MSI2 alvo (No. 1 , N ° 2) lentivírus shRNA. As células foram infectadas no Dia 0, seleccionadas utilizando o meio suplementado com puromicina no dia 1 e novamente alimentadas meio fresco no dia 2. As células foram fotografadas no dia 7 após a infecção. (D) Análise de Western blot de NUMB em extratos DAOY MB usado na Figura 4A.

Atualmente, relativamente pouco se sabe sobre os papéis dos MSI2, mas no modelo de rato de leucemia acredita-se para down- regular a proteína Entorpecida [16], que tem sido demonstrado que regulam ambos entalhe e a sinalização de Wnt [30], [31]. Portanto, nós examinamos se knockdown de MSI2 em células DAOY influencia a expressão de dormentes. Nós determinamos que knockdown de MSI2 shRNA com vectores lentivirais # 1 e # 2 causou um aumento nos níveis de proteína de INSENSIBILIZADO (Fig. 4D). Assim, knockdown de MSI2 provoca tanto uma grande redução no crescimento de células tumorais DAOY MB e aumenta a expressão de dormentes.

Também examinamos as consequências de derrubar MSI2 nas células tumorais GB, porque MSI2 foi também identificada como uma proteína associada a SOX2 em células de U87 (GB Wilder e Rizzino, resultados não publicados). Para este efeito, que inicialmente infectado U87 células tumorais GB com os mesmos vectores lentivirais MSI2 shRNA descritos anteriormente. Mais uma vez, um shRNA mexidos foi utilizada como um controlo. Três dias após a infecção com os vetores de lentivírus, western blot determinou que MSI2 isoforma 1 e isoforma 2 foram ambos substancialmente reduzida (Fig. 5A) e da redução da MSI2 foi verificada nos níveis de ARN por RT-qPCR (suplementar Fig. S3B) . Tal como no caso das células de DAOY, U87 GB células infectadas com construções MSI2 shRNA exibiram uma acentuada diminuição na proliferação celular (Fig. 5B) e um aumento significativo no tamanho das células (Fig. 5C). Para estender estes resultados, as células U118 GB foram infectadas com lentivírus MSI2 shRNA. Semelhante a células DAOY e U87, knockdown de MSI2 em células U118 resultou numa diminuição da proteína MSI2 e ARN, uma grande redução no crescimento celular, e um aumento significativo no tamanho das células (Fig suplementar. S4 e a Fig. S3C). Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que MSI2 é necessária para sustentar a sobrevivência de células DAOY MB, e a capacidade proliferativa de células U118 e U87 GB.

(A) análise de transferência de Western dos níveis de MSI2 em U87 nuclear 96 extrai horas após a infecção com lentivírus mexidos ou MSI2 shRNA. níveis MSI2 são quantificados, com os níveis encontrados no controle Scrambled definido para 1,00. (B) O crescimento das células foi examinada em triplicado pelo teste de MTT 5 dias depois de terem sido plaqueadas a 1,5 x 10

4 culas por po de uma placa de 12 poços. Os dados mostrados são médias em relação ao controlo da precipitação. As barras de erro representam o desvio padrão. Os valores de P foram determinados pelo teste t de Student e encontrado para ser 0,01 para ambos MSI2 shRNA 1 e 2. (C) Fotomicrografias de células U87 GB após a infecção com não-específica ou (mexidos) ou MSI2 alvo (No. 1 , N ° 2) lentivírus shRNA. As células foram infectadas no Dia 0, seleccionadas utilizando o meio suplementado com puromicina no Dia 1 e realimentadas meio fresco no dia 3. As células foram fotografadas no dia 6 após a infecção.

Knockdown de USP9X reduz a viabilidade do cérebro as células cancerosas

Nós também examinou se USP9X é necessário para a sobrevivência de células cancerosas no cérebro. Para este fim, utilizou-se shRNA mediada knockdown de USP9X. Mais especificamente, três lentivírus independentes foram utilizados para entregar constitutivamente activa shRNA constrói contra transcritos em células USP9X DAOY MB. Tal como acontece com os nossos estudos MSI2-knockdown, mexidos shRNA foi utilizada como um controlo. Knockdown de USP9X foi confirmada por análise de transferência de western de ambos os extractos nucleares e citoplasmáticos (Fig. 6A) e verificou, os níveis de ARN por RT-qPCR (suplementar Fig. S5A). Embora houvesse efeitos mínimos de derrubar USP9X durante os três primeiros dias de cultura, observou-se uma grande redução no número de células que poderia recolocar (dados não mostrados). Além disso, as poucas células da população knockdown USP9X que recolocado após subcultura exibiram pouca ou nenhuma proliferação (Fig. 6, B e C). Além disso, examinamos se o knockdown de USP9X afeta a expressão de vários de seus alvos conhecidos em células DAOY. USP9X tem sido relatada a deubiquitinate um grande número de proteínas, incluindo MCL1 e β-catenina [19], [32] – [35]. No entanto, knockdown de USP9X não parece alterar a expressão de MCL1 ou β-catenina nos compartimentos nucleares ou citoplasmáticas (Fig. 6D).

(A) análise de transferência de Western para verificar o knockdown de USP9X em DAOY células MB após a infecção com lentivírus para introduzir shRNA constitutivamente ativa contra transcrições USP9X. fracções de proteína nuclear e citoplasmática foram preparadas 4 dias após a infecção de células com lentivírus. níveis USP9X são quantificados, e níveis no controlo mexidos são definidas para 1,00. (B) O crescimento das células foi examinada em triplicado pelo teste de MTT 6 dias depois de terem sido plaqueadas a 10

4 culas por po de uma placa de 12 poços. Os dados mostrados são médias em relação ao controlo da precipitação. As barras de erro representam o desvio padrão. Os valores de P foram determinados pelo teste t de Student e encontrado para ser 0,01 para ambos USP9X shRNA 1, 2 e 3. (C) Fotomicrografias de células DAOY MB seguinte knockdown de USP9X usando lentiviral entregues shRNA constrói contra transcrições USP9X. No dia 0, as células foram infectadas com lentivírus USP9X shRNA. Começando no dia 1, as células infectadas foram seleccionadas utilizando puromicina durante 48 horas.