Abstract

O nosso estudo anterior indicou que a proteína DEK foi sobre-expresso em carcinoma colorretal (CRC), em comparação com a mucosa colorretal normal. DEK também foi significativamente correlacionada com as características de prognóstico de pacientes com CRC, demonstrando que DEK desempenhou um papel importante na progressão do CRC. Neste trabalho, nós avaliamos os efeitos da DEK sobre comportamentos biológicos no CRC e explorar os mecanismos moleculares relacionados. Os resultados mostraram que DEK foi sobre-expresso em tecidos humanos de CRC, e estava correlacionada com o índice de Ki-67 e o índice apoptótico. DEK depleção por RNAi em células SW-620 e HCT-116 diminuiu de forma significativa a proliferação celular, mas um aumento da apoptose celular. A sobre-regulação de DEK foi envolvida nas vias de p53 /MDM, da família Bcl-2, e caspase. Nosso estudo demonstra que DEK promove o crescimento de CRC, e poderia ser um alvo terapêutico no CRC

Citation:. Lin L, Piao J, Ma Y, Jin T, Quan C, Kong J, et al. (2014) mecanismos subjacentes do crescimento e apoptose Cancer por DEK superexpressão em câncer colorretal. PLoS ONE 9 (10): e111260. doi: 10.1371 /journal.pone.0111260

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de junho de 2014; Aceito: 24 de setembro de 2014; Publicação: 23 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Fundo Especial de 973 Prophase Investigação do Ministério Nacional de Ciência Tecnologia da China (2014CB560708), os subsídios dos Fundos Nacionais de Ciência Natural da China (61.371.067), e do Fundo Básico de Investigação Científica da Universidade de Jilin, na China (2013-01). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma colorretal (CCR) é a terceira neoplasia maligna mais comum ea segunda causa mais comum de morte por câncer em todo o mundo [1]. A qualidade de vida ea taxa de sobrevida de 5 anos são baixos em CRCs avançados, mesmo com a excisão cirúrgica acompanhada de quimioterapia e radioterapia. A detecção precoce do CRC é crucial para um tratamento bem sucedido porque a doença avançada de elevado grau está correlacionada com o aumento da mortalidade e metástase [2] – [4]. Portanto, a identificação de novos mediadores e biomarcadores de CRC, particularmente aquelas associadas com metástases e de crescimento, continua a ser crítica para a mortalidade de combate de doença recorrente. O progresso na patogênese do câncer pode ajudar a desvendar os biomarcadores moleculares vitais /válidos envolvidas na carcinogénese colorectal e auxiliar no desenvolvimento e descoberta de novas intervenções terapêuticas e estratégias e agentes preventivos. Os nossos dados anteriores mostraram que a expressão da proteína DEK é regulada positivamente em tecidos de CRC [5]. A sobre-expressão é particularmente marcada em CRCs de alta qualidade e em estágio final, tornando DEK um potencial novo biomarcador para prognóstico da CRC e um alvo na luta contra a recorrência [5].

DEK foi originalmente descoberto como o alvo de um evento de translocação cromossómica t (6; 9), em um subconjunto das leucemias mielóides agudas [6] – [7]. Agora, DEK está a emergir como um membro de uma nova classe de moduladores a topologia do ADN que podem ser alvos efectores e de acontecimentos pró-tumorigénicas [8]. DEK localiza no cromossoma [9] 6p22.3, e é uma nucleoproteína altamente conservada que podem ser fosforilados. Composto por 375 aminoácidos, DEK é distribuído principalmente no euchromatin núcleo, e preferencialmente expressa na proliferação activa e malignas células, onde pode atingir até 4 a 6 milhões de cópias por núcleo [8]. Estudos subsequentes têm repetidamente identificada como DEK frequentemente um gene sobre-expresso num certo número de tumores [10] – [12]. Além disso, DEK podem exercer efeitos sobre o splicing do mRNA, controlo transcricional, reparação de danos do ADN, a diferenciação, a viabilidade celular e célula-a-célula sinalização [11], [13] – [15]. No entanto, não foram avaliadas as funções de DEK

in vitro

no comportamento celular CRC. Anteriormente, mostramos que a proteína DEK foi overexpressed em 109 casos de tecidos CRC, foi significativamente correlacionada com as características prognóstico dos pacientes, e foi um fator de risco independente para a sobrevida global [5]. Este estudo observa a expressão da DEK em um novo grupo de CRCs primários recolhidos, e correlaciona expressão DEK com as Ki-67 e apoptóticos índices, que refletem as contribuições de proliferação celular e perda de células, respectivamente. Além disso, nós esclarecer o papel de DEK na progressão da CRC com interferência de ARN DEK (RNAi) numa linha celular derivada de um CRC.

DEK é um inibidor de p53-dependente e independente de senescência celular e apoptose fenótipos [ ,,,0],7], [14], [16], e transcricionalmente regulados positivamente pela /E2F pathway Rb, que é frequentemente perturbado pela CRC [17] – [19]. Portanto, a sua expressão é fortemente indicativo da proliferação e apoptose. Aqui nós definimos atividades oncogênicos específicos de DEK em CRCs

in vitro

, e identificar um mecanismo molecular através do qual DEK contribui para o crescimento do tumor.

Métodos

Ética Declaração

Todos os participantes assinaram termo de consentimento para o estudo que cumpriram com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelos comitês de ética humana e ética em pesquisa da Universidade Yanbian Medical College, em China. Através do formulário de consentimento da cirurgia, todos os participantes foram informados de que os espécimes ressecados foram armazenados pelo hospital e potencialmente utilizado para a investigação científica, e que sua privacidade será mantida.

Os espécimes de tecido

Fresh amostras de quatro casos de CRC foram pareados com os tecidos não cancerosos adjacentes, e foram incluídos com as rotineiramente processadas e diagnosticados 55 casos de tecidos com cancro colorectal que foram selecionados aleatoriamente de pacientes submetidos a cirurgia entre 2009 e 2012, o Tumor Tissue Bank of Yanbian University Medical College . Os parâmetros patológicos foram cuidadosamente revistos em todos os casos. Um total de 22 dos tecidos adjacentes normais de cólon mucosa da margem de ressecção do cancro e 18 dos tecidos adenoma colorrectal também foram incluídos. Nenhum dos pacientes tinham recebido quimioterapia antes da cirurgia ou metástases à distância. Os H . Diapositivos E-coradas foram analisados ​​por dois patologistas experientes (Lin Z, Jin T) e um bloco de parafina apropriado foi selecionado para este estudo

Análise imuno-histoquímica (IHQ) para DEK e Ki-67

O método de coloração IHQ e critérios de interpretação foram como descrito anteriormente [5]. Resumidamente, para eliminar a actividade da peroxidase endógena, 4 secções de tecido um de espessura foram desparafinizadas, reidratadas e incubadas com 3% H

2O

2 em metanol durante 15 minutos à temperatura ambiente (TA). A recuperação de antígenos foi realizada a 95 ° C durante 20 min, colocando as lâminas em tampão de citrato de sódio 0,01 M (pH 6,0). As lâminas foram então incubadas com o anticorpo DEK (1:50, BD Biosciences Pharmingen, CA, EUA) e um monoclonal de ratinho anti-Ki-67 anticorpo (clone: ​​MIB-1; Dako, Glostrup, Denmarkat 4 ° C durante a noite depois. incubação com anticorpo secundário biotinilado, à TA, durante 30 minutos, as lâminas foram incubadas com complexo de estreptavidina-peroxidase à TA durante 30 min. a imunocoloração foi desenvolvido utilizando 3,3′-diaminobenzidina, e hematoxilina de Mayer foi usada para contracoloração. Utilizou-se IgG de ratinho quanto um controlo de isótopo. Além disso, as secções de tecido foram processadas positivos omitindo o anticorpo primário como controlos negativos.

Ambos DEK e Ki-67 é geralmente expressa no núcleo da célula. a coloração IHC para DEK foi semi- quantitativamente teve como ‘-‘ (negativo, nenhuma ou menos do que 5% de células positivas), ‘+’ (células positivas) 5-25%, ‘++’ (células positivas 26-50%) e ‘+++’ ( mais do que as células positivas de 50%). Apenas o padrão de expressão nuclear foi considerada como coloração positiva, e os meios fortemente positivos ‘+++’ células positivas ‘++’ e. O índice Ki-67 (o número de células tumorais Ki-67-positivos dividido pelo número total de células tumorais × 100%) foi determinada por contagem do número de células tumorais em 20 campos de alta potência seleccionados aleatoriamente (× 400). ensaio

apoptose em cortes de tecidos de CRC

O índice apoptótico foi medida utilizando um in situ kit de detecção de apoptose (Takara Bio, Otsu, Japão). Os procedimentos de coloração foram realizados seguindo as instruções do fabricante. Após desparafinização rotina, a secção de tecido foi digerido com proteinase K (20 mg /mL em PBS) durante 15 min à temperatura ambiente e lavadas com PBS. As lâminas foram então incubadas em peróxido de hidrogénio a 3% durante 5 min e lavadas com PBS. TdT enzima e substrato foram pipetados para as secções, que foram então incubadas a 37 ° C durante 90 min. Após a lavagem, anti-FITC conjugado com HRP foi adicionada às lâminas durante 30 min. As lâminas foram lavadas, coradas com diaminobenzine (Nichirei, Tóquio, Japão), e contrastadas com hematoxilina. O índice apoptótico (o número de células tumorais positivas dividido pelo número total de células tumorais × 100%) foi determinada por contagem do número de células tumorais em 20 campos de alta potência seleccionados aleatoriamente (× 400) [20]. As correlações entre a expressão DEK eo índice Ki-67 ou apoptótica foram avaliadas em tecidos humanos CRC acima.

Western blot

Os anticorpos primários para DEK (1:1000, BD, Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, EUA), mutante de p53 (1:2000, Santa Cruz, CA, EUA), de MDM2 (1:2000, Santa Cruz, CA, EUA), Bcl-2 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), Bax (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), PARP (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), caspase-3 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), a caspase-8 (1:2000, Cell Signaling, foram usadas Danvers, MA, EUA), e caspase-9 (1:2000, Cell Signaling, Danvers, MA, EUA).

amostras frescas de tecido de CCR foram moídos a pó em azoto líquido e lisadas com tampão de amostra de SDS-PAGE. As células confluentes foram lisadas em tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,4, cloreto de sódio 150 mM, EDTA 0,5 mM, 0,09 unidades /ml de aprotinina, 1 mg /mL de pepstatina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo a 10 mM, e 1 mg /ml leupeptina) . amostras iguais de proteína (20 ug) foram separadas em 12% de gel de poliacrilamida de SDS e transferidos para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite isento de gordura a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. A membrana foi lavada 3 vezes com TBST, e incubado com IgG de cabra conjugado com HRP anti-ratinho. (Cwbiotech, Pequim, China) e IgG de cabra anti-coelho conjugado com HRP (Cwbiotech, Pequim, China) à temperatura ambiente durante 2 h. Em seguida, a expressão foi detectada utilizando ECL reagente de detecção privilegiada Western Blotting (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante. β-actina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) foi utilizado como controlo de carga. As imagens foram capturadas com o sistema de análise de imagem Professional Champchemi (Sagecreation, Beijing, China), e bandas de proteínas foram quantificados utilizando software LANE 1D (Sagecreation, Beijing, China).

reversa reação em cadeia de polimerase (RT- PCR) e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

para RT-PCR, o ARN total a partir de amostras de CRC e linhas celulares foram extraídos utilizando o reagente Trizol (Takara, Shiga, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado pelo primeiro Script transcriptase reversa (Takara Bio, Dalian, China) e o oligo (dT), seguindo as instruções do fabricante. Todas as reacções de PCR foram realizadas em 20 ul de mistura de reacção, começando com 4 min a 94 ° C para a desnaturação de ADNc, em seguida, a amplificação por PCR foi realizada durante 94 ciclos de 23~36 ° C durante 15 s e 53~58 ° C durante 30 s para emparelhar os iniciadores, e prolongando-se os iniciadores a 72 ° C durante 1 min. Alíquotas da reacção de PCR foram removidos depois de vários números de ciclos e foram resolvidos por electroforese em geles de agarose a 3%. As imagens foram capturadas com o sistema de análise de imagem Professional Champchemi (Sagecreation, Beijing, China), e quantificação foi realizada com software LANE 1D (Sagecreation, Beijing, China).

PCR em tempo real foi realizada por um Bio- Sequence Detection System Rad de acordo com as instruções do fabricante utilizando o SYBR Premix Ex TaqTM II kit específico do ADN de cadeia dupla (Takara, Shiga, Japão). Os conjuntos de iniciadores para genes específicos são apresentados na Tabela 1. As reacções de PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado, e os números de ciclo limiar (Ct) foram determinadas ao nível que apresentaram os melhores parâmetros cinéticos de PCR. No-Molde de controlo foi utilizado como controlo negativo, e curvas de fusão foram obtidos para confirmar a especificidade do produto de PCR. Um método CT comparativo (2

-ΔΔCt) foi utilizado para medir a quantificação relativa do gene DEK.

cultura de células e transfecção

Humanos linhas celulares de cancro colorrectal SW-620 , HT29, SW-480, e HCT116 foram adquiridos no Cell Bank da Academia chinesa de Ciências Médicas (Xangai, China), e conservado pelo Centro de Pesquisa do Câncer da Universidade Yanbian. Estas linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 ou DMEM (Gibco, Gaithersburg, MD, EUA) suplementado com soro de vitelo fetal a 10%, 2 mmol /l de L-glutamina, e 100 U /ml de penicilina /estreptomicina no humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C

DEK siRNA (Sidek) como alvo o gene humano DEK, e ARNic em cadeia dupla com sequências não específicas foram utilizados como controlos negativos (siControl).; todas as sequências foram concebidos e sintetizados por RiboBio (RiboBio, Guangzhou, China) (Tabela S1). O Sidek utilizados neste estudo estão apresentados na Tabela 1.

ensaio MTT

a mil células por cavidade foram incubadas em placas de 96 poços. Vinte e quatro horas mais tarde, e siControl Sidek foram transfectadas com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As sequências Sidek foram adicionados de uma forma dependente da dose a 30 nM, 50 nM e 100 nM. Quarenta e oito horas mais tarde, 5 mg /ml de MTT foram adicionados a cada poço. Após incubação a 37 ° C durante 4 h, os sobrenadantes foram removidos cuidadosamente. Em seguida, 200 ul de sulfóxido de dimetilo foi adicionado a cada poço e os poços foram completamente misturados durante 10 min. O valor de absorbância (OD) a 560 nm de cada poço foi medida usando leitor de microplacas (TECAN-infinita pro M200, Mannedorf, Suíça).

Imunofluorescência coloração

A linha de células CRC, SW- 620, foi cultivado em lamelas a 70% de confluência e, em seguida fixados em paraformaldeído a 4% durante 10 min e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 durante 10 min após 24 h. O bloqueio foi realizado com 3% de albumina de soro bovino a fracção V (Solarbio, Pequim, China) durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com DEK rato anti-humano (1:50, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, EUA) a 4 ° C durante a noite, seguida de incubação com IgG Alexa Fluor 568 anticorpo de cabra anti-ratinho (H + L) (A11004, 1:1000, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, as células foram contrastadas com 49-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Beyotime, Xangai, China) e as lamelas foram montadas com Antifade montagem Médio (Beyotime, Xangai, China). Finalmente, os sinais de imunofluorescência foram visualizadas e gravadas utilizando Leica SP5II microscópio confocal [21].

Colónia ensaio de formação de

mexidos Sidek (SiControl) e SW620 transfectadas Sidek linha celular foram plaqueadas em placas de 10 cm em a densidade de 5 × 10

4 células por prato. Seguindo dias, o meio foi substituído com meio contendo 800-1000 ng /ml de G418 (Gibco, Gaithersburg, MD, EUA). Após cerca de 7 dias, o meio foi substituído. O ensaio foi interrompido quando as colónias eram claramente visíveis, mesmo sem olhar ao microscópio, e foi cerca de 2~3 semanas de incubação a 37 ° C, 5% de CO2. Em seguida, as células foram fixadas com paraformaldeído a 0,5%, coradas com violeta de cristal e em seguida, contados de acordo com o tamanho definido de colónia [22].

Hoechst33342 coloração

As células foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

4 células /mL e foram cultivadas durante 2 a 4 dias, até 80% a 90% de confluência. A densidade celular de 0,5-3,0 x 10

6 células /ml foi alcançado e fixadas durante 10 min à temperatura ambiente com paraformaldeído a 3% (50 uL) antes do tratamento com Hoechst 33342. Hoechst 33342 foi dissolvido em água destilada a 25 mg /mL e adicionou-se meio DMEM (meio de eagle modificado por Dulbecco) com 2% de FBS, para uma concentração final de 16 ug /ml durante 15 min. A taxa de apoptose foi calculado por contagem de 500 células em um microscópio fluorescente.

A citometria de fluxo

SW-620 células foram cultivadas em placas de seis poços, e foram transfectadas com o DEK de direccionamento ou siRNA a precipitação ARNsi durante 48 h com Lipofectamine 2000 Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA. Após o tratamento, as células foram colhidas por tripsina (0,25%) – EDTA e recolhidas por centrifugação a 1000 × g durante 5 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas e ressuspensas em tampão de ligação, antes de ser marcado com Anexina V-FITC e 7AAD durante 20 min. Fluorescência (teor de ADN) foi medida por citometria de fluxo utilizando o software padrão. As células que foram anexina V-FITC (-) e 7AAD (-) células viáveis ​​foram considerados, enquanto que as células que foram anexina V-FITC (+) e 7AAD – células apoptóticas em fase inicial foram consideradas (). As células que foram anexina V-FITC (+) e 7AAD (+) foram consideradas células em apoptose em estágio final.

A análise estatística

Cada experiência foi realizada em triplicado. Todos os dados foram expressos como a média ± DP. A análise estatística foi realizada utilizando o pacote estatístico SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA), e as comparações entre os grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student. As correlações dos níveis de expressão DEK com CRC e fatores histológicos foram analisados ​​utilizando o teste exato de Fisher. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a

P

. 0,05

Resultados

proteína DEK é sobre-expresso em CRCs

Para demonstrar o papel da DEK no CRC , medimos os níveis de proteína DEK em quatro casos de CRC com os não-tumorais tecidos frescos adjacentes combinados. dados de Western blot mostraram expressão robusta DEK proteína em tecidos CRC em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes combinados (fig. 1).

(A) Imagens de Western blot de expressão da proteína DEK em quatro pares de CRC ( T) e tecidos não tumorais adjacentes (NT). (B) rácios relativos T /NT de DEK níveis de expressão de proteína em emparelhado CRC e tecidos não tumorais adjacentes são mostrados (aumento da mudança vezes, **

P Art 0,01).

DEK expressão da proteína nuclear mostrou um padrão de coloração IHC em CRCs (Fig. 2). O número de células que contêm a proteína DEK (taxa positiva) foi significativamente mais elevada em tecidos de CRC (80,0%, 44/55) do que na mucosa normal adjacente (36,4%, 8/22) e em adenomas (16,7%, 3/18) . Da mesma forma, a taxa de proteína fortemente positiva DEK foi de 50,9% (28/55) em CRCs, o que foi significativamente mais elevado do que na mucosa do cólon normal adjacente (18,2%, 4/22) e em adenomas (16,7%, 3/18) (ambos

P Art 0,001). (Tabela 2)

(a) DEK coloração das proteínas foi negativo em tecidos de cólon normais adjacentes. proteínas (B) DEK mostrou difusa e coloração positiva fortemente nuclear no CRC em estágio final. proteínas (C) DEK é positivo em células cancerosas invasivas na serosa do cólon. proteínas (D) DEK é negativo no CRC sem metástase.

As correlações entre a expressão DEK eo índice e apoptose índice Ki-67 em tecidos humanos CRC

Foi avaliada a correlações entre a expressão DEK eo Ki-67 e índices apoptóticos em tecidos CRC humanos. O índice Ki-67 foi 26,60 ± 8,12% em tecidos com baixos níveis de expressão DEK e 48,17 ± 7,87% em tecidos com níveis elevados de expressão de DEK (Fig. 3a). Os níveis de expressão DEK e o índice Ki-67 foram positivamente correlacionados (

P

= 0,030). O índice apoptótico foi de 0,78 ± 0,10% em tecidos com baixos níveis de expressão DEK e 0,30 ± 0,16% em tecidos com níveis elevados de expressão de DEK (Fig. 3B). Houve também uma correlação significativa entre os níveis de expressão DEK eo índice de apoptose (

P

= 0,010).

(A) diferenças significativas foram observadas em correlacionar expressão DEK eo índice Ki-67 (

P

= 0,030). (B) Houve também uma correlação significativa entre a expressão DEK e índice de apoptose (

P

= 0,010). . (DEK baixa, “-” e “+”;. DEK alta, “++” e “+++”)

expressão DEK em células CRC por RT-PCR e western blot

os dados acima mostrados IHC e a dados relatados anteriormente [5] sugerem que DEK podem estar envolvidos na progressão da CRCs e um bom marcador de proliferação e metástase. Assim, foram detectados os níveis de mRNA e proteína DEK expressão em várias linhas celulares de CRC, incluindo SW-620, SW-480, HCT 116, e HT29. dados de RT-PCR exibiram que todo o SW-620, SW-480, as células HT29 e HCT116 mostrou elevados níveis de expressão de ARNm de DEK (Fig. 4A). Resultados semelhantes foram observados para os níveis de proteína destas linhas de células através de ensaios de transferência de Western (Fig. 4B). Aqui nós selecionamos células SW-620, que têm alta proliferação e do potencial de metástases confirmada por relatórios anteriores [23], para os seguintes experimentos.

Efeitos da DEK RNAi sobre a proliferação celular da linha celular do cancro do cólon , SW620

SW-620 transfectadas com células DEK ARNi, e descobriram que DEK RNAi eficazmente regulados negativamente os níveis de mRNA e da expressão da proteína de DEK em SW-620 células por coloração de imunofluorescência, RT-PCR, e análise de western blot (Fig. 5A-C).

(a) a localização nuclear da proteína DEK é observada em células siControl e Sidek SW-620. DEK (vermelho) localizada para os núcleos de células SW-620 por coloração de imunofluorescência e observação microscopia confocal. coloração DAPI (azul) foi incluído para visualizar o núcleo. (B) a expressão de ARNm DEK na linha de células de CRC humano SW-620 após siControl e Sidek. a expressão da proteína (C) DEK na linha de células de CRC humano SW-620 após siControl e Sidek.

Os efeitos da expressão da proteína DEK no crescimento celular foram ensaiados utilizando um ensaio MTT. A taxa de crescimento das células tratadas com 100 nM Sidek diminuiu de um modo dependente da dosagem (Fig. 6A). Os valores de absorvância do ensaio MTT após 72 h e 96 h foram de 0,43 ± 0,02 e 0,62 ± 0,03 para o siControl, e 0,35 ± 0,03 e 0,39 ± 0,02 para as células SW-620 Sidek-transfectadas, tanto

P

0,05, respectivamente (Fig 6B.). Além disso, um ensaio de formação de colónias mostraram SW-620 células foram eficientemente reduzida na presença de Sidek (100 nM). Em comparação, Sidek inibiram a formação de colónias em SW-620 células por cerca de 70% (

P

0,05) (Fig. 6C). Estes dados indicaram que houve uma redução significativa no crescimento celular nas células transfectadas com Sidek em comparação com as células siControl.

(A) o ensaio de MTT mostrou Sidek (100 nm) imita reduziu significativamente a proliferação de SW- 620 células em relação ao grupo siControl (

P

= 0,034). (B) ensaio de MTT depois de 24 h, 48 h, 72 h e 96 h para siControl e Sidek-transfectadas células SW-620, *

P

0,05, respectivamente. (C) ensaio de formação de colónias mostrou Sidek tratamento inibiu a formação de colônia em SW-620 células por cerca de 70% (

P Art 0,001).

Efeitos de expressão DEK na apoptose SW-620 de células

como mostrado na FIG. 7A, depois de células SW-620 foram transfectadas com 100 nM ou Sidek siControl, a taxa de apoptose foi significativamente aumentada em Sidek células SW-620 em comparação com células SW-620 siControl-transfectadas. + células A percentagem de anexina V-FITC /7AAD- foi 13,13% no grupo Sidek, e 4,99% no grupo siControl, indicando que a depleção de DEK aumentou a apoptose precoce de células SW-620 (Fig. 7B).

(a) Hoechst33342 coloração revelou que knockdown do gene DEK apoptose induzida. (B) Transfectados Sidek por 48 h aumentou acentuadamente células em apoptose em fase inicial indicada por uma mais elevadas percentagens de anexina V-FITC células + /7AAD- comparação com o grupo siControl.

A expressão de p53 /MDM2, família de caspase, e proteínas Bcl-2 /Bax em células transfectadas Sidek-

Como se mostra na Fig. 8A, os níveis de expressão de mutantes de p53 e expressão de MDM2 em células SW-620 tratados com Sidek diminuiu consideravelmente em ensaios de Western blot, sugerindo que DEK estimula o crescimento de células SW-620 através da via de p53 /MDM2. Além disso, a expressão de Bcl-2 foi regulada negativamente após o tratamento Sidek. Em contraste, a expressão do Bax foi regulada positivamente nas mesmas condições. Estas observações sugeriram que o /Bax via de Bcl-2 desempenha um papel importante na progressão SW-620 células “que é regulada por DEK (Fig. 8B).

proteínas mutantes da p53 e MDM2 (A) foram significativamente regulados negativamente em células SW-620 transfectadas com Sidek. (B) A proporção de Bcl-2 /Bax foi significativamente reduzida em células SW-620 Sidek-transfectadas. (C) a expressão da proteína PARP foi muito mais elevado nas células Sidek, e caspase-3 e -9 proteínas foram significativamente menores no SW-620 células Sidek-transfectadas do que aqueles no grupo siControl. Caspase-8 níveis de proteína mantiveram-se inalteradas.

Além disso, os nossos dados também mostraram que a caspase-3 e caspase-9 foram diminuídas nas células Sidek, enquanto que o nível de expressão da caspase-8 não o fez alterar. No entanto, poli ADP ribose polimerase clivada (PARP) os níveis de expressão com aumento da aplicação Sidek. Estes dados sugerem que a caspase-3 e caspase-9, mas não a caspase-8, estão envolvidos na apoptose de células SW-620 após Sidek transfecção, indicando que Sidek também activada as vias dependentes de caspase (Fig. 8C).

O mecanismo da função DEK no CRC também foi confirmada em outra linha de células CRC HCT116, e encontrou resultados semelhantes com que, em células SW620. Os dados foram fornecidos como as figuras suplementadas (Fig. S1-S3).

Discussão

amplificação do gene

DEK e expressão regulada positivamente têm sido descritos em vários tipos de cancro incluindo carcinoma hepatocelular, cancro da bexiga, e melanoma [7], [16], [24]. As obras de Khodadoust et [7] ai mostraram que os níveis de expressão podem distinguir DEK nevos benignos de melanomas malignos, indicando que esta proteína pode ser muito útil para o diagnóstico diferencial. Recentemente, Datta et ai. [24] relatou que a oncoproteína DEK foi regulada positivamente em tecidos de cancro da bexiga em comparação com os seus homólogos normais, conforme determinado por Western blot. Com efeito, a proteína de DEK estava presente na urina esvaziado de pacientes com bexiga de baixo e alto grau de cancros, o que sugere que DEK poderia ser utilizado como um biomarcador para a detecção de cancro da bexiga utilizando amostras de urina do paciente. Nosso estudo é o primeiro a apresentar um relatório sobre as atividades oncogênicas do DEK no CRC, esgotando DEK, e definir mecanismos funcionais e moleculares para DEK no CRC patogênese.

O nosso estudo anterior [5] mostraram que a fortemente positiva taxa de proteína DEK era 48,62% (53/109) em cancros colo-rectais, que foi significativamente maior do que em qualquer mucosa do cólon normal adjacente (9,17%, 10/109) ou adenomas (13,46%, 7/52). DEK superexpressão em CRCs foi positivamente correlacionada com o tamanho do tumor, grau, metástase linfonodal, invasão serosa, fase tardia, e de sobrevivência e de 5 anos as taxas de sobrevivência livre de doença. Outras análises mostraram que pacientes com CCR em estágio final e expressão alta DEK tiveram pior sobrevida do que aqueles com baixa expressão DEK. Além disso, a análise multivariada mostrou alta expressão DEK, invasão serosa e fase tardia são fatores de risco independentes para mortalidade no CRC. Neste trabalho, western blot e coloração IHC análises mostraram que a alta expressão DEK foi significativamente mais comum em tecidos CRC do que em qualquer mucosa colorretal normal adjacente ou adenomas colorretais.

O antígeno Ki-67 é expressa por células em proliferação durante G1, S, G2, e as fases de M, mas não durante a fase G0 (células em repouso) [25]. Ki-67 é utilizada como um marcador de proliferação do tumor e a agressividade, e pode ter um efeito importante no prognóstico de pacientes com CRC [26] – [27]. Os resultados anteriores demonstraram que o padrão de expressão de proteínas DEK foi muito semelhante ao antigénio Ki-67 como marcador de proliferação em cancros cervicais [28]. A correlação positiva entre a expressão DEK eo Ki-67 ou apoptótica índice em tecidos CRC também foi encontrada neste estudo.

Sábio-Draper et al. [29] utilizado ARNi abordagens para o direccionamento específico de DEK em cancro e as células primárias, e descobriu que a depleção de DEK em células de cancro do colo do útero HeLa resultou na indução de apoptose. Resultados semelhantes foram obtidos com queratinócitos humanos primários, implicando DEK como um cancro e factor de sobrevivência de células primárias. Neste estudo, nós também detectada a associação entre DEK superexpressão e comportamentos mais malignos do CRC utilizando células CRC humanos HCT116 SW-620 e com e sem tratamento RNAi. A análise revelou que a apoptose de células DEK depleção aumentou a apoptose precoce de células HCT116 SW-620 e. Apesar disso, observamos também que a depleção DEK inibiu o crescimento celular em um ensaio MTT e formação de colónias. Estes resultados concordam com os resultados do índice Ki-67 e apoptose em amostra de tecido de CRC. Os nossos resultados indicam que DEK regula o crescimento celular e sobrevivência CRC

In vitro

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A proteína p53 humana é o gene supressor de tumor inactivado mais frequentemente no cancro humano e está envolvido no controlo da proliferação celular em resposta ao stress [30]. No entanto, a p53 tem uma meia-vida curta e é mantida a níveis baixos ou indetectáveis ​​por degradação proteolítica contínua em células normais. sustentada degradação de p53 é mediada principalmente pela ligase E3 MDM2 [31]. Por ligação de p53, blocos de MDM2 o domínio de transactivação de p53 e, por conseguinte, inibe a sua actividade de transcrição [32]. Desafiados com sinais de estresse, como hipóxia ou danos no DNA, o ciclo de feedback de MDM2-p53 é perturbado, levando à apoptose ou malignidade [33]. O estudo de Khodadoust sugeriu um novo papel para DEK na sobrevivência celular, envolvendo a desestabilização da p53 numa forma que é provável que contribuem para a carcinogénese humana [7]. Além disso, a Wise-Draper et al. igualmente considerado que a morte celular em resposta a depleção DEK foi acompanhada por um aumento da estabilidade da proteína e a actividade transcricional do supressor de tumores p53, e a subsequente sobre-regulação de genes alvo p53 conhecidos tais como Bax [29]. Bax, um factor pró-apoptótica da família Bcl-2, localiza-se em uma forma monomérica no citosol ou frouxamente ligado às membranas sob condições normais. Seguindo um estímulo morte, citosólica e monomérico da Bax translocar para as mitocôndrias, onde se transformam em proteínas de membrana integrais.