Abstract

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é um alvo bem estabelecido para o tratamento do câncer. Tirosina-cinase EGFR (TK), tais como inibidores gefinitib e erlotinib, têm sido desenvolvidos como fármacos anti-cancro. Embora carcinoma de células não-pequenas do pulmão de células com uma mutação de activação do EGFR, L858R, responde bem a gefinitib e erlotinib, tumores com EGFR duplamente mutado, T790M-L858R, adquirem resistência a estas drogas. O

C. elegans

EGFR homólogo DEIXE-23 e sua via de sinalização a jusante têm sido estudados extensivamente para fornecer informações sobre os mecanismos reguladores conservados de

C. elegans

para os seres humanos. Para desenvolver um

in vivo

sistema de rastreio de cancro drogas potenciais alvo mutantes EGFR específicos, que expressa três let-23 quimeras em que o domínio TK foi substituído quer com o domínio TK humano de tipo selvagem (23 DEIXE-: : hEGFR-TK), um domínio TK com a mutação L858R (LET-23 :: hEGFR-TK [L858R]), ou um domínio com as mutações TK-T790M L858R (let-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R ]) em

C. elegans

células da vulva usando o

promotor deixá-23

. A proteína quimérica de tipo selvagem hEGFR-TK resgatou o

deixe-23

fenótipo mutante, e as ativando quimeras hEGFR-TK mutantes induziu um fenótipo multivulva (Muv) em um tipo selvagem

C. elegans fundo branco. O gefitinib drogas anti-câncer e erlotinib suprimiu o fenótipo Muv no LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] -expressing animais transgênicos, mas não no LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] animais transgênicos. Como uma tela piloto, 8.960 pequenos produtos químicos foram testados para a supressão Muv, e AG1478 (um inibidor de EGFR-TK) e U0126 (um inibidor de MEK) foram identificadas como potenciais inibidores da função biológica mediada pelo EGFR. Em conclusão, transgênico

C. elegans

expressam proteínas LET-23 :: hEGFR-TK quiméricos são um sistema modelo que pode ser usado em telas específicas de mutação de novas drogas anti-câncer

Citation:. Bae YK, Sung JY, Kim YN, Kim S, Hong KM, Kim HT, et al. (2012) An

In Vivo C. elegans

sistema modelo para Triagem de EGFR de inibição de Anti-Cancer Drugs. PLoS ONE 7 (9): e42441. doi: 10.1371 /journal.pone.0042441

editor: Anne C. Hart, da Universidade Brown, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Março, 2012; Aceito: 09 de julho de 2012; Publicação: 05 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Bae et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apenas apoiada por uma bolsa de investigação no Centro Nacional do Câncer (NCC-1110060) da Coreia do Sul (www.ncc.re.kr). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o desenvolvimento de um alto rendimento, baixo custo

in vivo

sistema de triagem para pequenas reagentes anti-câncer molécula seria idealmente capaz de superar os principais problemas do convencional

in vitro

métodos de rastreio. Devido ao rápido tempo de geração, números elevados de progênie, de baixo custo e ferramentas genéticas bem estabelecidas, o nematóide

Caenorhabditis elegans

(

C. Elegans

) é um candidato atraente para um modelo sistema de triagem de animais , com muitas das vantagens da

in vitro

sistemas de rastreio e modelos animais [1].

EGFR é sobre-expresso ou anormalmente ativados em vários tipos de câncer humano, como de mama, ovário e carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC) [2]. EGFR está envolvido em várias etapas de desenvolvimento do cancro, incluindo a tumorigénese, invasão, metástase e angiogénese [3], e, assim, fornece um alvo atraente para o desenvolvimento de medicamentos de cancro. Gefitinib (nome comercial: Iressa) foi o primeiro fármaco inibidor da TK EGFR desenvolvido para o tratamento de cancros epiteliais, tais como NSCLC [4]. As mutações no domínio da TK EGFR tem sido associada a sensibilidade a gefitinib num subconjunto de cancros do pulmão, e também se verificou que activam as vias anti-apoptóticas [5], [6].

C. elegans

desenvolvimento vulvar é um sistema modelo bem estabelecido utilizado para estudar a via de sinalização de EGFR [7] – [9]. Entre as seis células precursoras da vulva (VPCs), P5.p, P6.p, e P7.p adoptar os 2 ° -1 ° -2 ° destinos celulares, respectivamente, e continuar a dividir para formar a vulva madura. O destino 1 ° de células é determinado, como resultado da EGFR-Ras-MAPK sinalização em P6.p, ao passo que o destino 2 ° células é determinada por Lin-12 sinalização /Notch em P5.p e P7.p, o qual é activado como um resultado de EGFR-Ras-MAPK sinalização na célula vizinha. Componentes da via EGFR, incluindo o EGFR, Ras, Raf, MEK, e MAPK, são altamente conservadas entre o homem e

C. elegans

[8]. Um número limitado de compostos químicos que têm como alvo a via EGFR foram testados usando

C. elegans

desenvolvimento da vulva como um modelo. inibidores de farnesiltransferase, que inibem a atividade Ras, e compostos MCP, que perturbem interacções Ras-Raf foram encontrados para atuar especificamente sobre as proteínas ortólogos no

C. elegans

EGFR-Ras pathway [10] – [12]. A toxicidade do EGFR inibidores da quinase BIBU1361 e BIBX1382 também foi avaliada no

C. elegans

[13]. Estes estudos sugerem o potencial de utilização

C. elegans

como uma ferramenta para o rastreio via de drogas anti-EGFR.

Neste estudo, foi desenvolvido e analisado um ser humano impulsionado-EGFR

C. elegans

modelo, o qual exibe o fenótipo Muv. Utilizando este modelo, uma tela de piloto de 8.960 produtos químicos foi realizado, e um inibidor de EGFR e um inibidor de MEK foram isolados como eliminadores, sugerindo que este

C. elegans

sistema baseado pode ser usado de forma eficiente para a tela de novas drogas EGFR-inibitório.

Materiais e Métodos

cultura Worm e estirpes

de tipo selvagem N2 e estirpes mutantes foram cultivadas como descrito por Brenner [14]. alelos mutantes utilizados neste trabalho são

deixe-23 (SY1), deixe-23 (SA62), deixe-60 (n1700) Comprar e

lin-15 (n765)

. linhas de integração utilizados neste trabalho são

jgIs6

[

deixe-23p

:: DEIXE-23 :: hEGFR-TK [L858R],

rol-6 (su1006)

],

jgIs19

[

deixe-23p

:: dEIXE-23 :: hEGFR,

rol-6 (su1006)

],

jgIs25

[ ,,,0],

deixe-23p

:: dEIXE-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R],

rol-6 (su1006), mio-2p :: mCherry

],

jgIs14

[

EGL-17p

:: EMR-1 :: RFP,

DHS-31p

:: NLS :: GFP,

rol-6 (su1006)

], JJ1136 (HMP-1 :: GFP), PS4657 (AJM-1 :: GFP) e PS3352 (CDH-3 :: GFP).

Construção de let-23 :: hEGFR plasmídeos quiméricos

Foi utilizado o ADN genómico do

deixe-23

gene e cDNA que codifica EGFR humano. Cada fragmento de ADN foi amplificado por PCR, clonado no vector fácil de pGEM-T (Promega Inc., Madison, WI, EUA), e confirmado por sequenciação. Em seguida, reuniu os fragmentos de ADN utilizando enzimas de restrição apropriadas e os locais correspondentes do vector pPD117.01 (Dr. Andrew Fire, Stanford Univ., CA, EUA). mutagénese QuikChange Site-Directed (Cat # 200523, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA) de ADNc de EGFR-TK foi realizado para produzir o EGFR [L858R], EGFR [T790M] e EGFR [T790M-L858R]. O procedimento detalhado e os iniciadores utilizados neste estudo são fornecidos nos materiais suplementares (fig. S1B). Para utilização como um marcador do destino da célula secundária, pJG205 foi construído através da combinação de um fragmento de PCR amplificado a partir da sequência de ADN genómico de 4,0 kb a montante de

egl-17

com

EMR-1