Abstract

Fundo

Detecção de uma nova droga anticâncer eficaz e hypotoxic é uma nova estratégia emergente para o câncer quimioterapia. Doxiciclina (DC) é uma espécie de antibióticos, mas também inibe a tumorigênese.

Métodos

MTT e invasão celular, citometria de fluxo, os ratos de análise e nus western-blot foram utilizados para investigar os efeitos e subjacente mecanismos de doxiciclina em células de cancro do ovário epiteliais

resultados

a doxiciclina inibiu a proliferação e invasão de SKOV3 e SKOV3 /DDP.; apoptose induzida moderada de SKOV3 /DDP. expressão de CXCR4 em ambos os níveis de proteína e ARNm foi regulada negativamente em ambas as linhas celulares quando tratadas com doxiciclina. Akt e ERK1 /2 foram envolvidos no efeito doxiciclina sobre a proliferação celular de células SKOV3, mas não de células SKOV3 /DDP. Akt e EKR1 /2 fosforilação foram activadas por SDF-1α, que foi então inibido pela doxiciclina na SKOV3. Pró-caspase-3 foi significativamente maior do que em SKOV3 em que SKOV3 /DDP que foi regulada positivamente quando tratadas com doxiciclina. In vivo, a doxiciclina inibiram xenoenxerto de tumor peritoneal e diminuição da ascite maligna.

Conclusão

A doxiciclina não só tem um efeito inibitório sobre o cancro do ovário, mas também pode aumentar a sensibilidade ao cisplatino. SDF-1α /regulada-CXCR4 de Akt e ERK 1/2 activações provavelmente estão envolvidos no efeito anti-tumoral de doxiciclina em células SKOV3, enquanto que a regulação positiva de pró-caspase-3 pode ser o principal mecanismo envolvido em células SKOV3 /DDP.

Citation: Wu W, Yu Lh, Ma B, Xu Mj (2014) O Efeito Inibidor de doxiciclina na cisplatina-Sensitive e -Resistente epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 9 (3): e89841. doi: 10.1371 /journal.pone.0089841

editor: Han-Ming Shen, Yong Loo Lin Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Recebido: 20 de julho de 2013; Aceito: 27 de janeiro de 2014; Publicação: 05 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (No. 10411960100) e Changhai Hospital (No. CH125510105). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial (EOC) representa mais de 90% de todos os tumores malignos de ovário e é principalmente uma doença das mulheres na pós-menopausa, que ocorre mais comumente em sexta e sétima décadas de vida [1]. Ela representa a causa mais comum de morte entre as mulheres com tumores ginecológicos e a taxa global de sobrevida em 5 anos é [2].

Actualmente, o tratamento padrão para o câncer de ovário envolve debulking tumor e platina com base em apenas 30% quimioterapia [3]. A resposta a este regime é, pelo menos, 70% dos casos, no entanto, 60-80% de socorristas irão recair no prazo de 18 meses com uma doença resistente a platina [4].

A cisplatina (DDP), um noncycle dependente de derivados de platina citotóxico, tem sido frequentemente usado em diferentes tumores sólidos, incluindo gástrica, testicular, urológica, cabeça, pescoço e câncer de ovário [5]. Os compostos de platina exercem o seu efeito citotóxico através da formação de ligações cruzadas de DNA-platina intracadeia. Isto inibe a replicação do ADN e, finalmente, conduz à apoptose [6]. No entanto, tal como outros fármacos anti-cancerígenos, cisplatina resistência continua a ser um obstáculo significativo para o seu sucesso clínico. A maioria dos pacientes com cancro dos ovários recorrente irão, eventualmente, desenvolver doença resistente a platina [7], fazendo com que as células tumorais refractários à terapia. Portanto, é necessário buscar novas drogas quimioterápicas económicas e eficazes que têm actividades antitumorais e /ou aumentar as respostas anti-tumorais à quimioterapia à base de platina.

A doxiciclina (DC) é uma espécie de tetraciclinas de segunda geração, que é comumente utilizado para tratar uma variedade de infecções. Os estudos actuais têm demonstrado que a doxiciclina é uma droga pluripotentes que afecta muitas funções anticancerígenas, incluindo efeitos anti-crescimento do tumor em carcinoma epidermóide oral humano e inibição da migração de células de melanoma [8] – [9]. A doxiciclina também tem um potencial para a actividade terapêutica melhorada do cancro terapias biológicas [10]. No entanto, o efeito da doxiciclina nas células de cancro do ovário epiteliais e os mecanismos subjacentes permanecem desconhecidos.

Portanto, em nosso experimento, pretendemos demonstrar que a doxiciclina tem uma actividade anticancerígena em células de cancro do ovário epiteliais, e para continuar a explorar os mecanismos subjacentes envolvidos.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. Todos os procedimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Segunda Universidade Médica Militar. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

cultura de células e reagentes

linhas celulares de cancro do ovário humano HO8910 foi obtida a partir do departamento de fisiopatologia da Segunda Médica Militar Universidade. SKOV3 e as suas células resistentes à cisplatina cognatos SKOV3 /DDP foram obtidas a partir de ATCC (American Tissue Culture Collection). células SKOV3.ip foram fornecidos pelo Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital de Xangai People First (obtida a partir de ATCC). As células foram mantidas em meio RPMI-1640 com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. A cisplatina, doxiciclina, SDF-1α, anticorpo contra β-actina foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Os anticorpos contra CXCR4, fósforo-Akt, Akt total, fósforo-ERK, ERK total, a MMP-2, MMP-9, caspase-3 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. kit de Transwell foi adquirido a partir de BD, EUA. kit de ELISA foi adquirido a R D, EUA. Kit celular apoptótica foi adquirido de Roche, EUA. RNAs interferentes pequenos foram sintetizados por Genepharma Company (Xangai, China). Xfect Transfecção agente foi adquirido em Clontech, EUA. RNeasy minikit foi adquirida da QIAGEN, Clifton Hill, Austrália.

MTT

Como informamos antes

11, a ensaios de MTT (methylthiazoltetrazolium) foram conduzidos para avaliar a viabilidade celular. suspensão de células foram semeadas em placas de 96 poços, após 12 h de fixação, em seguida, tratado com diferentes concentrações de cisplatina ou doxiciclina. células tratadas com o fármaco foram incubadas durante 48 h e, em seguida, solução a 5 mg /mL de MTT foi adicionado às culturas durante mais 4/3 h. Finalmente, o meio contendo MTT foi aspirado e foram adicionados 100 ul de DMSO solução. Como resultado, as células vivas cristais formados devido à presença de MTT. Os cristais foram dissolvidos por DMSO e a absorvância foi medida a 490 nm por um leitor de imunossorvente.

-PCR em tempo real

O ARN total foi isolado utilizando um minikit RNeasy (Qiagen, Clifton Hill, Austrália) . Duas ug de ARN total foram reversamente transcrito em ADNc numa reacção de 25 ul contendo 15 nmol /L de MgCl2, 375 mmol /L de KCl, 50 mmol /L de ditiotreitol, 250 mmol /L de Tris-HCl (pH 8,3), 10 mmol /L todos os quatro dNTPs, 20 U de inibidor de RNase, 200 U de M-MLV de transcriptase reversa, e 50 ng de iniciadores oligo18. A mistura foi incubada a 70 ° C durante 5 minutos e depois a 42 ° C durante 60 min seguido por 10 min a 70 ° C. Foram utilizados os seguintes iniciadores: CXCR4, 5-CCAACGTCAGTGAGGCAGAT-3 (para a frente) e 5-GGCAGGATAAGGCCAACCAT-3 (reverso); β-actina, 5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 (para a frente) e 5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 (reverso). PCR em tempo real foi realizado utilizando-Rotor Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Austrália) numa mistura reaccional de 25 ul. Foram utilizados 2 × Taq PCR Master Mix e 0,2 nmol /L de cada iniciador. Real-time condições de PCR foram optimizados de acordo com experiências preliminares para estabelecer uma relação linear entre a concentração de ARN e produtos de PCR. A especificidade dos iniciadores foi verificada através da análise da curva de fusão, bem como subsequente sequenciação dos produtos de RT-PCR em tempo real. A água destilada foi usada no lugar de ADNc como um controlo negativo. Todas as amostras foram normalizados contra o controle interno β-actina. a expressão do gene foi calculada utilizando o ciclo limiar comparativa método (Ct).

Western-blot análise

Como já relatado anteriormente [11], as células foram colhidas e homogeneizadas em tampão de lise frio (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% de sal de sódio do ácido desoxicólico, 0,1% de SDS, e uma mistura de inibidor de protease), utilizando um homogeneizador. A concentração total de proteína foi determinada pelo método de Bradford utilizando soro bovino como padrão. Quantidades iguais de proteínas foram separadas por 10% SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno. Depois de bloqueado em tampão constituído por 20 mM de Tris-HCl, pH de NaCl 7.4,137 mM, 0,1% de Tween 20 de bloqueio, e 5% de leite desnatado durante 2 horas à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C em anticorpo primário (anti -β-actina 1:1000, anti-CXCR4 1:1000, anti-fósforo-Akt 1:1000, anti-Akt total de-1:1000, anti-fósforo-ERK 1:1000, anti-total de ERK-1:1000 , anti-MMP-2 1:1000, anti-MMP-9 1:1000). As manchas foram então incubadas com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:1000, Santa Cruz) durante 2 h à temperatura ambiente, e finalmente visualizados em solução ELC. Durante 1 min e expostas em filme Kodak para 1-30 min. Para o controlo de carregamento de gel correcto, foi utilizado quantificação β-actina. Para quantificar os sinais de Western blot, a densidade da banda foi medida usando UMAX PowerLook III e normalizada em relação ao controle.

ELISA ensaio

Foram determinadas as quantidades de SDF-1 nos meios condicionados utilizando sanduíche ELISA (sensibilidade de 15 pg /ml) de acordo com os protocolos do fabricante.

invasão celular ensaio

SKOV3 e SKOV3 /DDP invasões celulares foram avaliadas utilizando câmaras Transwell de 24 cavidades de cultura de células-policarbonato com 8,0 de poro inserções de filtro. Os filtros foram primeiramente revestido com BD matrigel. A solução estoque de matrigel foi diluída com meio RPMI-1640 isento de soro (1:01). Uma quantidade de Matrigel diluída foram pintados em cada elemento filtrante e permaneceu à temperatura ambiente durante 10-15 minutos para secar. Em seguida, as células cultivadas foram tripsinizadas e suspensas em meio RPMI-1640 isento de soro a uma concentração de 2 x 10

5 ml. Um total de 500 ul de meio de FBS a 10% /RPMI-1640 ou 500 ul de /ml de solução a 50 ng SDF-1 foi adicionada à câmara inferior e 100 ul de suspensão de células foi aplicado a filtros revestidos de inserção. A câmara foi incubada durante 3 h para permitir a ligação de células, em seguida, as células foram tratadas com doxiciclina. A câmara foi incubada durante 36 horas para permitir a invasão de células; A inserção foi então fixadas com álcool desidratado durante 15 minutos, e depois coradas com 0,1% de violeta de cristal durante 15 minutos e lavou-se com 1 x PBS. As células desnecessárias no lado superior ou inferior do filtro foram raspadas. A membrana foi montado sobre uma lâmina e depois examinadas sob um microscópio utilizando 20 x de ampliação. Invasão foi quantificada através da medição das células coradas em três áreas aleatórias por membrana.

análise citométrica de fluxo da apoptose das células

As células foram recolhidas e duplamente coradas com ficoeritrina-anexina V conjugada com PE e de acordo com o as instruções do fabricante. células de anexina V-positivos foram considerados por apoptose, e a percentagem do número total de células foi calculada. Dez mil eventos foram coletadas para cada amostra usando um Becton Dickinson FACScan (Citometria de Fluxo Facility, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY), e os dados foram analisados ​​utilizando o programa Winlist (VeritySoftware House, Topsham, ME).

siARN transinfected tecnologia

As sequências alvo para ERK foram 5′-GUGCUCUGCUUAUGAUAAUTT-3 ‘(sentido) e 5′-AUUAUCAUAAGCAGAGCACTT -3’ (anti-sentido). AKT siRNA foram: 5- GACGGGCACAUUAAGAUCATT-3 (sentido) e 5- UGAUCUUAAUGUGCCCGUCTT -3 (anti-sentido). duplexes de ARNip foram concebidos precipitação (5- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 e 5- ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3) como um controlo negativo (CN). As células foram transfectadas com 25 nM de ARNsi alvo ou ARNsi de controlo usando Xfect Transfecção Agente de acordo com as instruções do fabricante, e transfecção foi levada a cabo durante 24 h (para AKT e ERK). Subsequentemente, o meio de cultura foi substituído com 1640 suplementado com 10% de FBS inactivado pelo calor. Após 48 h, ensaios MTT foram conduzidos para avaliar a viabilidade celular.

peritoneal xenoenxerto de tumor em ratinhos nus

nu (c-nu BALB /) murganhos (4 semanas, 18-20 g, fornecidos pela Academia chinesa de Ciências, Pequim) foram divididos em três grupos: um grupo controle, um grupo de tumores e um grupo de tumores tratados com doxiciclina. Para o grupo de tumor, que injectado células SKOV3.ip para a cavidade peritoneal ratinhos a uma densidade de cerca de 8 × 10

6 /ml. As células foram ressuspensas em meio isento de soro RPMI-1640 400 ul e depois injectado. Para o grupo do tumor tratado com doxiciclina, depois injectado células de tumor durante 14 dias, a doxiciclina (3 mg /rato) foi i.p. todos os dias injectado para suprimir o crescimento do tumor. Para o grupo de controlo, os ratinhos foram tratados com igual volume de PBS. Todos os ratinhos foram mortos no dia 21 após a primeira injecção. peso ratos, tamanhos tumorais e ascite foram avaliados em todos os três grupos.

A análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± S.E.M. As experiências foram efectuadas três vezes, independentemente. teste de Estudantes desemparelhados foi utilizado para dois grupos de dados. Uma maneira ANOVA foi utilizado para comparações múltiplas (software SPSS versão 16.0), P-valores 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

doxiciclina inibe a proliferação de células de cancro do ovário epiteliais

.

Depois de 48 h de tratamento com cisplatina e doxiciclina em diferentes concentrações, a viabilidade celular foi diminuída de um modo dependente da dose na HO8910 (Fig. S1A, B), SKOV3 (Fig. 1A, C) e SKOV3 /DDP (Fig. 1B, D). O IC

50 de doxiciclina em SKOV3 foi comparada com a de SKOV3 /DDP. Os resultados mostraram que o IC

50 era 16,33 ug /ml em SKOV3 (Fig. 1C) e 8,53 ug /ml em SKOV3 /DDP (Fig. 1D), respectivamente, o que indica que as células SKOV3 /DDP foram mais sensíveis à doxiciclina a viabilidade celular de células SKOV3 tratamento.

SKOV3 (a, C) e SKOV3 /DDP (B, D) foi inibida de um modo dependente da dose pelo tratamento com cisplatina e doxiciclina. E, F mostraram que a co-tratamento com cisplatina (1,5 ug /mL e 2,5 ug /ml) e doxiciclina (10 ug /ml) tinha uma inibição significativa do crescimento em células SKOV3, quando comparada com a da cisplatina ou doxiciclina tratado sozinho. G, H mostraram que, quando combinados de doxiciclina (2,5 e 5 ug /mL) com diferentes concentrações de cisplatina, o IC

50 da cisplatina em células SKOV3 /DDP foi de 3,36 e 2,66 ug /ml, respectivamente. n = 9. *,

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doxiciclina sensibiliza as células de cancro do ovário a cisplatina

Realizamos experimentos com co-aplicação de cisplatina e doxiciclina.. Em primeiro lugar, seleccionado duas doses (1,0 e 1,5 ug /ml) de cisplatina e combinou-os com doxiciclina baixa dose (0-10 ug /ml), respectivamente. Na linha celular HO8910, observou-se uma inibição significativa do crescimento de células 48 horas após a co-aplicação de 1,0 ug /ml (Fig. S1C) ou 1,5 ug /ml (Fig. S1d) cisplatina com 7,5 ou 10 ug /doxiciclina ml, enquanto cisplatina tratada isoladamente faltava o efeito. Os resultados semelhantes foram mostrados numa linha celular de células SKOV3, com uma inibição significativa do crescimento celular quando combinando 1,5 ug /ml (Fig. 1E) ou 2,5 ug /mL de cisplatina (Fig. 1F) com 10 ug /ml de doxiciclina. Em seguida, foram selecionadas duas doses (2,5 e 5 ug /ml) de doxiciclina e os combinou com diferentes concentrações de cisplatina (0-100 ug /ml), respectivamente. A IC

50 de cisplatina na presença de doxiciclina (2,5 e 5 ug /ml) foi ml 3,36 ng /ml e 2,66 ug /, respectivamente (Fig. 1G, H), que foi muito mais baixa do que a da cisplatina isolada (Fig. 1C, IC

50 = 10,14 ug /ml).

cisplatina e doxiciclina inibir a capacidade de invasão das células epiteliais de cancro do ovário

o efeito da cisplatina e doxiciclina na invasão capacidade das células de tumor foi examinado por um ensaio de invasão. Em primeiro lugar, seleccionado de 1,5 ug /ml e 5 ug /mL de cisplatina para o tratamento de células SKOV3 e SKOV3 /DDP, respectivamente. FIG. S2A, B representado capacidade do tumor invasão celular na presença (c) ou na ausência (d) de cisplatina em ambas as células SKOV3 e SKOV3 /DDP. Descobrimos que a cisplatina tinha um efeito inibidor sobre a capacidade das células de ovário de invasão. Em seguida, foram selecionados 10 ug /mL de doxiciclina para tratar células SKOV3 e 5 ug /ml de doxiciclina para tratar células SKOV3 /DDP. A Figura 2A, B representado capacidade do tumor invasão celular na presença (c) ou na ausência (d) da doxiciclina em ambos SKOV3 (Fig. 2A) e células SKOV3 /DDP (Fig. 2B). Pela primeira vez, verificou-se que a doxiciclina pode inibir a capacidade de invasão de ambas as células SKOV3 e SKOV3 /DDP.

As células foram cultivadas em Transwell com doxiciclina indicada por 36 células /DDP por dobras 4 e 2, respectivamente. A: suspensão de células sem soro 100 ul (depois de células ligadas) com tratadas com doxiciclina (10 ug /ml) em filtros de pastilhas revestidas; 500 RPMI-1640 meio isento de soro com doxiciclina ul (10 ug /ml) em câmaras inferiores, foram fotografadas imagens a partir do lado superior das membranas. b: suspensão de células sem soro 100 ul em filtros de inserção revestidos; 500 de meio RPMI-1640 isento de soro ul nas câmaras inferiores, foram fotografadas imagens a partir do lado superior das membranas. C: 100 ul de suspensão de células isenta de soro (depois de células ligadas) com tratadas com doxiciclina (10 ug /ml) em filtros de pastilhas revestidas; 500 ul de 10% FBS /RPMI-1640 nas câmaras inferiores, foram fotografadas imagens a partir do lado inferior das membranas. d: suspensão de células sem soro 100 ul em filtros de inserção revestidos; 500 ul de 10% FBS /RPMI-1640 nas câmaras inferiores, foram fotografadas imagens a partir do lado inferior das membranas. C /A representa a razão de células provenientes através da membrana de filtro de inserir o tratamento com doxiciclina. d /b representa a proporção de células provenientes embora a membrana do cartucho do filtro sem doxiciclina. C, D mostraram que a doxiciclina inibe a invasão SDF-1α induzida por em ambas as linhas de células e uma moderada a apoptose induzida pela doxiciclina em células SKOV3 /DDP e inibição pela doxiciclina na secreção de SDF-1α em células SKOV3. C: SDF-1α aumentou a invasão de células SKOV3 por 9 dobras que foi inibida pela doxiciclina (10 ug /ml). D: SDF-1α só aumentou a invasão de células SKOV3 /DDP em 1,5 dobras, que foi inibida pela doxiciclina (5 ug /ml). n = 3, *,

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. 0,01

doxiciclina inibe a invasão de células tumorais induzida-1α SDF em células de cancro do ovário

SDF-1α é um membro de quimiocinas e desempenha um papel importante na metástase do cancro do ovário [12]. A fim de investigar se a SDF-1α poderia promover a capacidade invasiva de células de cancro do ovário, que, em seguida mudado o factor induzido (10% de FBS) para SDF-1α (50 ng /ml). Como mostrado na Fig. 2C, SDF-1α aumentou a invasão de células SKOV3 por 9 pregas, o que pode ser significativamente inibida pela doxiciclina. Embora nas células SKOV3 /DDP, SDF-1α na mesma dose única aumentou a capacidade de invasão de 1,5 vezes, o que também pode ser inibida por doxiciclina (Fig. 2D).

A doxiciclina induz a apoptose de células SKOV3 /DDP mas não de células SKOV3

O rácio apoptótica foi testada em duas linhas de células após o tratamento com 5, 10 e 20 ug /ml de doxiciclina durante 12 h. Como mostrado na Figura 3A, a doxiciclina (20 ug /ml) a apoptose de células SKOV3 /DDP aumentou 13 dobras enquanto teve nenhum efeito sobre células SKOV

3 células

A:. A análise de citometria de fluxo mostrando a apoptose celular após tratamento com diferentes concentrações de doxiciclina durante 6 h. 20 ug /mL de doxiciclina aumentou a apoptose das células SKOV3 /DDP por 13 dobras. B: análise de ELISA mostrando a doxiciclina (10 ug /ml) inibiu a secreção de SDF-1α em células SKOV3 de um modo dependente do tempo. PCR em tempo real e análise de transferência de Western que mostra os efeitos de doxiciclina sobre a expressão de CXCR4 em ambos os níveis de mRNA e proteína em células SKOV3 (C, E) e células SKOV3 /DDP (D, F). Após o tratamento com doxiciclina de concentrações indicadas, durante 48 h, a expressão de CXCR4 em ambos os níveis de proteína e ARNm foram significativamente inibidas em duas linhas celulares. n = 3. *,

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doxiciclina inibe a secreção de SDF-1α em células SKOV3, mas não em células SKOV3 /DDP

a SDF-1α e o seu receptor CXCR4 desempenham um papel importante no processo de invasão tumoral e metástase [13], que, em seguida, efectuados ensaio de ELISA para determinar se podia inibir a doxiciclina secreção de SDF-1α em duas linhas celulares. Os resultados mostraram que em SKOV3, secreção SDF-1α foi significativamente diminuído por tratamento de doxiciclina de uma maneira dependente do tempo, com o nível mínimo observado a 180 minutos (Fig. 3B). No entanto, a secreção de SDF-1α não foi detectada em células SKOV3 /DDP.

A doxiciclina diminui ARNm CXCR4 e os níveis de proteína em células SKOV3 e SKOV3 /DDP

CXCR4 poderia ser activado por SDF-1α e é o único dos 14 receptores de quimiocina expressa num subconjunto de células tumorais em tumores do ovário e tumores do ovário primário [14]. Nas nossas experiências, as células foram tratadas com diferentes concentrações de doxiciclina durante 48 h, em seguida, CXCR4 ARNm e os níveis de proteína foram analisados ​​por PCR em tempo real e análise de Western blot. Verificou-se que a doxiciclina inibe a expressão de CXCR4 em ambos os ARNm (Fig. 3C. D) e níveis de proteína (Fig. 3E, F) em ambas as linhas de células SKOV3 e SKOV3 /DDP.

Cisplatina e doxiciclina inibe a viabilidade celular através Akt e ERK vias em SKOV3 mas não em células SKOV3 /DDP

tem sido relatado que a resistência à cisplatina de câncer de ovário humano está relacionado à ativação de PI3K /Akt e /2 vias de sinalização ERK1 [15] – [16 ], que, em seguida, determinou o potencial envolvimento destas duas vias em efeitos cisplatina e doxiciclina sobre a proliferação de células de cancro do ovário. Depois de empobrecimento de Akt e ERK por siARN (Fig. 4A, B), os resultados de MTT mostrou que a redução de Akt e expressão de ERK pode atenuar o efeito inibidor sobre a proliferação quando tratados com cisplatina e doxiciclina durante 48 h em SKOV3 (Fig. 4C, D , G, H), mas não teve nenhum efeito sobre a proliferação das células SKOV3 /DDP (Fig. 4E, F, I, J).

Redução de Akt e ERK pela expressão de Akt e ERK siARN capaz de atenuar o inibidor efeito sobre a proliferação quando tratados com cisplatina e doxiciclina para 48 (C, D, G, H), mas não teve nenhum efeito sobre a proliferação das células SKOV3 /DDP (e, F, I, J) *,

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doxiciclina inibe a ativação induzida por SDF-1α de Akt ou ERK em SKOV3 mas não em SKOV3 /DDP

a fim de entender se o SDF-1α-Akt induzida e /ou a fosforilação de ERK em duas linhas de células pode ser inibida pela doxiciclina, foi realizada uma série de experiências com pré-tratamento. Em primeiro lugar, investigou-se a fosforilação de Akt e ERK em SKOV3 após o tratamento SDF-1α (50 ng /mL) durante tempos diferentes (0, 2, 5, 10, 20, 40 min). Como mostrado na Fig. 5A, B, SDF-1α estimulada Akt e ERK fosforilação de um modo dependente do tempo. A Akt e ERK fosforilada foram significativamente e alcançou um máximo a 10 ou 20 minutos após o tratamento SDF-1α. As experiências semelhantes foram, em seguida, levada a cabo em SKOV3 /DDP. Notavelmente, não havia nenhuma activação de Akt e ERK após o tratamento de SDF-1α (dados não mostrados). Além disso, nós encurtado o tempo de tratamento de menos do que 10 min. Nós ainda não encontrou qualquer activação da Akt (Fig. 5C), enquanto a ativação ERK foi aumentada de 0,5 min e atingiu um máximo em 1 min (Fig. 5D). Em seguida, as células SKOV3 foram pré-tratadas com doxiciclina (0, 5, 10 ug /ml) durante 3 h, e, em seguida, foram aplicados com o SDF-1α (50 ng /ml) durante 10 min. A inibição dos níveis de fósforo fosforescente-ERK-Akt e foi observada após a aplicação de 10 ug /ml de doxiciclina (Fig. 5E, F). Aplicação de doxiciclina sozinho não teve qualquer efeito. Do mesmo modo, as células SKOV3 /DDP foram pré-tratados com a mesma dose de doxiciclina durante 3 h, e depois tratou-se com SDF-1α (50 ng /ml) durante 1 min. A doxiciclina não teve nenhum efeito sobre a activação de Akt (Fig. 5G). fosforilação de ERK induzida por SDF-1α não pode ser bloqueada por doxiciclina na dose de 5 ou 10 ug /ml. (Fig. 5H).

Após o tratamento de SDF-1α (50 ng /mL) durante 0, 2, 5, 10, 20, 40 minutos, AKT (A) e ERK (B) na fosforilação SKOV3 As células foram aumentadas. Quando tratada SKOV3 /DDP com a mesma dose de SDF-1α para 0, 0,5, 1, 2, 5, 10 minutos, a fosforilação de AKT (C) não se alterou, enquanto a fosforilação de ERK (D) foi aumentada de forma significativa. Em seguida, as células foram pré-tratadas com 0, 5, 10 ug /ml de doxiciclina durante 3 h, depois tratou-se com SDF-1α (50 ng /ml) durante 10 min (SKOV3) ou 1 minuto (SKOV3 /DDP), SDF-1α- AKT induzida (e) e fosforilação de ERK (F) em células SKOV3 foram apenas inibidas quando co-aplicação com doxiciclina em dose de 10 ug /ml. Em células SKOV3 /DDP, SDF-1α não induziu fosforilação de AKT (G) e fosforilação de ERK reforçada (H) não pode ser bloqueada por doxiciclina na dose de 5 ou 10 ug /ml. n = 3. *,

p Art 0,05, **,

p Art 0,01, grupos SDF-tratados-1a

vs

grupo controle. #,

p Art 0,01, grupos co-tratados SDF-1a mais doxiciclina

vs grupos SDF-1 tratados

doxiciclina regula positivamente pró-caspase. 3 expressão em SKOV3 /DDP, mas não em células SKOV3

Caspase-3 é um mediador importante da apoptose e também pode ser associado com quimiorresistência de cancro do ovário humano [17]. Em seguida, as alterações observadas na sua expressão em duas linhas celulares após tratamento com doxiciclina. Em primeiro lugar, nós comparamos Akt, ERK fosforilação, CXCR4 e pró-caspase-3 de expressão entre duas linhas de células. Os resultados mostraram que não havia nenhuma diferença significativa da fosforilação de Akt (Fig. 6A). ERK fosforilação, CXCR4 e expressão de pró-caspase-3 em SKOV3 /DDP foram menores do que aqueles em células SKOV3, respectivamente (Fig. 6B, C, D). Em seguida, foram tratados duas linhas de células com 10 ug /mL de doxiciclina de tempo diferente (0, 0,5, 1, 2, 6, 12 h). Como mostrado na Fig. 6E, pró-caspase-3 expressão foi significativamente aumentada em SKOV3 /DDP, enquanto não se alterou em SKOV3.

Comparação de Akt, ERK, CXCR4 e pró-caspase-3 expressão em duas linhas celulares. Não houve diferença significativa de Akt (A) fosforilação nas duas linhas celulares. fosforilação de ERK (B), CXCR4 (C) e 3-pró-caspase expressão (D) em células SKOV3 /DDP foram menores do que aqueles em células SKOV3, respectivamente. Pró-caspase-3 a expressão foi significativamente aumentada por tratamento doxiciclina em células SKOV3 /DDP, enquanto não se alterou em células SKOV3 (E). n = 3. *,

p Art 0,05, **,

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doxiciclina inibe xenotransplante tumoral

como uma tentativa para determinar se doxiciclina contribui para inibição do tumor in vivo, utilizou-se SKOV3.ip modelo de xenoenxerto em ratinhos nus (Balb /c-nu). Catorze dias após a injecção de células tumorais, a doxiciclina (injecção por via i.p.) foi administrado, em seguida, (3 mg /d /por ratinho) para os 7 dias seguintes. diâmetros do tumor, peso corporal e níveis de ratinhos no grupo de ascites de tumor e grupo tratado com doxiciclina foram analisados. Em comparação com os do grupo de tumor, o diâmetro do tumor e o volume de ascite foram diminuiu significativamente no grupo tratado com doxiciclina (Fig. 7B, C, F, G). O grau de agregação de células de tumor no grupo tratado com doxiciclina (Fig. 7E) foi menor do que no grupo do tumor (Fig. 7D). Além disso, o peso do corpo no grupo tratado com doxiciclina foi abordagem para que no grupo de controlo (Fig. 7H).

(a) a partir do aspecto exterior, o abdómen do grupo tumor foi obviamente abaulamento (b) do que o em um grupo de controlo (a) e a uma em tratados com doxiciclina grupo (c). A doxiciclina inibiram o crescimento de xenoenxerto de tumor (B, F) e o volume de ascite maligna (C, g) significativamente em ratinhos tratados com doxiciclina tumorais em comparação com os dos ratinhos de tumor. (D) coloração HE mostrou que o grau de agregação de células tumorais no grupo tratado com doxiciclina (E) foi muito menor do que no grupo do tumor. (H) o peso corporal no grupo do tumor foi significativamente menor do que as de qualquer dos grupos de controlo ou tratado com doxiciclina grupo. n = 6. **,

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Discussão

A cisplatina é um quimioterápico para câncer de ovário. Além dos efeitos secundários graves, a cisplatina-resistência é também um grande obstáculo. A combinação de alguns componentes inócuos com drogas quimioterápicas é uma nova estratégia para a quimioterapia do cancro emergente para melhorar ainda mais a eficácia e para minimizar os efeitos secundários. Doxiciclina é amplamente aceito como um antibiótico. Nas nossas experiências, foi demonstrado que a doxiciclina não só tem um efeito inibitório sobre o cancro do ovário, mas também pode aumentar dramaticamente a quimiossensibilidade a cisplatina.

No entanto, o mecanismo subjacente ainda não é clara. Alguns estudos relatam que o efeito antitumoral de doxiciclina está associada com diferentes níveis de p53 no carcinoma hepatocelular [18]. Outro estudo demonstra que a doxiciclina pode induzir apoptose em células pancreáticas e cancerígenas do cólon humano através de maneira dependente da caspase [19] – [20]. As nossas descobertas, pela primeira vez, mostraram que a doxiciclina inibe a secreção de SDF-1α em SKOV3, enquanto fenómeno não foi observado em células SKOV3 /DDP. Outras pesquisas mostraram que a doxiciclina inibe a expressão de CXCR4 em ambos os níveis de proteína mRNA e, sugerindo o seu efeito pode ser ao nível da transcrição. análise de Western-blot indicou também que a expressão CXCR4 em SKOV3 /DDP foi 20% menor do que em SKOV3. Estes resultados sugerem que o SDF-1α /CXCR4 eixo pode ter diferentes funções em efeitos de doxiciclina nas duas linhas celulares. Várias explicações podem contribuir para este fenómeno: 1) Após a ativação, CXCR4 pode mediar a metástase do tumor. As células tumorais que entram nos sistemas de sangue ou linfáticos vai migrar e aderir a áreas com alta expressão de SDF-1α. cancro da mama células seguem este padrão de metástase [21]. Aqui nós descrevemos que as células SKOV3 pode segredo SDF-1α e tem maior expressão de CXCR4. Além disso, SDF-1α promove a invasão de SKOV3 por nove vezes. Com base nestes dados, foi postulado SDF-1 /CXCR4 eixo desempenhou um papel crítico na metástase de células SKOV3, aumentando a capacidade de adesão de células cancerosas, mas SKOV3 /DDP não. 2) Alguns outros estudos indicam que os mecanismos epigenética envolvidos na regulação negativa do SDF-1α ou expressão de CXCR4 poderá ser necessário para a metástase do tumor. modificação típica de SDF-1α ou CXCR4, tais como a metilação do DNA está associada com a inactivação de supressores tumorais. Há evidências de que a metilação do promotor de SDF-1α no epitélio do cólon promove a metástase de tumores no cólon [22]. Além disso, no cancro do pâncreas, o promotor CXCR4 foi encontrado para ser regulada por metilação do DNA, resultando em níveis mais baixos de ARNm e de proteína CXCR4 [23].

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0.01.

doi:10.1371/journal.pone.0089841.s002

(TIF)

Acknowledgments

All