Abstract

Fundo

miR-630 foi relatado para ser um modulador de vários tipos de câncer, mas a mecanismo através do qual é ele influencia radiorresistência permanece desconhecida. Nosso objetivo foi identificar a função molecular de miR-630 e seu mecanismo de regulação no cancro colorectal (CRC) linhas celulares.

Metodologia

A superexpressão e perda de função analisa de miR-630 foram realizada em linhas celulares de CRC, medindo os níveis de crescimento e a apoptose após a radiação iónica (IR). Os genes alvo foram detectadas através de um ensaio de luciferase dupla e Western blot. ensaio cromatina imunoprecipitação foi realizada para identificar o fator de transcrição que regula miR-630, e um experimento de desmetilação também foi realizado.

Resultados

miR-630 expressão foi encontrado para ser positivamente correlacionada com a radiossensibilidade em linhas celulares de CRC (

p Art 0,05). Após o tratamento de IR, o miR-630 induziu a apoptose em células; No entanto, foi observado o oposto quando o miR-630 foi regulada negativamente (

P

0,05). BCL2L2 e TP53RK foram identificados como genes alvo de miR-630, e a função de miR-630 foi encontrada para depender destes dois genes (

P

0,05). Além disso, a evidência mostrou que o CREB regula o nível de miR-630, e desmetilação pode elevar miR-630 níveis (

p Art 0,05).

Conclusão

CREB -miR-630-BCL2L2 e TP53RK compreendem um romance cascata de sinalização que regula radiossensibilidade em linhas celulares de CRC através da indução de apoptose celular e morte

Citation:. Zhang Y, Yu J, Liu H, Ma W, Yan L, Wang J, et ai. (2015) Novel epigenética CREB-miR-630 de sinalização do Eixo Regula Radiosensibilidade no câncer colorretal. PLoS ONE 10 (8): e0133870. doi: 10.1371 /journal.pone.0133870

editor: Klaus Roemer, Universidade de Saarland Medical School, Alemanha |

Recebido: 25 de maio de 2015; Aceito: 03 de julho de 2015; Publicação: 11 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa principal do Programa de Ciência e Tecnologia de Cantão (nº 201.300.000.087), Fundo de Investigação do bem-estar do público na Indústria de Saúde do Nacional de Saúde e Comissão de Planejamento familiar da China (No.201402015 e nº 201502039), National Key Tecnologia R D Programa (No. 2013BAI05B05) e do Programa de Construção chave Clínica Disciplina

e

Competir interesses: Os autores declararam que nenhum. existem interesses conflitantes.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é um tipo relativamente comum de cancro com alta taxa de mortalidade em todo o mundo [1, 2]. Embora o tratamento pré-operatório com quimioterapia (CRT), em combinação com a cirurgia convencional melhora o controlo local do CRC e sobrevivência, apenas cerca de 70% dos pacientes respondem à TRC [3, 4]. Assim, a compreensão dos mecanismos envolvidos na radiação iónica (IR) da resistência de CRC é um passo importante na geração de terapias mais eficazes.

MicroRNAs são pequenos (18-25 nucleótidos) não codificante RNAs que pode suprimir a expressão de mRNA por ligação aos suas sequências complementares em regiões não traduzidas 3 ‘(UTRs) [5, 6]. Muitos estudos têm demonstrado que miARNs desempenham um papel importante em vários processos biológicos [7]. Alguns miARNs tais como o miR-135 e miR-200 ° C verificou-se que desempenham um papel essencial na radiorresistência [8, 9]. Um estudo anterior reportado miR-630 como um novo modulador de cisplatina induziu a morte de células de cancro de pulmão de células não pequenas, [10]. análise de microarray em uma pesquisa clínica seleccionado um conjunto de 13 miRNAs, incluindo miR- 630, que podem ser preditores específicos de resultado CRT em pacientes com câncer retal [11]. No entanto, o mecanismo pelo qual o miR-630 influências radiorresistência não tem sido elucidado até à data. No presente estudo, buscou-se identificar a função de miR-630 em CRC radiossensibilidade e seu potencial regulador.

Materiais e Métodos

cultura celular

Human células de câncer colorretal linhas LS174T, SW480, HCT116, SW837, HR8348, e HT29 foram adquiridos a partir do celular Bank of Type Culture Collection (Shanghai City, China). Todas estas linhas celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, Utah, EUA) em CO2 a 37 ° C incubadora humidificada sob 5%.

extracção miARN e quantitativa real PCR em tempo (qRT-PCR)

reagente TRIzol (Invitrogen, Foster City, EUA) foi utilizado para isolar o ARN total a partir de células cultivadas. qRT-PCR foi realizada num sistema 7500 (Applied Biosystems, Foster City, EUA), utilizando um tudo-em-um miARN Transcrição Reversa Kit (GeneCopoeia, Inc.) e SYBR Green humano miARN Assay Kit (GeneCopoeia, Inc.).

irradiação celular

a irradiação foi realizada em um irradiador médica Siemens Meratron M2 a uma dose de 3 Gy à temperatura ambiente.

a proliferação celular ensaio

em 96 Bem placas, 1 × 10

3 células foram semeadas e, em seguida, incubadas durante 4 d. A contagem das células Kit-8 (CCK-8) de ensaio (Keygene Biotech) foi realizada para medir a proliferação celular. Briefly10 uL de CCK-8 solução foi adicionada a cada poço, durante 2 horas. A absorvância de cada poço foi lida utilizando um leitor de microplacas fixado em 450 nm.

Caspase 3/6 Ensaio de Actividade

Caspase 3/6 actividade foi medida utilizando caspase 3 e caspase 6 kits de ensaio ( Abcam, EUA). tampão de lise celular foi adicionado a um volume de 50 uL para ressuspender 1 × 10

6 células e incuba-se as células em gelo durante 10 min. Em seguida, o substrato DEVD-p-NA (ou VEID-p-NA) e foi adicionado tampão de reacção contendo DTT e a mistura foi incubada durante 2 horas a 37 ° C. Subsequentemente, as amostras foram lidas a 450 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação.

Ensaio de Apoptose

As células foram recolhidas 24 horas após a radiação, com ou sem 3 Gy IR. As células foram coradas com anexina V-FITC (Keygene Biotech) e PI (Keygene Biotech). A apoptose foi realizada por citometria de fluxo (BD LSRFortessa)

Dual-luciferase de ensaio e vector construção

TargetScan (https://www.targetscan.org) e Miranda (http: //www. .microRNA.org) foram utilizados para prever os alvos potenciais de miR-630. O local de ligação BCL2L2 (NM_001199839) foi previsto para ser localizado na posição 995-1002 enquanto TP53RK (NM_033550.3) foi previsto para ser localizado na posição 455-462 a partir do local de início da transcrição. Um segmento longo BCL2L2 TP53RK e 200 pb foram sintetizados com qualquer região semente mutante ou de tipo selvagem e clonado no vector psiCHECK-2 (Applied Biosystems, EUA). Cinco nucleótidos na região de semente foram mutados para obter BCL2L2 mutante e sequências TP53RK 3′-UTR. Todas as linhas celulares foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA). As células (1 x 10

5 células /poço) foram transfectadas transientemente com 20 nmol /L de miR-630 imita ou controlo. Em seguida, foram realizadas co-transfecção com BCL2L2 e TP53RK-expressando vector. As células foram colhidas 48 horas após a transfecção. O Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, EUA) foi utilizado para detectar as actividades da luciferase

Os fatores de transcrição (TFS), que regulamenta miR-630 foram preditos usando Consite (http:. //asp.ii.uib .no: 8090 /cgi-bin /Consite /consite), TRANSFAC (https://www.gene-regulation.com/pub/databases.html) e Diana (http: //diana.imis.athena-innovation. gr /DianaTools /index.php). As sequências do segmento de 1000 pb de 5′-UTR do miR-630 com a região do mutante ou de tipo selvagem sementes foram sintetizados e clonado no vector pGL3-básica (Applied Biosystems, EUA). Cinco nucleótidos na região de semente foram mutados para obter a sequência mutante. resposta cAMP de ligação ao elemento (CREB) sequência de codificação de proteína foi clonado no vector pcDNA3.1 (Applied Biosystems, EUA). As células (1 x 10

5 células /poço) transfectadas transientemente com o mutante ou de tipo selvagem 5′-UTR do miR-630 foram semeadas. Em seguida, realizou-se a co-transfecção com um vector expressando de CREB. Após 48 horas, as células foram colhidas e os ensaios de actividade de luciferase foram realizados.

Western blot

CC Ensaio de Bradford (Bio-Rad, EUA) foi utilizado para medir a concentração de proteína de lisados. Subsequentemente, 20-40 ug de proteína foi resolvido num gel de poliacrilamida Tris-bis 12%, electrotransferidas para membranas de nitrocelulose (GE Healthcare, Piscataway, EUA) e bloqueadas com 5% de leite desnatado-. manchas de proteína foram imunocoradas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C e durante 1 hora com anticorpos secundários, à temperatura ambiente. Amersham ECL ocidentais reagentes de detecção blotting (GE Healthcare) foram usados ​​para visualizar o sinal de proteína.

O tratamento de células com 5-aza-2′-desoxicitidina

células HCT116 foram cultivadas em 6 poços placas, no dia 0, em seguida, 5-aza-CdR (desoxicitidina 5-aza-, Sigma-Aldrich), o qual pode inibir a metiltransferase de ADN, foi adicionado às células do dia 1 ao dia 3. as células foram então colhidas e foi adicionado etanol corrigir células. Expressão de miR-630 foi analisada por qRT-PCR.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio

ensaio chip foi realizada na linha de células SW480 CRC. foi utilizado anticorpo anti-CREB (Abcam, EUA) com o Kit EpiSeeker chip (Abcam, EUA) tal como recomendado pelo fabricante.

A análise estatística

Todos os dados são expressos como média ± desvio padrão (SD), com cada experiência repetida pelo menos três vezes. A taxa de inibição foi obtida seguindo o cálculo: (valor de absorção de IR nenhum células-absorção valor de células IR) /valor de absorção das células IR nenhum. As diferenças entre os dois grupos foram avaliadas através do teste t de cauda 2, de Student emparelhado. SPSS for Windows 20.0 foi utilizado para realizar todas as análises estatísticas. A significância estatística foi inferida se

p

. 0,05

Resultados

Os níveis de expressão de miR-630 foram reduzidos em células CRC após a irradiação

A inicial níveis de miR- 630 e capacidades de proliferação de linhas celulares de CRC série foram determinados para verificar se miR-630 pode afetar funcionalmente radiossensibilidade iônica. Observou-se um efeito inibidor evidente sobre a proliferação celular após radiação iónica em SW837, LS174T, e células HR8348, que mostrou muito elevada expressão endógena de miR-630; Em contraste, as taxas de inibição fracas foram observadas em HT29, SW480 e células HCT116, que exibiram baixa expressão de miR-630 (Figura 1A e 1B). correlação positiva entre miR-630 e radiossensibilidade foi detectado em todas as seis linhas celulares testadas.

(A e B) endógena miR-630 expressão e taxa de inibição induzida pelo IR de linhas celulares de CRC série (C) miR- diminuição de 630 nível após a radiação em comparação com o seu nível inicial. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± desvio padrão (SD). Asterisco indica mudanças estatisticamente significativas: * (P 0,05), ** (P 0,01)

As linhas celulares SW837 e LS174T, que apresentaram os maiores níveis de expressão, foram selecionados para irradiação. . O tratamento foi repetido três vezes radiação, com cada tratamento que consiste de 3 Gy IR. As células viáveis ​​foram subcultivadas durante 5 d a seguir à irradiação, após o que o nível de expressão de miR-630 foi examinado (Fig 1C). Uma diminuição significativa nos níveis de miR-630 foi encontrado após a irradiação em ambas as linhas celulares em comparação com os seus níveis iniciais.

A expressão ectópica de miR-630 citotoxicidade induzida por radiação iónica aumentada em linhas celulares de CRC

para investigar o papel de miR-630 na modulação CRC radiossensibilidade, miR-630 foi sobre-expresso em células HT29 e SW480 usando o miR-630 imita. Subsequentemente, as células de miR-630 transfectadas foram irradiadas com 3 Gy IR e submetido a ensaio CCK-8, juntamente com os seus homólogos de controlo. A transfecção de miR-630 conduziu a um aumento significativo na inibição da proliferação de células após exposição IV em comparação com os grupos de controlo (Fig 2A) em SW480 e células HT29. Caspase 3/6 actividades de células de miR-630 transfectadas e células de controlo após 24 h com ou sem 3 Gy de IR também foram medidos.

(A) o miR-630 aumentou significativamente a taxa de inibição induzida por IR (B e C) miR-630 aumentou fortemente caspase 3 e caspase 6 atividades após a exposição IR (D e e) miR-630 aumentou significativamente a taxa de apoptose após exposição IR. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± desvio padrão (SD). Asterisco indica mudanças estatisticamente significativas:. * (P 0,05), ** (P 0,01)

A caspase 3/6 actividades foram fortemente aumentado em miR-630 após a exposição IR em HT29 e células SW480 em comparação com células NC (Fig 2B e 2C), implicando um papel significativo para miR-630 na activação de apoptose mediado pela IR. Além disso, o ensaio de apoptose ilustrado que o miR-630 pode levar a um aumento significativamente a taxa de apoptose nas duas células após a irradiação (Figura 2D e 2E). No geral, estes resultados sugerem que o miR-630 sensibiliza as células de CRC para IR por intensificar a apoptose induzida por IR e inibir a sobrevivência das células após IR.

A inibição de miR-630 conduziu a uma diminuição da sensibilidade IV em linhas de células de CRC

Um ensaio de perda de função foi realizada em células SW837, utilizando inibidores de miR-630. taxa de proliferação foi significativamente aumentada em células SW837 transfectadas com o miR-630 inibidor, quando comparada com o controlo SW837 células tratadas com IR (Fig 3A). A inibição de miR-630 também diminuiu significativamente a caspase 3/6 actividades em linhas celulares SW837 após exposição IR (Fig 3B e 3C). Estes resultados indicaram que a perda de miR-630 função reduz radiossensibilidade das linhas celulares de CRC.

(A) Inibição de miR-630 diminuiu significativamente a taxa de inibição induzida por IR (B e C) Inibição de miR-630 diminuiu fortemente caspase 3 e caspase 6 actividades seguintes exposição IR. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± desvio padrão (SD). Asterisco indica mudanças estatisticamente significativas:. * (P 0,05), ** (P 0,01)

TP53RK e BCL2L2 são alvos diretos de miR-630

Para explorar os mecanismos moleculares pelos quais miR-630 aumenta a sensibilidade celular à IR, potenciais alvos de miR-630 foram pesquisados ​​nas bases de dados de bioinformática através do TARGET-Scan e miranda. No 3′-UTR de TP53RK e BCL2L2, sítios de ligação potenciais do miR-630 foram previstos (Figura 4A). Para confirmar se o miR-630 tem como alvo directamente o 3′-UTR destes genes, nós construídos plasmídeos repórter luciferase dupla portador de um fragmento de 200 pb do mutante ou de tipo selvagem sequência 3′-UTR, que continha o miR-630 previsto local de reconhecimento. A-Luciferase Reporter Assay System dupla foi então adoptada para determinar se o miR-630 regula a expressão dos candidatos previstos em SW480 e SW837 células. intensidade de fluorescência normalizada do repórter foi significativamente menor em células cancerosas co-transfectadas com o miR-630 e imita de tipo selvagem 3′-UTR em comparação com o grupo de controlo. Em contraste, não foi detectada nenhuma diferença significativa entre o grupo controle e as células co-transfectadas com miR-630 imita e mutante 3′-UTR (Fig 4B e 4C).

(A) Previsto locais de miR vinculativo -630 em 3′-UTR de TP53RK e BCL2L2 (B e C) a fluorescência foi significativamente reduzida nos miR-630 e imita de tipo selvagem grupo transfectadas com o plasmídeo repórter de luciferase dupla, ao mesmo tempo que não mostrou nenhuma mudança significativa na miR- 630 imita e os níveis de expressão de luciferase dupla grupo repórter plasmídeo transfectadas (D) TP53RK e proteínas mutantes BCL2L2 diminuiu em células de miR-630 transfectadas. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± desvio padrão (SD). Asterisco indica mudanças estatisticamente significativas: * (P 0,05), ** (P 0,01)

Os resultados acima também foram apoiados por análises de Western blot.. Análise da expressão de proteínas revelou uma diminuição acentuada na TP53RK e BCL2L2 HT29 de miR-630-transfectadas e células SW480, quando comparada com as células de controlo negativo (Fig 4D). No geral, estes dados demonstraram que o miR-630 pode ligar-se directamente para a 3′-UTR de TP53RK e BCL2L2 para reprimir a expressão do gene.

Se o efeito de miR-630 é específico, o efeito de sobre-expressão de miR-630 deve ser suprimida por co-expressão de proteínas e TP53RK BCL2L2. Os plasmídeos pcDNA3.1 /TP53RK e pcDNA3.1 /BCL2L2, que pode elevar os níveis de brevemente TP53RK e BCL2L2, respectivamente, foram co-transfectadas com o miR-630 imita em células HT29 e SW480. Em seguida, caspase3 /6 ensaios de actividade foram realizados. CCK-8 ensaio mostrou que a co-expressão da proteína ou TP53RK BCL2L2 com miR-630 imita diminuiu significativamente a taxa de inibição após RI em ambas as linhas celulares (Fig 5A). A mudança caspase3 /6 vezes pós-irradiação em miR-630 transfectadas SW480 e células LS174T diminuiu significativamente após transfecção de pcDNA3.1 /TP53RK e pcDNA3.1 /BCL2L2 (Fig 5B e 5C).

(A ) TP53RK ou BCL2L2 proteína causou uma taxa de inibição significativamente diminuída induzida por IR em miR-630 linhas celulares transfectadas. (B e C) TP53RK ou BCL2L2 proteína diminuiu a dobra da caspase 3 e caspase 6 atividades após a exposição IR no miR-630 linhas de células transfectadas. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± desvio padrão (SD). Asterisco indica mudanças estatisticamente significativas: * (P 0,05), ** (P 0,01)

estatuto celular metilação e o fator de transcrição CREB regular o miR-630 expressão

metilação de ADN pode regular a expressão de miARN [11, 12]. Neste estudo, o miR-630 de expressão foi significativamente regulada positivamente por tratamento com 5-aza-CdR em HT29 e células SW480 (Fig 6A). Este resultado indica que a metilação do ADN está estreitamente correlacionado com alterações na expressão de miR-630 durante a progressão de CRC.

(a) 5-aza-CdR significativamente regulada positivamente o miR-630 de expressão (B) CREB foi previsto para se ligar ao 5′-UTR de miR-630 ARIH1 gene host (C) CREB na região induzida atividade luciferase promotor ARIH1 e mutação de sítios de ligação CREB previstos inverteu seu efeito (D) ChIP confirmou a ligação de CREB ao promotor ARIH1. As barras de erro representam a média de três determinações separadas ± desvio padrão (SD). O asterisco indica alterações estatisticamente significativas:. * (P 0,05), ** (P 0,01)

ARIH1, um gene que codifica a proteína que contém o gene de miR-630 no seu exão, tem uma grande ilha CpG. Isto sugere que a expressão de miR-630 depende da regulação do gene ARIH1. Três programas de software diferentes foram usados ​​para prever os TFs que regulam miR-630. Os nossos dados sugerem que o CREB podem ligar-se a 5′-UTR do ARIH1 (Fig 6B). Para determinar se CREB pode modular o nível de miR-630, que estudaram o efeito de CREB em sequência mutante e promotor ARIH1 de tipo selvagem contendo sítios de ligação a CREB preditos. Em células SW480, verificou-se que a actividade da luciferase induzida por CREB foi diminuída no grupo em que a região promotora ARIH1 foi mutada (Figura 6C). Além disso, os ensaios ChIP confirmou que CREB poderia ligar diretamente para o promotor ARIH1 (Fig 6D).

Discussão

Apesar das evidências implicando miR-630 em câncer, poucos estudos têm explorado a sua função no detalhe. miR-630 foi identificado para induzir a morte celular em câncer de pâncreas e para regular HER-alvo de sensibilidade às drogas em células de câncer de mama HER2-superexpressão embora IGF-1R [12, 13]. miR-630 inibe o crescimento de células que Cdc7-quinase em células de cancro do pulmão humano [14]. Além disso, a paragem do crescimento de cancro da próstata por tratamento com gefitinib e luteolina é parcialmente induzida por miR-630 [15]. No entanto, o padrão de expressão e papel de miR-630 em radiossensibilidade de CRC não tenham sido ilustradas a data.

No presente estudo, nós investigamos o mecanismo pelo qual o miR-630 regula a radiossensibilidade das linhas celulares de CRC. Em primeiro lugar, foram detectados expressão de miR-630 e radiossensibilidade de seis linhas celulares de CRC. Os resultados mostraram uma correlação positiva entre a expressão de miR-630 e radiossensibilidade. Além disso, o nível de miR-630 verificou-se ser significativamente diminuída após repetidas IV, revelando que o miR-630 pode desempenhar um papel essencial na regulação da radiossensibilidade.

Em seguida, a possível função do miR-630 em resposta RI de linhas celulares de CRC foi explorada. Os resultados mostraram que a superexpressão de miR-630 em células HT29 e SW480 aumento da apoptose de células de cancro e morte

In vitro

. Depleção de miR-630 em células SW837 teve o efeito oposto. Assim, estes resultados fornecem evidências de que o miR-630 promove a radiossensibilidade do CRC.

O mecanismo molecular pelo qual miR-630 modula CRC radiossensibilidade foi investigado. miR-630 foi encontrada para regular negativamente a expressão de BCL2L2 e TP53RK diretamente pela segmentação seus 3′-UTRs. BCL2L2, também chamado de Bcl-w, pertence à família de proteínas Bcl-2. A sobre-expressão desta proteína foi observado em vários cancros, incluindo CRC [16, 17]. BCL2L2 também promove a sobrevivência de células e reduz a apoptose sob estresse por apoptose [18, 19]. TP53RK é uma quinase que restringe a apoptose após o estresse mitótico [20]. Estes resultados indicam que o miR-630 modula radiossensibilidade através de uma cascata de sinalização que envolve BCL2L2 e TP53RK.

Recentemente, o regulado E2F1-ribonuclease Drosha foi encontrado para promover o miR-630 biossíntese em células cancerosas expostas a cisplatina [21] . No presente estudo, os resultados do ensaio da luciferase indicaram que o CREB podem ligar-se a 5′-UTR do ARIH1, que é o gene de acolhimento de miR-630, e eliminação dos sítios de ligação de CREB pode revogar esta função. Além disso, o ensaio de ChIP demonstrado que CREB podem ligar-se especificamente com a região promotora de miR-630, sugerindo que o CREB pode ser o TF responsável por iniciar o miR-630 de expressão. CREB é uma proteína que se liga à sequência de ADN do elemento de resposta cAMP. CREB medeia a transcrição de genes-alvo através da activação do sinal cAMP [22]. Além disso, CREB é necessário para a proliferação, o crescimento, a sobrevivência e diferenciação de muitos tipos de células [23]. A investigação recente demonstrou que CREB-Ser133 fosforilação resulta na supressão de genes anti-apoptóticos, induzindo assim a morte das células [24, 25]. Neste estudo, a metilação do DNA de baixo também aumenta significativamente miR-630 expressão em linhas celulares de CRC.

Em resumo, nosso estudo demonstra uma via de sinalização romance da CREB para BCL2L2 e TP53RK. Os resultados deste estudo fornecem importantes insights sobre os mecanismos pelos quais TFs e miRNAs modulam radiorresistência célula cancerosa. Nossos resultados também destacam o potencial terapêutico destas moléculas no tratamento CRC.

Informações de Apoio

S1 Data. conjunto de dados em bruto está no “Data.zip”, os dados originais desta experiência pode ser obtido a partir dele

doi:. 10.1371 /journal.pone.0133870.s001

(ZIP)

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Li Liang para a revisão do manuscrito.