Abstract

próstata células epiteliais de ambos os tecidos normais e cancerosas, cultivadas em três dimensões (3D) cultura como esferóides, representam promissores

in vitro

modelos para o estudo de padrões normais e cancerosas relevante de diferenciação epitelial. Nós desenvolvemos o painel mais completo de modelos de cultura de células de próstata miniaturizados em 3D até à data (n = 29), incluindo muitas linhas celulares de cancro não transformada e, mais atualmente disponível clássico da próstata (AEP). O objetivo deste estudo foi analisar as propriedades morfogenéticas de modelos PRCA em 3D, para comparar fenótipos, expressão gênica e metabolismo entre culturas 2D e 3D, e avaliar a sua relevância para a descoberta de medicamentos pré-clínica, modelagem de doenças e pesquisa básica. esferóides redondos primárias e células epiteliais não transformadas próstata, mas também várias linhas de PRCA, formadas bem diferenciados. Estes mostraram contatos célula-célula fortes, polarização epitelial, um lúmen oco e foram cobertos por uma lâmina basal completo (BL). A maioria das linhas AEP, no entanto, formado esferóides grandes, pouco diferenciados, ou estruturas que invadem de forma agressiva. Em células PC-3M PC-3 e, esferóides formadas, as quais foram, em seguida, espontaneamente transformados em células altamente invasivos bem diferenciado. Estas linhas celulares podem ter previamente sofrido uma epitelial-mesenquimal-a transição (EMT), que é temporariamente suprimida em favor de maturação epitelial por meio de sinais a partir da matriz extracelular (ECM). A indução de lipídios e metabolismo de esteróides, reprogramação epigenética, e remodelação ECM representa uma adaptação geral à cultura 3D, independentemente da transformação e do fenótipo. Em contraste, da PI3-quinase, AKT, STAT /interferão e as vias de sinalização da integrina foram particularmente activada nas células invasoras. inibidores de moléculas pequenas específicas dirigidas contra da PI3-quinase bloqueou o crescimento invasivo de células de forma mais eficaz em 3D do que em cultura em monocamada 2D, ou o crescimento de células normais. O nosso painel de modelos celulares, abrangendo um amplo espectro de plasticidade fenotípica, apoia a investigação de diferentes modos de migração de células tumorais e morfologias, e será útil para testes preditivos de anti-câncer e compostos anti-metastáticos.

citação: Härmä V, J Virtanen, Mäkelä R, Happonen A, JP Mpindi, Knuuttila M, et al. (2010) Um amplo painel de modelos tridimensionais para o estudo do crescimento do cancro da próstata, Invasion e Respostas de drogas. PLoS ONE 5 (5): e10431. doi: 10.1371 /journal.pone.0010431

editor: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 24 Janeiro, 2010; Aceito: 31 de março de 2010; Publicado em: 03 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Härmä et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Academia finlandesa para MN (No. 111597). financiamento adicional para OK e JV foi fornecido pelo FP6 e FP7 projectos integrados PRIMA e Epitron da Comissão Europeia. As agências de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

bidimensional culturas de células (2D) monocamada representam modelos altamente redutoras de células epiteliais e cancros epiteliais, devido à perda de matriz fisiológico extracelular (ECM) em superfícies de plástico artificial, e concentrações séricas elevadas. Consequentemente, as células perdem propriedades relevantes, tais como a diferenciação, a polarização, a comunicação célula-célula e os contactos da matriz extracelular, enquanto a cicatrização de feridas, processos inflamatórios, e hiper-proliferação são promovidos artificialmente. Na cultura em monocamada de cancro da próstata (AEP) linhas, a homeostase de células-tronco tumorais indiferenciadas por meio basal, transit-amplificação e, células luminais sensível à hormona diferenciadas terminalmente depende das condições de cultura de células, o cálcio e a concentração sérica de [1], [2] , e apenas fracamente representa a biologia de células tumorais in vivo. A falta de uma lâmina basal relevante (BL), a deposição de ECM defeituoso, e estromal ou componentes em falta mioepiteliais [3] contribuir ainda mais para a natureza artificial. Como resultado, os inibidores de moléculas pequenas mais eficazes em culturas em monocamada são fármacos quimioterapêuticos que têm como alvo a proliferação e a mitose. Este desequilíbrio contribui para o pobre valor preditivo do eficácias compostos entre

in vitro Comprar e

in vivo

experimentos. ação da droga que se relaciona com a interação célula-célula, maturação epitelial para mesenquimal (EMT) e células-tronco cancerosas (CSC) é susceptível de passar despercebido. Ambos arquitetura 3D e no ECM exercem fortes efeitos sobre a eficácia [4] de drogas. células cancerosas epiteliais glandulares adaptar rapidamente a diferentes microambientes e pode dinamicamente alternar entre caminhos alternativos que regulam a proliferação, diferenciação e sobrevivência.

O desenvolvimento de resistência aos medicamentos ou falta de resposta a drogas quimioterápicas também requer modelos de cultura de células apropriadas. A resistência aos medicamentos é muitas vezes atribuída à hipótese de células-tronco do câncer (CSC): cancro drogas anti-mitóticas poupar a proliferação lenta, as células de haste ou progenitoras-regeneração do tumor [5] – [7], o que, eventualmente, voltar a constituir a massa tumoral. Isto pode ser concomitante com EMT [7] – [10] e aumento do potencial metastático [8]. A busca por drogas anti-câncer tem, assim, entrou numa nova fase em que os pesquisadores cada vez mais utilizam sistemas modelo organotípicas para explorar mais diretamente alvos de drogas no Organóides multicelulares, muitas vezes enriquecido para células-tronco [11]. Apropriada

in vitro

modelos experimentais adequados para a análise de CSC homeostase, EMT, invasão e metástase, estão se tornando cada vez mais relevante para a descoberta de drogas câncer. Estes também deve ser rentável e proporcionar rendimento suficiente para a alta triagem conteúdo.

A cultura do epitélio glandular (cancro) células em ECM purificados, como o colágeno, hidrogéis ou Matrigel, foi criado há mais de duas décadas atrás [12 ]. Matrigel representa, uma membrana basal reconstituída ricos em laminina, que suporta os processos tais como a polaridade da célula, célula-células e a interacção célula-matriz, e re-expressão de marcadores de diferenciação, mesmo em linhas transformadas [13]. células mamárias e epiteliais da próstata formar esferóides, referidos como mammospheres [14] ou prostaspheres [15], respectivamente. células epiteliais da próstata normais diferenciar em esferóides ocos bem-polarizados, uma característica marcante de células epiteliais funcionais, glandulares. O mesmo microambiente também suporta a migração de células, e a formação de ramificação de ácinos característica [16], [17]. Em contraste, as células tumorais apresentam normalmente um programa de diferenciação defeituoso, e formar esferóides atípicas com arquitectura desorganizado, tal como demonstrado com maior destaque para os cancros da mama [18] – [20]. padrões de esferóides de expressão gênica foi demonstrada uma correlação com os fenótipos característicos formados em culturas 3D [19], [20] e diferenciação global e potencial agressivo dos cânceres [21], [22]. Semelhante a células epiteliais normais, células de AEP também podem invadir activamente o Matrigel circundante, apesar do seu modo de migração é diferente a partir da folha ou tubo de migração dos padrões normais, colectivos observados na ramificação de células normais. O fenótipo da invasão cancro depende da composição e densidade do ECM, e pode variar de blebbing amebóides, mesenquimal motilidade de fibroblastos-like e streaming multicelular ou migração em cadeia [23], [24]. Naturalmente, o potencial invasivo também depende do fundo genético das células de AEP e a sua capacidade (normalmente comprometida) para engatar nos contactos célula-célula epiteliais rigorosas. Mamária e outras células cancerosas epiteliais forma cilíndrica, células fusiformes com o potencial de contrair e alongar, que sustenta a migração através da malha ECM circundante. Muito menos se sabe sobre AEP. Invasão é assistida por processos proteolíticos e proteases, tais como catepsinas [25], as metaloproteinases de matriz (MMPs [24]), factores solúveis secretados pelos fibroblastos ou a presença de fibroblastos-se [26], [27], e outros factores, tais como a fibronectina e oxidases lisil [26]. A este respeito, os modelos 3D de invasão de células de tumor [28] representam dinâmica celular e arquitectura de tumores muito melhores do que as culturas em monocamada em que as células em 2D espalhados e deslizar ao longo da superfície de plástico. O potencial de se submeter a um EMT e adquirir modos de migração mesenquimais é outro parâmetro postulou a contribuir para o aleitamento e PRCA invasão e motilidade [29].

Além disso, não está claro se esferóides AEP, particularmente quando cultivada em lrECM , mostram enriquecimento de populações CSC (que é muitas vezes associado a um EMT), ou desenvolver resistência contra agentes quimioterápicos e radiação ionizante [30], [31]. Pelo menos, seria de esperar que o envolvimento de CSC ou EMT para exibir uma dinâmica muito diferentes na diferenciação de culturas em 3D LrECM, em comparação com prostaspheres flutuantes e condições monocamada 2D [32]. Última não menos importante, modelos de cultura celular para a invasão das células tumorais estão atualmente restrita a poucos amplamente utilizados, ensaios potencialmente artificiais (transpo� ensaios de invasão; ensaios de migração ferida-zero). Desde a invasão é fundamentalmente diferente em condições 3D, quaisquer modelos de invasão 3D representativos representam uma verdadeira novidade [26, 28 e 33].

Nós relatamos aqui o desenvolvimento e caracterização morfológica de sistemas modelo de cultura celular 3D miniaturizados, utilizando um painel de 29 linhas celulares de próstata. A selecção das linhas mais representativas foram, então, caracterizados por análise de todo o genoma transcriptoma e biologia de sistemas para identificar vias principais, moléculas de sinalização, redes de genes e drogas metas putativos críticos para o crescimento e invasão das células AEP malignas. Além disso, ferramentas de análise de imagem de bioinformática para quantificar características fenotípicas dinâmicos, como estruturas invasivas, forma esferóide ou respostas de drogas têm sido desenvolvidos.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e monocamada culturas

as linhas celulares foram adquiridos da ATCC ou solicitados os laboratórios de medicamentos originais (Tabela S1). células epiteliais normais e seus derivados (PrEC, EP156T, RWPE-1, 2-RWPE, RWPE-2 /W99, WPE1-NB14, PWR-1E, PZ-HPV-7 e CA-HPV-10) foram cultivadas em queratinócitos sérica Free Medium (KSFM, Gibco), suplementado com 12,5 mg /l de extracto de pituitária bovina e 1,25 g /l de EGF. Para culturas em 3D, foram adicionados 2% de soro fetal bovino (FBS, Gibco). A maioria das linhas de AEP foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), suplementado com 10% de FBS. As células MDA-PCA-2b e NCI-H660 foram cultivadas em meio F12 de Ham (Gibco) com 20% de FBS, 25 ng /ml choleratoxin, 10 ng /mL de EGF, fosfoetanolamina 5 uM, 0,1 ng /ml de hidrocortisona, 45 nM de ácido selénico e 5 ug /ml de insulina (todos de Sigma). Todas as células foram propagadas a 37 ° C em condições de cultura de células padrão (5% de CO2, 95% de humidade). Identidade de linhas celulares foi confirmada por arrayCGH (hibridização genômica comparativa) sobre Agilent 244 k matrizes do genoma humano, depois de 10-15 passagens de células foram interrompidas.

culturas Miniaturized 3D.

As células foram incorporadas entre duas camadas de Matrigel na angiogénese não revestidos u-lâminas (Ibidi GmbH, Alemanha): poços de fundo foram cheios com 10 ul de meio de Matrigel /cultura (01:01; 50%) e é polimerizada a 37 ° C durante 30 min. As células foram então semeadas a 20.000 células /ml de densidade (~1000 células /poço). Após a fixação (1-2 horas a 37 ° C), as células foram cobertas com uma segunda camada de meio de Matrigel /cultura (01:04, 25%), deixou-se polimerizar durante a noite a 37 ° C. meio de cultura celular foi trocado a cada segundo dia.

culturas a granel 3D para a extração de RNA.

Prostaspheres foram cultivadas em Millicell pendurado cultura de células insere com 1,0 mm membranas transparentes de PET (Millipore) em 6 poços placas (Costar). As membranas foram pré-revestidos com Matrigel /meio (01:01) e incubado a 37 ° C durante 1 h, para impedir a fixação à membrana. A suspensão de células foi misturado com 1:04 de Matrigel, transferida para o poço revestido, e polimerizados durante a noite a 37 ° C. As células foram alimentadas a cada dois dias por meio fresco por baixo.

fixação celular, imunofluorescência e de imagem.

culturas Miniaturized 3D foram fixados dentro de micropoços, com paraformaldeído a 4%, suplementado com 0,8% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), EGTA 5 mM e MgCl 1 mM de

2 durante 15-20 minutos à temperatura ambiente. culturas fixadas foram lavadas 3 vezes com PBS e bloqueadas durante 1 h com soro de cavalo a 20%. As culturas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários (listados na Tabela S2), lavadas com PBS, e incubou-se à temperatura ambiente durante 4 h com anticorpos secundários e corante nuclear Hoechst (1:5000).

3D estruturas foram coradas com corante de células vivas de calceína AM (Invitrogen). imagens tridimensionais confocais foram tomadas usando Zeiss Axiovert 200 M e um disco rotativo unidade confocal Yokogawa CSU22 e um plano Zeiss-Neofluar 5 × objectivo. Z-stacks foram adquiridos com um passo de tamanho de 19 mm. projeções de intensidade foram criados por Slidebook 4.2.0.7 e NIH ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/), ainda analisados ​​com software VTT Acca (sensibilidade 10; limiar de 5, estruturas menos de 500 pixels na área /tamanho filtrada Fora). Os diagramas de caixa foram visualizados com R. 20x de contraste de fase imagens de lapso de tempo foram adquiridos com Incucyte (instrumentos de Essen), pré-processados ​​com ImageJ e analisados ​​com VTT Acca (sensibilidade 30; limiar de 5, estruturas menos de 1000 pixels na área filtrados) .

extracção de ARN e micromatrizes.

culturas a granel 3D foram lavadas com PBS arrefecido em gelo, as membranas excisadas com um bisturi, e transferidos esferóides em placas de 6 poços. Os géis foram misturados vigorosamente com 9 ml de EDTA 5 mM em PBS, transferidas para 15 mL de tubos Falcon e incubou-se num agitador de mesa durante 45 minutos para separar o Matrigel. Prostaspheres foram sedimentadas por centrifugação e lisadas com tampão de RLT (Qiagen). Células propagadas em monocamada foram lisadas a 90% de confluência, directamente a partir de placas de cultura de células de 10 cm utilizando tampão RLT. O ARN total (de repetições biológica) foi extraída com RNeasy Mini Kit (Qiagen), de acordo com o protocolo do fabricante. 300 RNA ng foi amplificado com kit Illumina TotalPrep RNA amplificação da Ambion. IVT reacção foi realizada durante a noite (-16 horas), para se obter cRNA biotinilado suficiente. As concentrações de RNA e de ARNc foram medidos com um NanoDrop ND-1000, a qualidade geral foi monitorizada com a estação de electroforese Experion da BioRad. 750 cRNA ng foram hibridizados em da Illumina Sentrix HumanRef-8 v3 BeadChips, a 58 ° C durante a noite. Hibridizada cRNA foi detectado com 1 mg /ml Cyanine3-estreptavidina (GE Healthcare Biosciences), e matrizes digitalizado com Illumina BeadArray Reader. Os dados foram qualidade verificada e extraído usando software Illumina GenomeStudio, sem normalização ou subtração de fundo.

análise de dados de microarrays.

dados de microarranjos em bruto foram quantil-normalizada, usando o pacote R bioconductor “beadarray”. dados normalizados foram ainda processados ​​utilizando um filtro de variância e intensidade. A análise estatística da expressão gênica diferencial foi realizada utilizando os pacotes R /Bioconductor limma e lumi. O limiar para a expressão diferencial foi Q 0,05 após uma Benjamini-Hochberg correcção múltiplos testes. dados de expressão gênica normalizados Illumina de todo o painel de experimentos foram submetidos a GEO (Gene expressão Omnibus) como GSE19426 estudo

Os dados foram então usadas em dois modos diferentes:. para avaliar as mudanças relativas de expressão gênica entre 2D e experiências em 3D, ou diferentes pontos de tempo em cultura 3D, os valores médios normalizados em 3D foram subtraídos valores médios de repetições em cultura em monocamada 2D e rácios calculados. Log (2) relações 2D /3D transformadas foram então utilizados para o agrupamento e geração de mapa de calor (Cluster 2.11 e TreeView 1,60, Stanford University), e análise de ontologia gênica (GO; DAVID, https://david.abcc.ncifcrf.gov/) . K-Means agrupamento foi utilizado para desenhar mapas térmicos representativos com base em dados rácio 2D /3D, gerando 12 nós (100 iterações). O pacote Gene Set Analysis (GSA) em R foi utilizado para definir categorias de genes significativamente enriquecidos, aqui as estatísticas “Maxmean” foi usado para calcular a pontuação de enriquecimento, e valores de p permutação base foram derivados a partir de 1000 inicialização replica. A correção de taxa de descoberta de falsas (FDR) também foi aplicada como medida de relevância. conjuntos de genes utilizados para análise foram obtidos a partir do banco de dados assinaturas moleculares (MSigDB, Broad Institute), incluindo posicional, bairro curadoria, co-expressão, GO, e as metas de fator de transcrição evolutivamente conservadas.

Em segundo lugar, normalizada, mas caso contrário un-processados ​​dados de expressão de genes foram utilizados para definir as assinaturas genéticas que se correlacionam com as características fenotípicas (redondo /normal, em massa, fenótipo estreladas). Análise de Componentes Principais (PCA) e plotagem de genes informativos correlacionando com morfologias esferóides foram realizadas com base em scripts R especializados. Genes que representam a maior percentagem de variância foram selecionados com base em análise de variância.

Ingenuity Pathway Analysis (IPA) e de selecção composto.

agrupamentos de genes diferencialmente expressos (rácios de 2D /3D) foram enviados para o IPA para executar gene análises de rede e identificação de genes potencialmente informativos centrais “centro”. inibidores de moléculas pequenas específicos contra certos cubos ou genes de vias do cubo e foram adquiridos a partir de TOCRIS e Sigma-Aldrich (ver abaixo). fontes adicionais e independentes de droga /informações alvo também foram utilizados para o mesmo fim (drugbank; https://www.drugbank.ca; Matador https://matador.embl.de)

RT-PCR. validação.

2? g de ARN total foram reversamente transcritos com Invitrogen Superscript II de transcriptase reversa em 50 ul. Os cDNAs foram diluídos 1/10. QRT-PCR foi realizado em triplicado com o 7900HT Sequence Detection System rápida (Applied Biosystems) em 96 poços ou de formato de placa de 384 poços, 8 ul /poço. iniciadores e sondas de PCR foram desenhados com base na sonda Biblioteca Roche universal, os oligonucleótidos foram encomendados a partir da Sigma-Aldrich. Os iniciadores foram utilizados a 300 nm, sondas concentração de 100 nM; com 2x TaqMan® Universal PCR Master Mix. execuções de PCR foram analisados ​​usando o software da Applied Biosystems SDS

lisado de proteína microarrays (LMA)

Prostaspheres foram coletadas nos dias 3, 6, 8, 10 e 14..; de acordo com o protocolo seguinte: micropoços foram lavados com PBS, Matrigel misturada com EDTA 5 mM arrefecido com gelo em PBS, transferidas para placas de 96 poços de fundo em V (Greiner), e incubadas em gelo em um tampo de mesa-agitador durante 30 minutos. As esferas foram sedimentadas por centrifugação e lisadas em tampão-LMA (0,2% de SDS, Tris 100 mM, DTT 10 mM). As células em monocamada foram colhidas em tampão a-LMA 90% de confluência em placas de 10 cm. Para cada ponto de tempo, duas réplicas biológicas foram impressos numa única matriz. A impressão, a coloração, a digitalização, a subtracção de fundo, normalização em relação a p-actina de sinal, e as análises de dados foram realizadas conforme descrito anteriormente [34].

Western blotting.

As amostras de proteína a partir de poços de cultura eram recolhida tal como descrito a partir de placas de micropoços, e lisadas em WB-tampão (Hepes 25 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, pH 8,3, 0,5% de Triton X-100, 20 mM de β-glicerofosfato, 100 uM ortovanadato, 0,5 mM de PMSF e DTT 1 mM). A concentração de proteína foi medida pelo ensaio de Bradford, e as proteínas separadas por SDS-PAGE com géis pré-moldados de pager (Lonza), transferidos sobre membrana de transferência de nitrocelulose Protran (Whatman), e colocados a hibridar com os anticorpos primários indicados na Tabela S3. Multiplex de incubação com três anticorpos foi utilizado para acomodar a pequena quantidade total de proteínas extraídas a partir de culturas miniaturizados. Os anticorpos foram detectados com anticorpos Alexa infravermelhos conjugado com corante secundário (Invitrogen), e membranas digitalizados com o Infrared Imaging System Odyssey (LI-COR).

Os tratamentos medicamentosos em 3D.

compostos foram ordenados da SIGMA ou Tocris Inc., e dissolveu-se no veículo apropriado (DMSO, etanol, 1xPBS) de acordo com as instruções do fabricante. quimiocinas humano recombinante, citocinas e anticorpos bloqueadores de função foram ordenados a partir de R D Systems. As drogas foram preparadas como soluções de reserva 10 mM, armazenada a -20. A maioria das quimioquinas e peptídeos foram diluídos a 1 ug /uL soluções de reserva. Diluição de soluções de trabalho foi realizado imediatamente antes do tratamento. Os fármacos foram adicionados depois de um período de 4 dias, durante os quais esferóides desenvolver, e mantida durante até 7 dias. As concentrações de droga foram seleccionados de acordo com a metade da concentração máxima inibitória (IC50), para a maioria dos compostos conhecidos. Todos os tratamentos foram realizados em triplicado. Esferóides foram monitorados em tempo real por meio de imagens ao vivo de células (Incucyte, Essen Instruments; 10x objetiva), a aquisição de imagem 1 /h

ensaios de proliferação celular

As células foram semeadas em 384-.. bem placas foram adicionadas 24 h antes das drogas. Após 72 h, o número de células vivas foi avaliada com CellTiter Blue® Ensaio de viabilidade celular (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. sinal fluorescente foi quantificada com EnVision Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer).

Resultados

células epiteliais da próstata normais e PRCA linhas formam morfologias características em Matrigel

câncer de próstata e de próstata normal linhas celulares (AEP) não conseguem diferenciar e formar estruturas multicelulares em puramente colágeno rica matriz extracelular (Figura S1). Em colágeno, ambas as células tumorais normal- e formado apenas agregados soltos, com contatos célula-célula pobres ou não, muitas vezes exibindo um padrão de crescimento de fibroblastos-like. Em contraste, Matrigel apoia fortemente o crescimento e diferenciação de esferóides normais e AEP. Matrigel tem efeitos profundos sobre todas as linhas celulares testadas e, com poucas exceções; formação de estruturas multicelulares relevantes é suportada. formação esferoidal em Matrigel foi tipicamente iniciada por células individuais. Os esferóides formados em Matrigel geralmente caiu em quatro categorias morfológicas, adaptados a partir de [19], [35] (Figura 1; Figura S2).

A maioria das estruturas caiu nas categorias rodada, massa, estreladas, ou grape- gostar. Algumas linhas celulares não conseguiu formar esferóides em Matrigel, mas persistiu como células vivas individuais para até duas semanas (único fenótipo). A maioria dos esferóides foram fotografadas nos dias 9-10 após a inoculação. PC-3 esferóides, mostrados como fenótipo rodada no dia 9, sofrem uma metamorfose para invasiva fenótipo /estreladas no dia 13. O mesmo ocorre para PC-3M em um ponto de tempo anterior (dia 5-8).

Ramificação /fenótipo Round.

normal epiteliais da próstata primário (PrECs) e as linhas não transformadas, como RWPE-1 e EP156T células formadas esferóides rodada após 6-10 dias em cultura (Figura 1). PrECs normais e in vitro linhas celulares imortalizadas, tais como RWPE-1 e células PWR-1E simultaneamente formados ramificação acinar e estruturas esferóides redondos, migrar activamente para a ECM circundante sob a forma de grandes agregados de células (Figura 2 A-D). células EP156T mostrou nenhuma ou poucas estruturas de ramificação. estruturas redondas geral desenvolveu uma lâmina basal robusta (BL), encapsulando ambos os esferóides e estruturas acinares (Figura 2, Figura S2, Figura 3G-m). rodada Surpreendentemente, a linhas de tumores DU145, PC-3 e células PC-3M também formado e bem diferenciados, esferóides polarizados (Figura 2E), rodeado por um BL completo, e frequentemente contém um lúmen (PC-3; Figura 3e + r) . Além disso, PC-3 esferóides muitas vezes continha uma célula interna massa reminiscência de estruturas vistas em PIN (neoplasias intra-epiteliais da próstata). coloração imunológico de proteínas apertado de junção, tais como ZO-1 (não mostrado) e F-actina (Figura 3a-c), demonstraram geralmente muito robusta contactos célula-célula e a polarização celular em esferóides redondas formadas por ambas as células normais e tumorais.

imagem de contraste a) Fase de ramificação estruturas formadas por células RWPE-1, B) estrutura acinar formado por RWPE-1 coradas com um anticorpo contra a laminina B1. C) Ramificação ou estruturas de cluster-like formados por células epiteliais da próstata primário (Prec). D). estruturas de ramificação misto e fenótipo de massa, formada por células PWR-1E. estruturas redondas E) formados por células PC-3 no dia 9, coloração de células vivas com calceína. F) transformação morfológica de esferóides redondas em estruturas invasivas no dia 13. G) imagem de contraste de fase de PC-3 invasivos estruturas em torno do dia 13. H). Coloração de PC-3 filopios com um anticorpo específico para a forma activa da integrina beta 1 (ITGB1), ilustrando decoração densa de estruturas de células fusiformes.

Faloidina

Alexa488-marcado foi utilizado para detectar F -actina e mancha Hoechst para rotular núcleos (azul). RWPE1, DU145 e células PC3 mostram expressão de marcadores mesenquimais relacionadas com a EMT, independentemente do fenótipo (células PC-3; rodada no dia 9, estreladas no dia 14)

fenótipo Mass

..

a maioria dos PRCA (LNCaP, 22rV1, MDA-PRCA 1, UM-SCP1, CWR-R1, LAPC-4) e dois

in vitro

linhas transformadas (PWR-1E, RWPE-2) gerado grandes, esferóides irregulares com BL muitas vezes incompletos ou em falta, também falta um lúmen oco (Figura 3D + K). PWR-1E foi a única linha de células de massa-fenótipo capaz de ramificação /acinar morfogênese (Figura 2d). As queratinas luminais KRT8 e KRT18 sempre foram fortemente expresso (Tabela S3). contactos célula-célula, a maturação e polarização foram geralmente menos pronunciado, em comparação com esferóides redondos, que se reflecte nos esferóides irregulares muitas vezes em forma de rim (Figura 1). estruturas fenótipo de massa fez geralmente não mostrar invasão do lrECM; No entanto, a formação de filopodia ou pseudopodia foi consistentemente observado no 22rV1 e, ocasionalmente, na LNCaP e linhas celulares RWPE-2. Em esferóides LNCaP, as células foram frequentemente observadas para deixar as estruturas esferóides nos locais de cobertura BL incompleta (Figura S2).

uva-como fenótipo.

Apenas uma linha de células, 1013L, consistentemente formado cachos soltos de células com contatos célula-célula particularmente pobres, sem qualquer BL. LAPC-4 células formadas ambas as estruturas de massa e de uva-like. Não há propriedades invasivas foram observados nestas linhas celulares.

Stellate “invasiva” fenótipo.

As in vitro linhas celulares transformadas RWPE-2 /W99, WPE-1 /NB14, e as linhas de tumor estreladas formado ou invasivos estruturas ALVA-31 e ALVA-41, caracterizados por filopódios fusiforme (Figura 2 g) e a rápida migração de cadeias de células através da ECM circundante. estruturas invasivas formadas eram quase exclusivamente multicelular e mostrou um modo de invasão chain-like. De tipo fibroblasto, mesenquimal invasão de células individuais foi observado apenas ocasionalmente. O

in vitro

linhas transformadas RWPE-2, RWPE-2 /W99 e WPE1 /NB14 formados simultaneamente estruturas estreladas e esferóides redondas, indicando composição heterogénea destas linhas celulares. Destes, RWPE-2 /W99 representada a linha de células com o fenótipo estreladas mais consistente, e foi seleccionado para mais experiências. células da próstata imortalizadas do estroma (WPMY-1), e células estromais derivadas de tumor primário (não mostrado) também formaram estruturas estreladas semelhantes, no entanto sem motilidade rápida e propriedades invasivas.

interruptor invasivo.

Round e bem diferenciados, esferóides polarizadas foram formados por células PC-3M PC-3 e, mas passou por uma transformação espontânea no sentido de morfologia invasiva em torno de 10-13 e 6-8 dias em 3D, respectivamente (Figura 2e + f, suplementar invasão filme S1). O início da transformação morfológica para a estreladas, fenótipo invasivo era dependente da densidade celular. Transformação poderia ser temporariamente adiado e ainda que parcialmente revertida mediante alimentando meio fresco, mas eventualmente continuava progredindo até que todas as estruturas foram completamente transformada e únicas estruturas estreladas permaneceu (Figura 2 g). estruturas invasivas e filopódios formada mesmo antes de invasão expressa fortemente a forma activa do receptor lamininas integrina beta 1, indicando fortes contatos para a matriz extracelular como um pré-requisito para os processos invasivos (Figura 2h). Simultaneamente, a BL de estruturas transformadas torna-se cada vez mais difusa e se desintegrou (Figura 3 m). forte expressão de marcadores mesenquimais vimentina VIM e fibronectina FN1 (Figura 3o-Y), observados em não-invasiva RWPE-1 (heterogénea) e DU145, mas também em células PC-3, não se correlacionou com o fenótipo estreladas. Além disso, a expressão de VIM e FN1 não aumentaram após a transformação invasiva de células PC-3 e PC-3M (Figura 3s + y)

fenótipo “Single”.

Algumas linhas de câncer ( VCaP, DuCaP, NCI-H660 e MDA-PCA 2b) não conseguiu formar esferóides, mas persistiu como células individuais ( “single” ou “fenótipo singular”) por até 2 semanas. Curiosamente, todas estas linhas celulares eram positivas para eventos de fusão do factor de transcrição ou ETS-(rearranjos TMPRSS2-ERG em H660, VCaP e DuCaP, um rearranjo ETV1 equilibrada em MDA-PCA 2b). Gene análises de células VCaP em Matrigel expressão indicou que as células podem sofrer diferenciação terminal ou senescência, quando incorporado em Matrigel (dados não mostrados). Expressão dos genes dos genes de fusão e de proliferação relevantes TMPRSS2-ERG foi reduzida em Matrigel. No entanto, o crescimento da VCaP e DuCaP não se restringiu em géis de colágeno tipo I; e os padrões de expressão genética em Col I foram limitados (não mostrado).

As mudanças dinâmicas de expressão gênica em resposta a Matrigel correlacionam com propriedades normais, transformada e invasivos

LrECM ea formação de esferóides induzir mudanças fundamentais em biologia celular, proteínas e expressão do gene mRNA de células AEP. Cerca de 3400 mRNAs foram diferencialmente expressos entre as condições de 2D e 3D, porém não de forma consistente em todas as linhas celulares e todos os pontos temporais. Observaram-se três padrões generalizadas de expressão genética alterada ao longo do painel de linhas celulares (Figura 4a + b). expressão alterada de genes seleccionados foi validado por qRT-PCR (Figura 4c). Factores de expressão diferencial, tal como confirmado por qRT-PCR, foram geralmente maior em comparação com os dados de matriz. GO analisa e GSEA revelou categorias funcionais enriquecidos altamente significativos de genes para a maioria dos grupos (Tabelas S4, S5 e S6).

A) Heatmap, ilustrando 12 agrupamentos gerados pelo algoritmo K-means. Clusters 1 + 2 representam genes exclusivamente afetadas em células normais (Prec, EP156T). Clusters 6-8 representam genes induzidos ou reprimidos semelhante em todas as linhas de células, em resposta à cultura de células, em Matrigel 3D 3D, independentemente do fenótipo, ou transformação. Clusters 9-12 contêm genes característicos para os /as linhas estreladas invasivos de células tipo (ALVA31, PC3, PC3M, RWPE2 /W99), ou que são induzidos durante a conversão espontânea da rodada para estruturas estreladas (por exemplo PC3, dia 13 e 15).