Abstract

Fundo

Proveniente de Primordial células germinativas /gonócitos e desenvolver através de uma lesão precursora chamada Carcinoma

In Situ

(CIS), cancros em células germinativas (GCC) são o tipo de câncer mais comum em homens jovens, subdividido em seminoma (sE) e não-seminoma (NS). Durante fisiológico de células germinativas formação /maturação, processos epigenética proteger a homeostase através da regulação da acessibilidade do DNA para facilitar a transcrição. desregulação epigenética através de parâmetros genéticos e ambientais (isto é genvironment) poderia interromper o desenvolvimento de células germinativas embrionárias, resultando em maturação retardada ou bloqueada. Este potencialmente facilita a formação de cis e progressão para GCC invasiva. Portanto, a determinação da epigenética e da paisagem genômica funcional em linhas celulares do CCG poderia fornecer informações sobre a fisiopatologia e etiologia do GCC e fornecer orientação para experiências funcionais alvejados.

Resultados

Este estudo tem como objetivo identificar epigenética pegadas em linhas celulares SE e CE em perfis de todo o genoma, estudando a interação entre a expressão genética, DNA CpG metilação e modificações de histonas, e sua função na fisiopatologia e etiologia do GCC. Duas linhas de células-derivadas GCC bem caracterizados foram comparados, um representante para SE (TC AM-2) e o outro para CE (NCCIT). Os dados foram adquiridos utilizando o Illumina HumanHT-12-v4 (expressão do gene) e microarrays HumanMethylation450 BeadChip (metilação), bem como ChIP-seqüenciamento (ativando modificações de histonas (H3K4me3, H3K27ac)). Os resultados indicam marcadores de células germinativas conhecidos não só para ser diferenciadores entre SE e NS no nível de expressão, mas também na paisagem epigenética.

Conclusão

A semelhança global entre TCAM-2 /suporte NCCIT uma célula germinal embrionária apagado preso em desenvolvimento gonadal cedo como células de origem comum, embora o estágio de desenvolvimento exato de onde as células tumorais são derivadas pode ser diferente. Na verdade, sutil diferença nos (integrado) perfis epigenéticos e expressão indicam TCAM-2 para exibir um perfil celular como mais germe, enquanto NCCIT mostra um fenótipo mais pluripotentes. Os resultados fornecem uma visão sobre o genoma funcional em linhas celulares do CCG

Citation:. Van der Zwan YG, Rijlaarsdam MA, Rossello FJ, Notini AJ, de Boer S, Watkins DN, et al. (2014) Seminoma Embrionárias Carcinoma Pegadas identificados pela análise de Integrated Genome-Wide epigenética e perfis de expressão de linhas celulares de cancro Germ Cell. PLoS ONE 9 (6): e98330. doi: 10.1371 /journal.pone.0098330

editor: Amr H. Sawalha, da Universidade de Michigan, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Março, 2014; Aceito: 30 de abril de 2014; Publicação: 02 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 van der Zwan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Matriz e seqüenciamento chip de dados está disponível no Omnibus Gene Expression sob o número de GSE56454

Financiamento:. Este trabalho é apoiado por fundos da Sociedade Europeia de Endocrinologia Pediátrica Research Fellowship (YZ). MR é apoiado por uma Translational Grant, Erasmus MC. SB é suportado pela APA e IPRS bolsas de estudo da Universidade de Monash. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Universidade de Monash (SW). MIMR recebe o apoio do Programa de Apoio à Infra-estrutura Operacional do Governo de Victoria. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Tipo II (testicular) tumores de células germinativas, aqui referido como cancros em células germinativas (GCC), são a neoplasia maligna mais comum em adolescentes caucasianas e jovens adultos, e sua incidência continua a aumentar [1] – [3 ]. GCC originam de células germinais primordiais ou gonócitos, e são subdivididos em seminomas (SE) e não-seminomas (NS), com carcinoma

em

situ (CIS) do testículo como sua lesão precursora comum [1], também conhecido como intratubular germe celular não Classificada Neoplasia (IGCNU) [3]. Em contraste com CIS e SE, o componente de células estaminais de NS (isto é, carcinoma embrionário, CE) é caracterizado pelo potencial pluripotente [4]. CE podem se diferenciar em linhagens somáticas e tecidos extra-embrionário (teratoma vs tumor do saco vitelino e coriocarcinoma, respectivamente), incluindo a linhagem de células germinativas [4]. Vários factores de risco clínicos, genéticos e ambientais para GCC foram identificados, embora o papel exacto destes factores não é completamente claro. fatores de risco clínicos constituem /andrológico /aberrações gonadal urológicos [5] – [8], enquanto que fatores ambientais concentrar em desreguladores endócrinos e andrógeno – equilíbrio estrogênio [9] – [11]. fatores de risco genéticos incluem uma série de susceptibilidade Polimorfismos de Nucleotídeo Único, provavelmente relacionados com o desenvolvimento gonadal precoce [12] – [15] e uma associação com predisposição familiar [16]. Mutações somáticas são raramente encontrados no GCC [17]. Há fortes indícios de que o micro-ambiente do testículo em desenvolvimento é de significativa importância na patogênese da GCC. Pacientes com síndrome testicular Disgenesia (TDS) e formas específicas de transtornos do desenvolvimento sexual (DDS) são conhecidos por terem um risco aumentado de desenvolver GCC devido ao desenvolvimento gonadal anormal, ou seja, hypovirilization [18].

processos epigenéticos têm um papel claro, tanto na iniciação e protecção da pluripotência [19]. A desregulação destes processos bem controlados é conhecido por estar envolvido na formação e progressão de vários tipos de cancro [20] – [24], incluindo GCC [25]. Durante a formação fisiológica células germinativas e maturação, processos epigenética (por exemplo, a metilação do DNA, histonas modificações) homeostase guarda através da regulação da acessibilidade do DNA para facilitar a transcrição [25], [26]. O epigenoma é altamente dinâmico, e as mudanças ocorrem, dependendo do tipo de célula e estágio de desenvolvimento, influenciado por /refletindo o ambiente (microbiologia). Apesar deste conhecimento, pouco se sabe sobre o papel das modificações de histonas e metilação do DNA sobre a expressão gênica em GCC, em geral, e as possíveis semelhanças e diferenças entre SE e CE [25], [27]. desregulação epigenética por meio de parâmetros genéticos e ambientais (referido como genvironment) pode interromper o desenvolvimento de células germinativas embrionário fisiológico, resultando em maturação atrasada ou bloqueada, facilitando assim a formação de CEI, e potencialmente a progressão para um GCC invasiva [25], [28] – [30]. Portanto, a determinação da epigenética e da paisagem genômica funcional em linhas celulares do CCG poderia fornecer informações sobre a fisiopatologia e etiologia do GCC. Os resultados poderiam fornecer orientação para experiências funcionais alvejados.

Neste estudo, pegadas epigenéticas de linhas celulares SE e CE foram identificados através do estudo da interação entre a expressão do gene, a metilação do DNA e modificações de histonas. Duas linhas de células-derivadas GCC bem caracterizados foram usadas, um representante para SE (TC AM-2) [31], [32] e o outro para CE (NCCIT) [33]. Dois tipos de modificações epigenéticas foram investigados e relacionadas com genoma análise ampla expressão:. CpG estatuto de metilação do DNA, e enriquecimento de ativar marcas de histonas (H3K4me3, H3K27ac)

Métodos

cultura celular

[33] células TC AM-2 [31], [32], [34] e NCCIT foram cultivadas em meio DMEM (# 31966-021, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) contendo 10% soro fetal bovino (FCS, a GE Healthcare Life Sciences, Hyclone Laboratories, Utah, EUA) em T75 cm

2 frascos para 75-90% de confluência. Para a preparação de RNA, foi adicionado meio fresco 24 horas antes da colheita. As células foram lavadas uma vez com Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS, # 14175-053, Thermo Fisher Scientific Technologies /Life, Carlsbad, CA, EUA), e lisaram-se com 7 mL de gelo frio de ARN-abelha (# Cs-105B, TEL -test Inc, Friendswood, Texas, EUA). Para metilação, a expressão do gene (duplicatas biológicos) e análises Chip-seq, diferentes culturas de células de uma única fonte foram utilizados (laboratório LEPO, Departamento de Patologia, Erasmus MC Rotterdam). réplicas biológicas foram iniciadas como culturas independentes em diferentes dias e processados ​​de forma semelhante.

perfis de metilação

O ADN foi isolado utilizando o kit DNeasy de acordo com as instruções do fabricante (# 69504, Qiagen, Hilden, Alemanha). conversão de bissulfito (EZ DNA Metilação ouro Kit, Zymo Research, Irvine, CA, EUA) e de detecção de metilação foi realizada a ServiceXS (ServiceXS B.V., Leiden, Países Baixos). Ilumina de HumanMethylation450 BeadChip foi usada (Illumina, Inc., San Diego, CA, E.U.A, de processamento e de hibridação de acordo com as instruções do fabricante). processamento de imagem teve lugar no sistema iScan e os dados foi extraído utilizando GenomeStudio, usando as configurações de análise padrão (incluindo a correcção de fundo e normalização com base em controles internos) e v 1.2 da anotação manifesto (https://support.illumina.com/downloads /humanmethylation450_15017482_v12.ilmn). O processamento adicional foi realizado em R utilizando o (https://www.bioconductor.org/) pacote LUMI [35] após a otimizado “lumi: QN + BMIQ” pipeline [36] Isto inclui a exclusão de sondas de baixo desempenho (p 0,01), ajuste de cor, a normalização quantil e correção para o tipo de sonda viés (Infinium I vs II) usando o algoritmo BMIQ [37]. Todos os arquivos de dados brutos e processados ​​são enviados como um geo Superseries e acessível através GSE56454 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Diferencialmente regiões metiladas foram identificados usando o algoritmo DMRforPairs usando as configurações padrão [38]. DMRforPairs está disponível através Bioconductor: (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DMRforPairs.html). Resumidamente, DMRforPairs define regiões genômicas usando densidade sonda local e homogeneidade opcionalmente funcional (por exemplo, todas as sondas em uma região deve ser gene associado). Ele quantifica, testes e visualiza padrões (diferencial) de metilação entre amostras únicas. Diferenças foram calculados como NCCIT contra TCAMO-2.

perfil de expressão gênica

Cerca de 20 ug de ARN foi tratado com RNase ADNasel (# 2238, Ambion, Inc. Ambion, Austin, TX , EUA) durante 30 minutos a 37 ° C e subsequentemente purificado utilizando o kit RNeasy mini (# 74104, Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. ARN puro foi eluída em 50 ul de água, e quantificada utilizando um Nanodrop (Thermo Scientific). controle de qualidade, rotulagem RNA, hibridação e extração de dados foram realizados no ServiceXS B.V. (Leiden, Holanda) de acordo com seu protocolo in-house. ARNc biotinilado foi preparado usando o kit de amplificação de ARN Ilumina TotalPrep (# AMIL1791, Ambion Inc., Austin, TX, EUA) de acordo com as especificações do fabricante, com uma entrada de 200 ng de ARN total. Por exemplo, 750 ng de cRNA biotinilado foi hibridizado para o HumanHT Ilumina-12 V4 (Illumina, Inc., San Diego, CA, E.U.A.) de acordo com o Manual Ilumina “Guia Hibridação directa de Ensaio”. processamento de imagem teve lugar no sistema iScan e os dados foi extraído utilizando GenomeStudio (configurações padrão). O tratamento posterior foi realizada em I utilizando o pacote LUMI (https://www.bioconductor.org/) [35]. Seguindo as orientações apresentadas em [39], robusta normalização estriado foi aplicada aos valores de intensidade de log2 transformado. Sondas com p

Detecção 0,05 em 50% das amostras foram excluídos da análise (n = 27.964 de 47.323). intensidades médias log2 de repetições biológicas e por gene foram utilizados para avaliar os níveis de expressão (número de acesso GEO GSE56454). rácios de log2 (R) das intensidades médias nas duas linhas celulares (NCCIT /TC AM-2) foram usadas para identificar genes expressos diferencialmente significativamente. Genes com níveis de expressão fora do intervalo de confiança de 99% (CI) dessa relação log foram identificados como diferencialmente expressos entre NCCIT e TCAM-2.

modificação da histona profiling (H3K27ac, H3K4me3)

A ensaio chip foi realizada de acordo com o número de células protocolo de baixo chip da Diagenode (Liège, Bélgica), com pequenas modificações. Em resumo, 1 x 10

6 células foram reticulados durante oito minutos, por adição de formaldeído até uma concentração final de 1%, seguido por neutralização com 1,25 M de glicina. As células foram então lisadas, e cromatina foi tosquiada de -500 pb utilizando fragmentos do sonicador Covaris sob as seguintes condições; ciclo de trabalho de 20%, potência incidente pico de 200 watts, ciclos /disparo 200, tempo de 5 min, temperatura de 4 ° C. Dynabeads revestidas com uma proteína (# 10002D, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foram incubadas com 7 ug dos seguintes anticorpos: H3K4me3 (Diagenode Pab-003-050) ou H3K27ac (Ab4729, Abcam, de Cambridge, Reino Unido). Os grânulos foram combinados com cromatina de 1 × 10

6 células durante a noite em uma roda rotativa. As pérolas imunes foram lavadas, e o ADN foi purificado utilizando o kit de purificação de ADN iPure (AL-100-0100, Diagenode, Liège, Bélgica) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos de ADN foram cortados uma segunda vez utilizando um sonicador Covaris (ciclo de trabalho de 10%, poder incidência de pico 175 watts, 200 ciclos /disparo de tempo, 5 minutos, temperatura de 4 ° C). Massively sequenciamento paralelo de DNA chip (CHIP-Seq) foi realizada utilizando a plataforma 5500xl SOLiD ™ sequenciamento (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), no Centro de Monash Saúde Tradução Precinct Medical Genomics. Os experimentos de seqüenciamento eram single-end com 50 comprimento nt ler (300 nt tamanho médio fragmento). Sequenciamento lê estavam alinhados com o modelo completo do genoma humano hg19 (versão UCSC, fevereiro de 2009), utilizando v2.5 ™ Genomic Analysis Software LifeScope (https://www.lifetechnologies.com/lifescope). amostras experimentais Chip-Seq foram normalizados para um total de 10

7 marcas de sequenciamento mapeados de forma exclusiva. Os dados foram processados ​​em Homer ([40], https://homer.salk.edu/homer/chipseq/) para detectar picos e enriquecimentos motivo usando as configurações padrão (exceto “enriquecimento vezes sobre input”, usado 2; limiar de p -valor 0,01) (número de acesso GEO GSE56454). alturas de pico de Homer foram corrigidos para o fundo (menor altura do pico detectável). Heights foram então somados por gene (ΣP) como anotado por Homer e genes sem qualquer pico detectável foram definido como 0. A diferença de alturas de pico somados (ΔΣP = ΣP

TCAM-2-ΣP

NCCIT) foi usado para quantificar as diferenças entre as linhas celulares. Genes com diferencial significativamente os padrões de modificação das histonas foram identificados para ambas as marcas em separado (fora do CI de 99% dos ΔΣP). Associação de um pico com TSS foi usado como anotado por Homero (1 kb a montante do TSS – 100 pb a jusante)

análise MLPA-DNaseI

sondas MLPA foram projetados seguintes critérios descritos anteriormente [. ,,,0],41]. Baseado em padrões diferenciais de modificação em NCCIT e TCAM-2 sondas foram concebidas para o seguinte loci: NCCIT: CHR3: 181425532-181425720, CHR5: 146.699.813-146.699.953, CHR3: 181.577.755-181.577.830, CHR6: 15.240.050-15.240.160, chr15: 93.191.596-93.191.696 , CHR3: 178.908.801-178.908.966, CHR5: 101.550.991-101.551.125, TCAM-2: CHR11: 10.613.134-10.613.220, Chr1: 201.278.163-201.278.251, chr12: 3.091.402-3.091.483, CHR19: 13.985.162-13.985.322, chr2: 38.323.813-38.323.931, CHR9: 843018 -843.110, CHR5: 140.762.378-140.762.475. MLPA-ADNasel foi realizada como descrito anteriormente [42], com modificações menores. Em resumo, os núcleos a partir de 1 × 10

6 células foram isoladas, e tratou-se com uma gama de concentrações DNaseI (0, 2 e 5 unidades). ADN genómico digerido foi purificado, e 50-100 ng foi utilizado numa reacção de MLPA. Após amplificação por PCR de sondas ligadas, os produtos foram separados num sequenciador de ADN ABI3700. Os dados foram analisados ​​conforme anteriormente descrito, com uma redução de 75% da altura do pico em ADN digerido utilizado como um limite para definir-ADNasel hipersensibilidade [43].

Software

As análises foram realizadas em I 3.0.1 (Windows 7 × 64) e 2.15.2 (Redhat Linux × 64). As redes /análises de enriquecimento foram realizados em IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). posições genômicas relatados neste manuscrito são baseadas na montagem /hg19 GRch37.

Resultados

Para investigar características epigenéticas de SE e CE e sua relação com a expressão do gene, a modificação da histona todo o genoma e DNA padrões de metilação foram investigadas nas linhas celulares TCAM-2 (sE) e NCCIT (CE), e combinados para perfis de expressão gênica. As diferenças entre as duas linhas de células no que se refere à modificação da histona e o estado de metilação de ADN foram primeiramente investigados separadamente. Posteriormente, os conjuntos de dados resultantes foram integrados para identificar genes (alvo) com uma forte relação entre a configuração de DNA preparado e maiores níveis de expressão.

modificação da histona

padrões de modificação histona foram avaliados através de imunoprecipitação da cromatina combinado com sequenciamento de rendimento elevado (ChIP-seq). A análise dos dados foi realizada como descrito na secção de materiais e métodos. Alterações na H3K4me3 e H3K27ac foram investigados, que são marcadores associados com a activação do promotor (local de início da transcrição (TSS), e H3K4me3 H3K27ac) e activação potenciador (principalmente H3K27ac) [44], [45]. Em adição à análise do (diferenciais) padrões de modificação, o enriquecimento motivo das regiões modificadas foi investigada e comparada entre as linhas de células.

H3K4me3 H3K27ac e não mostram o enriquecimento diferencial perto dos locais de início da transcrição e as suas alturas dos picos correlacionados dentro dos genes.

Dependendo da linhagem de células, de 10,2 /11,3% do H3K27ac enriquecido loci estavam localizados dentro de 1 kb de um TSS contra um comparável 14,7 /16,8% dos loci H3K4me3 (TC AM-2 /NCCIT) . Isto está de acordo com observações de outros tipos de células que mostram que, embora H3K4me3 está directamente relacionada com a activação do promotor, uma grande maioria dos loci H3K4me3 estão localizados distalmente do TSS [46]. H3K27ac não relatou localização preferencial para TSS [47]. O nível de picos somados por gene (ΣP, consulte Métodos) foi utilizado para comparar os padrões de modificação da histona entre as duas marcas de histonas. Houve correlação significativa em ambas as linhas celulares entre os níveis de pico em genes onde ambos estavam presentes (ρ

TCAM-2 = 0,62, p

TCAM-2 0,001, n

TCAM-2 = 1,837; ρ

NCCIT = 0,37, p

NCCIT 0,001, n

NCCIT = 746; ρ de Spearman). Isto está de acordo com a sua função de sobreposição: configuração da cromatina aberta está associada com as duas marcas [19], [22] e permitiu-nos para combinar os resultados de modificação das histonas na análise subsequente

H3K4me3 e H3K27ac padrões de enriquecimento nos. TCAM-2 e NCCIT estão em conformidade com conhecidos marcadores especificidade sE /CE.

Nós já mostrou que os padrões de modificação da cromatina ativos para

Sox17

e

SOX2

nas linhas celulares TCAM-2 e NCCIT corresponder ao padrão esperado, baseado na expressão gênica e protéica e da constituição histológica (

Sox17

ativo no TCAM-2,

SOX2

ativo na NCCIT) [25]. Em consonância com isso,

Sox17

e

SOX2

foram diferencialmente enriquecido tanto para H3K4me3 e H3K27ac no TCAM-2 e NCCIT respectivamente (Figura 1).

OCT3 /4

não mostrou o enriquecimento dentro da sequência de codificação, no entanto, houve enriquecimento de ambos os marcadores perto do TSS em NCCIT e TCAM-2. Isto é consistente com o conhecido OCT3 ARNm /4 e a expressão da proteína em ambas as linhas de células [31], [48]. NANOG foi mais enriquecido para ambos os marcadores em TCAMO-2, de acordo com as diferenças de nível de expressão (ver abaixo).

As setas indicam a direcção de transcrição. caixas verdes indicam marcadores específicos para o subtipo histológico representado pela linha celular. Caixas pretas = nenhuma diferença entre as linhas celulares; caixas vermelhas = Não é um marcador para esse tipo de célula. Observe as diferentes faixas no eixo y para H3K4me3 e H3K27ac.

Em uma escala de todo o genoma, 29,428 loci H3K4me3 enriquecidos foram identificados em TCAM-2 e 19.015 em NCCIT. 25-41% mais loci enriquecido foram identificados para H3K27ac do que para H3K4me3 (n

TCAM-2 = 41,569, n

NCCIT = 23.763). foram selecionados genes com diferenças significativas na altura do pico resumido por gene (ΔΣP, consulte Métodos) para análise posterior. Para TCAM-2, genes que mostram modificações de histonas diferenciais foram maiores em número de H3K27ac (n

TCAM-2 = 433, N

NCCIT = 28). Para NCCIT, foram substancialmente mais genes selecionados para H3K4me3 comparação com H3K27ac (n

TCAM-2 = 215, N

NCCIT = 325). Para ambas as marcas, 86/11 genes sobrepostos entre listas superiores de diferenciação no TCAM-2 e NCCIT respectivamente. Estes incluíram o marcador SE

Sox17

no TCAM-2 e o marcador CE

SOX2

em NCCIT (Figura S1, Tabela S1). Funcionalmente, as listas de genes de ambas as linhagens celulares mostraram enriquecimento significativo para (embrionárias) tronco manutenção de células /pluripotência (Tabela S2). Enriquecimento de funções biológicas no TCAM-2 similaridade indicou a células germinativas mais maduros, que não existe na lista de NCCIT (GO categorias TCAM-2 incluiu o desenvolvimento da morfologia do testículo normal e manutenção de células germinativas). Além disso, a sinalização vias canônicas IGF1 específico da célula germinal dois (log

p = 3,42) e célula-Sertoli junção de células germinativas de Sinalização (log

p = 2.11)) mostraram enriquecimento. Em TCAM-2, duas redes funcionais foram identificados incorporando o metabolismo via AR e lipídios (Tabela S2).

em células germinativas marcadores AP-2α e AP-2γ são motivos em TCAM-2 topo enriquecido, enquanto estaminais embrionárias celular motivos específicos SOX2 /OCT4 /TCF /NANOG são enriquecidas em ambas as linhas celulares.

foram identificados motivos significativamente enriquecido para cada linha celular e marca de histona (ferramenta de LOCAL, consulte Métodos). Houve uma forte sobreposição entre os motivos enriquecidos topo do ranking em NCCIT e TCAM-2. Isto era verdade para ambos os marcadores de ativação. Por exemplo, para H3K4me3 o motivo enriquecido topo foi MAZ tanto para TCAMO-2 e NCCIT, um factor de transcrição associada com MYC (liga-se a dois locais no seu promotor) e conhecida por estar envolvida na iniciação da transcrição, assim como terminação [49] ( Figura 2A, B;. Tabela S3)

Todos os motivos foram significativamente enriquecida em alvo ao longo de sequências de fundo (p 0,01). enriquecimento vezes é indicada em relação ao fundo. (A, B) Ranking Top motivos em ambas as linhas celulares mostraram forte sobreposição (top 10). (C, D) os motivos que diferiam fortemente entre as linhas de células no que diz respeito às suas enriquecimentos foram selecionados. Um motivo foi avaliada favoravelmente se a sua classificação foi alta (≤20) para uma linha de células e para baixo da outra linha de células (ou estava ausente na lista de outros motivos enriquecido). Pontuação: A diferença no ranking foi avaliado com base na diferença de posição relativa na lista (