Sumário
células-tronco cancerosas (CSCs) são capazes de proliferação contínua e auto-renovação e são propostas para desempenham papéis significativos na oncogênese, o crescimento do tumor, metástase e recorrência do câncer. CSCs são considerados derivada a partir de células estaminais normais afectadas pelo microambiente do tumor, embora o mecanismo de desenvolvimento não é ainda claro. Em 2007, o grupo de Yamanaka conseguiu gerar
Nanog
haste do rato induzida pluripotent células (MIPS), em que a proteína fluorescente verde (GFP) foi inserido na região 5 ‘não traduzida do
Nanog
gene. Normalmente, as células iPS, assim como as células estaminais embrionárias, são considerados para ser induzida em células progenitoras, que se diferenciam em vários fenótipos normais, dependendo do nicho normal. Nossa hipótese é que CSCs poderia ser derivado de
Nanog
células MIPS no meio de cultura condicionado de linhas celulares de cancro, que é uma imitação do microambiente carcinoma. Como resultado, as células Nanog MIPS tratados com o meio condicionado de carcinoma de pulmão de rato Lewis adquirida características de CSCs, na medida em que formada esferóides que expressam GFP em cultura em suspensão, e tinha uma elevada tumorigenicidade em ratinhos Balb /c nus que apresentam a angiogénese in vivo. Além disso, CSCs essas iPS derivadas tinha uma capacidade de auto-renovação e expressou a genes marcadores,
Nanog
,
Rex1
,
Eras,
ESG1
e
Cripto
, associada com propriedades de células-tronco e um estado indiferenciado. Assim, concluiu-se que um modelo de CSCs foi originalmente desenvolvido a partir de células MIPS e propôs o meio de cultura condicionado de linhas celulares de cancro pode atuar como nicho para a produção de CSCs. O modelo de CSCs eo procedimento do seu estabelecimento vai ajudar a estudar as alterações genéticas e os fatores secretados no microambiente do tumor que convertem células MIPS para CSCs. Além disso, a identificação de marcadores de boa-fé potencialmente de CSCs, o que contribuirá para o desenvolvimento de terapias anti-cancro novos, pode ser possível que o modelo CSC
Citation:. Chen L, Kasai T, Li Y, Sugii Y, L Jin, Okada H, et al. (2012) Um Modelo de câncer de células estaminais derivadas de células estaminais mouse pluripotentes induzidas. PLoS ONE 7 (4): e33544. doi: 10.1371 /journal.pone.0033544
editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center e Instituto de Pesquisas Beckman, Estados Unidos da América
Recebido: 30 setembro de 2011; Aceito: 10 de fevereiro de 2012; Publicação: 12 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por Grant-in-Aid para a Investigação científica (B) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (No. 21.300.179, https://www.waseda.jp/rps/en/manual/kakenhi_honbun.html), e pelo National Science Foundation Natural da China (Programa Key, Grant No. 30.930.038, https://www.nsfc.gov.cn/e_nsfc/desktop/zn/0101.htm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Uma série de estudos têm tentado identificar os mecanismos de crescimento tumor maligno subjacente e progressão. Apesar dos progressos significativos, a maioria das abordagens terapêuticas não conseguem eliminar todas as células tumorais. As células de tumor remanescentes geralmente resultam em recorrência e metástase. Recentemente, foi proposta a hipótese de células-tronco cancerosas (CSCs) para explicar a origem das células cancerosas. Por definição, os CSCs são uma pequena fracção de células de tumor com a capacidade tanto de auto-renovação e proliferação lenta ilimitada. Elas são muitas vezes resistentes à quimioterapia e à radiação e, portanto, são responsáveis pelo abastecimento contínuo de novas células cancerosas [1]. Uma visão atual do modelo CSCs é considerado que as células-tronco adultas, as células progenitoras, ou células diferenciadas podem adquirir as múltiplas alterações genéticas e epigenéticas necessárias para se tornar CSCs que estão envolvidos na promoção e manutenção da oncogênese. Esta célula de iniciação câncer pode compartilhar algumas características com células-tronco adultas que residem no órgão, de que provêm, seja porque os órgãos e tecidos se originam de células-tronco residentes ou porque as células-tronco estão agrupados pelas propriedades do seu nicho [2]. Neste contexto, as células tumorais podem ser epigeneticamente revertido para as células-tronco do tecido específico, quando transplantadas para um nicho de células estaminais normais [3] – [6]
é bem conhecido que o microambiente pode exercer profunda genético ou epigenético. efeitos sobre as células-tronco através de interações entre as células, ou por meio de fatores derivados de células provenientes das células circundantes dentro do nicho. Estes efeitos podem ser transitórios, como pode ser visto na activação de vias de sinalização que regula a proliferação e migração celular, ou podem estar associados com alterações mais estáveis, tais como a determinação do destino da célula e diferenciação [7]. Dado o papel crucial do microambiente em regulação celular, vários estudos demonstraram recentemente que o microambiente células estaminais embrionárias podem ter influência significativa sobre as características fenotípicas de células cancerosas agressivas [8] – [10]. No entanto, se o microambiente tumorigênico pode afetar o destino das células-tronco não foi suficientemente explorado.
Em 2007, o grupo de Yamanaka [11] conseguiu gerar
Nanog
MIPS células por transdução retroviral de quatro fatores de transcrição (
oct�ero 3/4
(
outubro 3/4
),
SRY box contendo o gene 2
(
Sox2
),
Kruppel-like factor 4
(
KLF4
) e
C-myc) em fibroblastos de rato embrionárias (MEF). GFP foi expresso de forma estável nestas células, mas a expressão da GFP foi extinto quando estas células foram induzidas para se diferenciarem. Até à data, as células foram diferenciadas MIPS com sucesso em vários tipos de células, incluindo células hematopoiéticas e endoteliais [12], as células neurais [13], as células cardíacas [14] e células p pancreáticas [15]. Apesar desses relatos de sucesso de diferenciação in vitro, as células iPS não são inteiramente adequados para transplante em pacientes. A questão principal é preocupações de segurança em que a IPS células tendem a formar teratomas e têm um risco de transformação maligna [16] – [18]. Com base na teoria CSCs, que verificar se CSCs pode ser derivada a partir de células MIPS após exposição a um microambiente do tumor (Fig. 1).
células MIPS deve ser induzida a alguns tipos de células progenitoras, tais como células hematopoiéticas e células estaminais neurais, diferenciando-se em vários fenótipos, tais como macrófagos, monócitos, células neurais, células cardíacas e de células pancreáticas p-, quando expostos ao nicho normal. Nossa hipótese é que CSCs também podem ser derivadas de células MIPS somente quando a exposição a um nicho maligno.
Resultados
As células MIPS cultivadas no meio condicionado de linhas celulares de cancro mostrou tumorigenicidade e angiogénese
in vivo
neste estudo, nós projetamos dois procedimentos para tratar células MIPS. células MIPS foram cultivadas sem células alimentadoras de uma mistura de MIPS médio e meio condicionado obtido a partir das seguintes linhas celulares de cancro do rato: Lewis carcinoma do pulmão (LLC), rato carcinoma embrionário (P19), melanoma do rato (B16) e carcinoma mamário de ratinho (MC .E12) durante 4 semanas. células MIPS cultivadas sob estas condições foram denominados MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-B16 cm, e as células cm MIPS-MC.E12 respectivamente. As células foram co-cultivadas também MIPS com cada linha celular de cancro que tinham sido previamente tratadas com mitomicina C como células de alimentação durante 4 semanas. Estas células MIPS foram denominados MIPS-LLCc, MIPS-P19c, MIPS-B16c e células MIPS-MC.E12c respectivamente. As células MIPS que tinham sido cultivadas com ou sem células alimentadoras sob as diferentes condições foram então transplantados para ratinhos nus. Após 4 semanas, as células MIPS formado teratomas típicos que continham tecidos diferenciados sem metástase (Fig. S1A). Em contraste, aloenxertos de ratinho de células MIPS que tinham sido tratados com células meios condicionados, MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-B16 cm e MIPS-MC.E12 cm, carcinomas indiferenciados formados que possuíam células com alta nuclear à relação citoplasmática , pleomorfismo nuclear, aberrante altas taxas de mitose, e várias figuras de mitose patológicas (Fig. 2A e S1B). Por outro lado, as células apenas MIPS-MC.E12c do grupo de co-cultura formado tumores malignos (Fig. S1B). A tumorigenicidade das diferentes células está resumida na Tabela 1. Vale ressaltar que apenas os tumores que foram derivadas de células MIPS-LLCcm mostrou características de angiogênese e micrometástases (Fig. 2A).
(A) Histologia do MIPS -LLCcm células derivadas de tumor. O fenótipo maligno tumor exibiu com hiperplasia glandular epitelial (asterisco), alta nuclear à relação citoplasmática, atipia nuclear grave e múltiplas figuras de mitose patológicas (pontas de seta, inserção) (canto superior esquerdo); micrometástases (seta, direita superior); e hipervascularização indicativo de angiogênese (canto inferior esquerdo) por coloração HE. A positiva de CD31 (anticorpo monoclonal de rato, marrom) por coloração IHC mostraram múltiplos vasos vasculares no tumor (canto inferior direito). Barras de escala: 100 mm (canto superior esquerdo e inferior), 50 mm (superior direito). (B) a cultura primária derivada de tumor MIPS-LLCcm. A cultura primária de células-tronco exibiram-like (asterisco no canto superior esquerdo) expressando GFP (canto superior direito) e células de fibroblastos-like (seta na parte superior esquerda) sem expressão GFP (canto superior direito). esferóides de células cultivadas a partir da cultura principal em suspensão (à esquerda do meio) com a expressão de GFP (médio direito). As células esferóides foram colocados de volta na cultura aderente mantida células-tronco-like (asterisco no canto inferior esquerdo) com células de fibroblasto expressão GFP (canto inferior direito) e (seta no canto inferior esquerdo) sem expressão GFP (canto inferior direito). (C) imunofluorescência para Nanog e outubro 3/4 em células esferóides. Cortes congelados de células esferóides foram coradas com os anticorpos primários (anti-coelho Nanog ou ratinho anti-oct-3/4) seguido de anticorpos secundários anti-coelho ou anti-ratinho marcado com fluoróforos Alexa 555 (vermelho) ou 488 (verde). As células foram contrastadas com DAPI (azul). Barras de escala: 20 pm. (D) Os níveis de expressão de p53, a MMP-2 e MMP-9 foram analisados por quantitativa PCR em tempo real. MIPS + LIF /-MEF, as células cultivadas MIPS com LIF no meio, mas sem células MEFfeeder; MIPS-LLCcm esferóide, as células esferóides derivados formam células MIPS-LLCcm; MIPS-LLCcm LMT esferóide, as células esferóides derivados de tumor metastático MIPS-LLCcm células do pulmão; células de carcinoma de pulmão LLC, Lewis.
As células MIPS-LLCcm tinha uma capacidade de auto-renovação
trinta a cinquenta por cento das células estavam GFP positivas nos tumores derivada de células MIPS-LLCcm enquanto que menos de cinco por cento foram positivos no teratoma diferenciada (Fig. S2). Desde GFP foi concebido sob
Nanog
promotor para expressar de forma estável apenas em células que eram indiferenciados e seriam silenciados em tecidos diferenciados [11], a maioria das células MIPS foram consideradas ser diferenciada nos teratomas. Por outro lado, os tecidos malignos implícita para conter as células estaminais indiferenciadas semelhante. As culturas primárias do tumor deve ser um método eficaz para eliminar potencialmente as células diferenciadas a fim de obter mais células estaminais-como derivados de MIPS-LLCcm. Assim, o tecido de tumor derivado de células MIPS-LLCcm foi submetido a cultura primária, a partir da qual foram observados dois tipos distintos de populações de células. Um era células estaminais do tipo que expressaram a GFP, enquanto a outra população era células de fibroblasto que não expressaram a GFP (Fig. 2B). Uma vez que as células malignas com propriedades estaminais semelhante podem ser propagadas in vitro, como esferas não aderentes [19], [20], as células foram transferidas para pratos de cultura de células não-aderentes para facilitar o crescimento de esferóides. Em suspensão, foi observada a expressão de GFP (Fig. 2B) nestas esferas de tumor, ao passo que as células do tipo fibroblasto não pode sobreviver sem adesão à parte inferior do prato e foi GFP negativo. Os esferóides derivados de tumor MIPS-LLCcm foram repetidamente tripsinizadas e confirmado para a capacidade de formar esferóides sob condição de não-aderentes. INDIVISUAL células dissociadas a partir de esferas foram capazes de formar novas esferas durante a passagem em série em cultura de tecido, o que demonstra que as células poderiam auto-renovar [21]. As esferas de tumor foram então transferidos para placas de cultura aderentes (Fig. 2B) e foram submetidos a coloração de imunofluorescência para Nanog e outubro 04/03 (Fig. 2C). A coloração positiva de outubro Nanog e 3/4, que são factores críticos para sustentar o estado indiferenciado e de auto-renovação das células estaminais [11], [21], confirmaram a expressão dos marcadores de células estaminais em esses esferóides. Um aspecto estado canceroso de células esferóides MIPS-LLCcm foi dirigida à expressão de gene p53 por RT-qPCR. Como resultado, a expressão foi encontrado regulados negativamente com o nível em células cancerosas LLC (Fig. 2D). Esta regulação baixa pode indicar a malignidade das células. Para avaliar a tumorigenicidade de células tumorais dentro das esferas, 1 × 10 × 10~4
6 destas células foram transplantadas subcutaneamente em ratinhos nus (Tabela 2). Após 4 semanas, os tumores formados e exibiram angiogénese grande (Fig. 3A), o que foi semelhante para os tumores MIPS-LLCcm derivados. No entanto, esses tumores mais agressivos apareceu devido à elevada taxa de crescimento. Para examinar o potencial metastático, 1 × 10
5 células esferóides foram injectados na veia da cauda do rato. Um mês mais tarde, múltiplos nódulos metastáticos que expressam GFP foram encontradas nos pulmões que mostram que eles eram derivados a partir de células de esferóide (Fig. 3B e 3C). E o nível de MMP-2 foi encontrada significativamente regulada nas células esferóides derivados de MIPS-LLCcm células de pulmão tumor metastático (MIPS-LLCcm LMT esferóide) (Fig. 2D), o que implicou que as células MIPS-LLCcm possuem o potencial metastático causado por indução de expressão de MMP-2, e a população de células altamente metastáticas podem ser isoladas a partir de células MIPS-LLCcm através panning in vivo.
(a) Histologia do tumor derivado de células esferóides. O tumor mostrou alguma estrutura glandular (asteriscos) com várias figuras patológicas mitóticas (pontas de seta, inserir) (à esquerda), altas taxas de mitose (pontas de seta em meio), e hipervascularização (direita) por coloração HE. Barras de escala: 100 mm. (B) a metástase do pulmão após injecção na veia da cauda de células esferóides. Os pulmões foram ocupada por nódulos tumorais metastáticas. (C) As metástases mostraram uma estrutura glandular (asteriscos) com várias figuras de mitose patológicas (pontas de seta em cima à esquerda); hipervascularização (canto superior direito); invasão no tecido do parênquima pulmonar (canto inferior esquerdo) por coloração HE. A expressão de GFP (anticorpo policlonal de coelho, marrom) foi encontrado nesses nódulos metastáticos por coloração IHC (canto inferior direito). T, tumor; G, tecido pulmonar. Barras de escala: 100 mm. (D) A imuno-histoquímica de CK e localização GFP em tumores derivados de MIPS, MIPS-LLCcm e células esferóides. Cortes seriados foram corados com CK (anticorpo monoclonal de rato, marrom) e GFP (anticorpo policlonal de coelho, marrom) e contrastadas com hematoxilina. região glandular foram CK positivo, mas GFP negativo nos tumores. Barras de escala: 100 mm.
O tumor derivado de células MIPS-LLCcm foram compostas de adenocarcinomas e células tumorais indiferenciadas abundantes
Em seguida, investigaram o tipo de tumor maligno por IHC. Pan-citoqueratina (CK, um epitelial células tumorais marcador), vimentina (um marcador de tumor de origem mesenquimal), α-actina (um marcador de tumor miogénico), CD31 (um marcador para a vasculogénese), NF-M e GFAP (marcadores de neurogénica tumor) foram utilizados para corar os tumores (dados não mostrados). CK foi encontrado para ser fortemente coradas nos tumores. A expressão de CK e GFP foi então avaliada em várias seções de série. regiões glandulares foram CK positivo, mas estas células foram GFP negativo nos tumores (Fig. 3D). Trinta a cinquenta por cento das células tumorais foram positivas GFP nos tumores que tinham sido derivadas de ambas as células MIPS-LLCcm e células primárias esferóides enquanto não há regiões foram GFP positivas no teratoma. Portanto, estes tumores foram julgados adenocarcinomas misturadas com células tumorais indiferenciadas abundantes.
As células derivadas expressaram os marcadores de células-tronco embrionárias
marcadores de células-tronco embrionárias e os quatro fatores de transcrição que foram transduzidas foram então verificados por transcrição reversa PCR (RT-PCR) quantitativa e PCR em tempo real (RT-qPCR). células MIPS-LLCcm e células esferóides mostraram expressão dos marcadores de células estaminais embrionárias (Fig. 4A), mas os níveis de expressão eram um pouco diferente entre estas células de tumor e as células MIPS originais (Fig. 4C). Especificamente, por RT-qPCR
Nanog
e
Rex1
foram significativamente elevados em células tumorais MIPS-LLCcm, em culturas primárias derivadas de tumores ou estas nas culturas esferóides, em comparação com as células MIPS cultivadas na ausência ou na presença de células alimentadoras. Em contraste, a expressão dos quatro factores de transcrição foi encontrado para ser diminuída em vários graus em ambas as células MIPS-LLCcm e células de esferóide conforme comparado com as células MIPS que foram propagadas em células de alimentação (fig. 4B e 4D).
análise (A) RT-PCR da expressão do gene marcador de células estaminais embrionárias. (B) Análise de RT-PCR dos quatro factores de transcrição Mips. Os produtos de PCR foram as regiões de codificação (total), transcritos endógenos única (Endo.), E transcritos de transgene apenas (Tg). níveis (C) A expressão do gene marcador de células estaminais embrionárias foram analisados por quantitativa PCR em tempo real. (D) Os níveis de expressão dos quatro fatores de transcrição celular MIPS foram analisados por quantitativa PCR em tempo real.
Discussão
As células MIPS-LLCcm mostrou a formação esferóide em cultura de suspensão, um elevado potencial tumorigénico em diluições limitadas e um elevado potencial metastático, que foram todos consistentes com as características básicas de CSCs [19], [22], [23]. o crescimento do tumor rápida requer angiogênese de novo em que o nicho vascular fornece sinais de promoção do crescimento. Os tumores derivados de células MIPS-LLCcm incluindo as células esferóides também mostrou um elevado grau de angiogénese, que não foi observado nos teratomas derivadas de células Mips. A estreita associação da CSCs e vasos sanguíneos foi anteriormente documentado no sistema nervoso e estes nichos vasculares ajudar na manutenção de CSCs [24]. IFN-y, uma importante molécula reguladora negativa da angiogénese, foi mostrado para regular negativamente a expressão de MMP, inibem a migração de células endoteliais, bem como induzir o factor angiostático PI-10 através de activate via de sinal de JAK-STAT [25]. avaliação Microarray comparando as células MIPS e células MIPS-LLCcm mostrou down-regulação da IFNγR em células MIPS-LLCcm (Materiais e Métodos S1, Tabela S1), que pode ser responsável pela angiogênese em células MIPS-LLCcm tumor derivadas. maior expressão de MMP-2 em células MIPS-LLCcm LMT dando o potencial metastático de células MIPS-LLCcm pode ser resultado de uma redução IFNγR, embora uma análise mais aprofundada são obrigatórios. células de tomar a regulação negativa da MMP-9 expressão do gene em ambos os MIPS-LLCcm e MIPS-LLCcm LMT em consideração, MMP-2 parece responsável pela angiogênese e metástase neste estudo.
auto-renovação é frequentemente citada como uma característica de CSCs. No entanto, existem limitações técnicas para avaliar rigorosamente auto-renovação. Para as células estaminais de tecidos normais, o teste padrão de auto-renovação exige a clonal na demonstração in vivo de auto-renovação e diferenciação de multi-linhagem em transplantes primárias de células estaminais, seguida de demonstração de as mesmas propriedades em transplantes de série das mesmas células. A auto-renovação das células cancerosas tumorigénicas tem sido geralmente avaliada pela demonstração de transplantability série de tumores policlonais e pela demonstração de uma heterogeneidade fenotipica semelhante nos xenoenxertos de tumor progenitoras e progénie [26]. A sequência de experiências usando células MIPS-LLCcm que foram derivadas de tumores primários e sua subcultura repetida como esferóides demonstrado a capacidade de auto-renovação das células MIPS-LLCcm obtenção de tumores secundários exibem a mesma histologia e fenótipo como os tumores primários [21] .
Além disso,
Nanog
, um marcador amplamente associado com ‘stemness “ainda foi expressa em níveis mais elevados nas células MIPS-LLCcm e células esferóides comparação com as células MIPS.
Nodal
e
Cripto1 Quais são morphogens embrionárias, que são responsáveis para o maintaince de pluripotência /auto-renovação em células-tronco embrionárias e executam um papel fundamental na manutenção do estado indiferenciado de células [7]. Em células MIPS-LLCcm,
Nodal
e
Cripto1
níveis de expressão foram significativamente maiores em comparação com células MIPS, o que confirmou o estado relativamente indiferenciado das células MIPS-LLCcm. A diminuição da expressão nodal por 70% em células de esferóides provavelmente demonstrou a diferenciação de células de esferóide a partir de células estaminais pluripotentes para células estaminais unipotentes como CSCs. Observou-se uma significativa diminuição da regulação dos marcadores de células estaminais em teratomas que foram derivadas de células MIPS uma vez que estes tumores contêm misturado populações de diferentes tipos de células diferenciadas. Em contraste, em tumores derivados de células de MIPS-LLCcm e células esferóides, os níveis de expressão destes marcadores também diminuiu, mas manteve-se muito mais elevado do que aqueles em teratomas. Estes resultados, que eram consistentes com os de IHC, implica que houve uma certa quantidade das CSCs nos tumores malignos, enquanto quase todas as células foram diferenciadas nos teratomas.
As células tumorais desenvolvidos neste estudo a partir de células MIPS cresceu como esferóides em cultura em suspensão, mostrou um elevado potencial e angiogênese tumorigénico e metastático in vivo. Além disso, a capacidade de auto-renovação e manutenção de um estado indiferenciado como avaliado por expressão de marcadores que estão associados a células estaminais embrionárias sugerem que estas células MIPS-LLCcm primárias e as células esferóides que foram derivadas de células MIPS-LLCcm conter uma alta proporção de CSCs. Scaffidi e Misteli relataram recentemente a produção de células-CSC, como a partir de fibroblastos, que podem ser rastreados para células estaminais somáticas [27]. Eles transduzidas genes oncogénicos de antígenos hTERT, H-Ras V12 e SV40 T para produzir células CSC-como pela reprogramação. Deve ser digno de nota que o nosso modelo de CSC foi desenvolvido sem o uso de transdução do gene. Este é o primeiro relatório de demonstrar o desenvolvimento de uma população de células CSCs MIPS que podem ser alcançados por factores que são secretadas por células tumorais, embora a identidade destes factor solúvel (s) permanece desconhecida. Introduzida exogenamente
C-myc nas células
MIPS podem contribuir para a transformação desde reactivação de
C-myc
realizada por um retrovírus foi considerado para ser associada com a formação de tumor em 20% dos ratos quiméricos [11]. Além disso, a expressão gotejante destes transgenes podem também inibir a diferenciação completa de células e maturação MIPS, levando a um maior risco de formação de teratoma imaturo [28]. No entanto, nossos resultados mostraram que os transgenes que foram usados para gerar células MIPS foram quase completamente silenciosa em células MIPS-LLCcm e células esferóides em comparação com células MIPS cultivadas em células alimentadoras e que os dois oncogenes,
C-myc
e
KLF4
, foram drasticamente diminuída nas células MIPS-LLCcm e células esferóides. Isto sugere que os transgenes podem não ser os principais fatores responsáveis pela transformação das células MIPS neste modelo atual. Além disso, devido à ausência de formação de tumores foi observada nos casos de MIPS-P19c, -B16c, e de nenhum sobrevivente de MIPS-LLCc, que foram todos no “grupo de co-cultura”, deve haver pouca possibilidade de a transferência ou contribuição de vírus tumorais mouse na tumorigenicidade de células MIPS cultivadas no meio condicionado. Tendo em vista a ausência de tumorigenicidade nestas células no grupo de co-cultura, a condição não-óptima de cultura iPS deve ser difícil para explicar a conversão de célula MIPS Considerando a possibilidade de a transfecção virai continua a ser nos casos de MIPS-MC.E12 centímetros e -MC.E12c [29]. Além disso, quatro obras independentes relatório sobre análises genômicas de iPS e revelam uma presença preocupante de mutações nestas células [30] – [33], que pode ser MIPS sinalização é mais fácil de ser afetado pelo fator solúvel (s) existia no microambiente do tumor . Os exossomas 40-100 são vesículas de membrana bilipídica nm que são secretadas pela maioria dos tipos de células. Eles são pensados para mediar a comunicação célula-célula e facilitar os processos biológicos, tais como o crescimento celular e transformação maligna [34], [35]. Com base nos relatos recentes de exossomos tumorais [36], [37], vale a pena esclarecer o papel significativo dos exossomos secretados a partir de células LLC na conversão de células MIPS para CSCs. Além disso, a nossa descoberta de downregluration da expressão do gene p53 em células MIPS-LLCcm indica que a rede p53 perturbada é um dos mecanismos de conversão de células para os CSCs MIPS. Tem sido relatado que células tumorais podem inibir a indução de p53 em fibroblastos adjacente [38]. É interessante notar que um mecanismo de supressão este deve depender o factor segregado a partir de células tumorais, mas não em interacção directa célula-a-célula. Definição e Caracterização das alterações genéticas e os factores segregados no microambiente tumoral, que convertem células MIPS a um CSC vai ser eficaz para o desenvolvimento de terapias anti-cancerosas novos.
A expressão de marcadores específicos da superfície celular possui sido amplamente utilizada para identificar CSCs. Alguns destes marcadores de superfície são conhecidas por serem comuns a diferentes CSCs população. No entanto, estes marcadores podem ainda ser associado com as células estaminais normais [1]. Diferencialmente expressos marcadores de superfície que podem distinguir células estaminais normais de CSCs são largamente desconhecido [19]. É imperativo identificar marcadores que podem distinguir entre CSCs e de células estaminais normais. Este modelo celular neste documento deve servir como uma ferramenta viável para identificar marcadores de boa-fé potencialmente de CSCs. Esses marcadores podem ser potenciais alvos para o desenvolvimento de novas terapias contra CSCs sem afectar negativamente as funções das células-tronco normais.
Materiais e Métodos
cultura celular
Mouse células-tronco pluripotentes induzidas (MIPS; nome da célula: iPS-MEF-Ng-20D-17; Lote No. 012) foram adquiridos da Riken Cell Bank (Japão) e foram mantidas em meio (DMEM contendo 15% de FCS, 0,1 mM de NEAA, 2 mM de L- glutamina, mM de 2-mercaptoetanol 0,1, 1.000 U /ml LIF, 50 U /ml de penicilina e 50 U /mL de estreptomicina) em camadas alimentadoras de células de ratinho-tratadas com mitomicina-C fibroblasto embrionário (MEF) (Reprocell, Japão). cancro do pulmão de rato Lewis (LLC), as células foram adquiridos a partir de ATCC (EUA) e foram mantidas em DMEM contendo 10% de FCS; células de carcinoma embrionário de rato (P19) foram adquiridos da Riken Cell Bank (Japão) e foram mantidas em aMEM contendo 10% de FCS; células de melanoma de rato (B16 /BL6) (ATCC, EUA) e células de tumor mamário de ratinho (Balb-MC.E12) (Riken Cell Bank, Japão) foram mantidas em MEM contendo FCS a 10%.
Para preparar condicionado médio (CM) a partir das diferentes linhas celulares de cancro do rato, o meio foi recolhido a partir de pratos confluentes e filtrada utilizando filtro de 0,45 um (Millipore, Irlanda). Em seguida, 3 ml de CM foram adicionados a 3,5 centímetros durante a noite prato para confirmar que não havia sobreviventes células cancerosas em CM. Para as experiências de meio condicionado, as células MIPS (sem células alimentadoras MEF) foram mantidas em meio sem LIF descrita acima. Metade do meio foi mudado todos os dias com CM durante 4 semanas. células MIPS sem tratamento com CM foram utilizados como controle. Para as experiências de co-cultura, as linhagens de células tumorais de rato foram tratadas com 0,4 ug /ml de mitomicina C (Sigma, EUA) e foram depois utilizadas como células de alimentação e co-cultivadas com células MIPS (sem células alimentadoras MEF) durante 4 semanas. células MIPS foram passadas a cada 3 dias e de células morfologia foi fotografada usando um microscópio Olympus IX81 equipado com um dispositivo de luz de fluorescência (Olympus, Japão).
Para a cultura principal, enxertos de rato foram cortadas em pedaços pequenos (aproximadamente 1 mm
3) em HBSS. Após lavagem por três vezes, os tecidos foram transferidos para um tubo de 15 ml com 0,25% de tripsina de 5-6 vezes o volume a 37 ° C durante 40 min. Cinco microlitros de meio DMEM contendo 10% de FCS, em seguida, foi adicionado para terminar a digestão. A suspensão celular foi então colocada em um novo tubo e centrifugado a 1000 rpm durante 10 min. O sedimento celular foi ressuspenso em 5 mL de HBSS e centrifugou-se a 1000 rpm durante 5 min. O sedimento celular foi então colocada em um volume apropriado de meio de MIPS sem LIF e as células foram semeadas numa placa a uma densidade de 5 x 10
5 /ml. As células foram passadas a cada 3 dias e as células morfologia foi observadas e fotografadas utilizando Olympus IX81 microscópio equipado com um dispositivo de fluorescência de luz (Olympus, Japão).
As culturas em suspensão para gerar esferóides foram realizados como descrito em Dontu et al [39 ]. Resumidamente, as células individuais foram plaqueados em pratos não revestidos (prato de cultura bacteriana) a uma densidade de 2 × 10
4 /ml em cultura primária. As células foram cultivadas em meio isento de soro MIPS sem LIF. células esferóides foram recolhidos por centrifugação suave (500 rpm) após 7-10 dias e dissociado enzimaticamente (0,025% de tripsina /EDTA).
Experiências com animais
camundongos Nude (Balb /c Slc
-nu /nu
, fêmea, 6~8 semanas) foram adquiridos a Charlesriver, Japão. O plano de experiências com animais foi analisado e aprovado pelo comitê de ética em experimentação animal da Universidade de Okayama sob a IDs Oku-2008211, Oku-2009144, Oku-2010179 e Oku-2011-305.
Para os estudos de transplante, células (mostrados na Tabela 1 e 2) foram suspensos em 100 ul de DMEM contendo FCS a 10% e injectado subcutaneamente em ratinhos nus. Após 4 semanas, os tumores foram excisados e fixados em solução de tampão de formalina neutra a 10% (Wako, Japão).
Para estudos de micrometástases, 1 × 10
5 esferóides de células MIPS-LLCcm foram suspensos em 100 ul DMEM contendo FCS a 10% e injectado na veia da cauda do rato nu (n = 6).
a análise histológica e imuno-histoquímica (IHC)
Os tumores foram fixados durante 24 horas e, em seguida, processada utilizando uma cera de rotina procedimento Embedding para exame histológico. Três seções espessas micrômetros foram corados com hematoxilina e eosina (HE).
IHC para GFP, pan-Cytokeratin, Vimentin, α-actina, CD31, NF-M, GFAP foi realizada utilizando tecido embebido em parafina fixado em formalina secções e procedimentos normalizados. Resumidamente, 3 uM secções de tecido foram desparafinadas e antigénio recuperado foi realizada usando a exposição de microondas a 95 ° C durante 5 minutos num tampão de citrato (pH 6,0) ou de incubação em proteinase K (40 ug /ml) a 37 ° C durante 30 minutos.