Abstract

O câncer de ovário é um tumor maligno reativa imune com uma rede de supressão imunológica complexa que embota a erradicação imunológica bem sucedida. Este microambiente supressora pode ser mediada por recrutamento ou indução de células T CD4

+ células T reguladoras (Tregs). Nosso estudo procurou investigar a associação de CD4 infiltrantes de tumor

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs, e outros fatores imunes, com o resultado clínico em pacientes com câncer de ovário seroso. Foi realizada imunofluorescência e quantificação das Tregs positivos triple-se infiltram no tumor intra-epitelial (CD4

+ CD25

+ FOXP3

+), bem como CD4

+ CD25

+ FOXP3

-, CD3

+ e CD8

células T + em amostras de tumores de 52 pacientes com alto estágio carcinoma do ovário seroso. Trinta e um dos pacientes tiveram boa sobrevida (ou seja, 60 meses) e 21 tiveram pior sobrevida de 18 meses. as contagens totais de células, bem como índices celulares foram comparadas entre estes dois grupos de resultados. Os números totais de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs, CD4

+ CD25

+ FOXP3

-, CD3

+ e CD8

+ células foram não foi significativamente diferente entre os grupos. No entanto, os rácios mais elevados de CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg, CD8

+ /CD4

+ e CD8 /CD4

+ CD25

+ FOXP3

– as células foram vistos no grupo bom resultado quando comparado com os pacientes com pior prognóstico. Estes dados mostram pela primeira vez que os rácios de CD8

+ tanto CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs e CD4

+ CD25

+ FOXP3

– As células T estão associados com a evolução da doença no cancro do ovário. A associação de ser aparente em proporções, em vez de contagem absoluta de células T sugere que a razão efector /supressor pode ser um indicador mais importante de resultado do que a contagem de células individuais. Assim, as estratégias de imunoterapia que modificam a razão de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs ou CD4

+ CD25

+ FOXP3

– as células T para CD8

+ efetoras As células podem ser úteis na melhoria dos resultados em câncer de ovário

Citation:. Preston CC, Maurer MJ, Oberg aL, Visscher DW, Kalli KR, Hartmann LC, et al. (2013) os rácios de CD8

+ células T CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ e FOXP3

– Células T correlacionar com prognóstico clínico em câncer de ovário seroso humano. PLoS ONE 8 (11): e80063. doi: 10.1371 /journal.pone.0080063

editor: Muriel Moser, Universidade Livre de Bruxelas, Bélgica

Recebido: 14 Agosto, 2013; Aceito: 08 de outubro de 2013; Publicação: 14 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Preston et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações para KLK, ELG, LCH: P50-CA116201, R01-CA122443, e financiadores P50-CA136393.The teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário tem a maior taxa de mortalidade de cancros exclusivos para mulheres. Apesar de muitos esforços terapêuticos, utilizando novos agentes quimioterápicos, a taxa de cura não melhorou substancialmente nas últimas décadas [1-3]. É bem conhecido que os resultados clínicos em cancro do ovário são muito heterogéneas e não é facilmente previsto por características clínicas e patológicas padrão (por exemplo, o grau, a histologia do tumor) [4-6]. Isso sugere que pode haver outros microambiente do tumor ou do hospedeiro características com um papel dominante na sobrevivência. Nos últimos anos, tem havido um interesse na compreensão do papel da resposta imune do paciente para o seu cancro do ovário, como a doença é pensado para ser uma malignidade reactivo naturalmente imunes com uma rede de supressão complexo que embota efectivamente imune erradicação bem sucedida. Durante a última década, estudos demonstraram a importância do sistema imunológico em afetar o resultado do paciente. Notavelmente, Zhang e colegas publicaram um estudo que mostrou que a maioria dos pacientes com câncer ovariano teve CD3 infiltrantes do tumor

+ T células e que a infiltração foi positivamente associado com a sobrevivência [7]. A presença de células T foi particularmente benéfico para aqueles indivíduos que apresentaram uma resposta clínica completa a cirurgia e quimioterapia, em que a sobrevivência de cinco anos foi de 74% em comparação com 12% para aqueles sem células T. Estudos subsequentes têm refinado nossa compreensão das células T intra-tumorais, tais como o trabalho por Sato et ai., que mostrou que os pacientes que apresentavam elevados níveis de infiltração de linfócitos T citotóxicos (CTL) tiveram uma sobrevivência média de 55 meses versus aqueles com poucos ou não CTL que tiveram uma sobrevida de 26 meses [8]. Uma característica única das estratégias terapêuticas convencionais para o câncer de ovário é que a função das células T é rapidamente recuperado após quimioterapia convencional [9]. Os antígenos aos quais os pacientes são naturalmente responder agora estão sendo sistematicamente estudadas [10,11]. Colectivamente, estes resultados mostram que a imunidade anti-tumor é provocada contra o câncer e impactos O curso clínico da doença de ovário. No entanto, é agora evidente que a imunidade anti-tumoral é contrabalançada por um microambiente supressora imune [7,12-15].

Um dos factores celulares que podem mediar essa supressão imune no microambiente tumoral é a população de células T reguladoras (Treg). Investigação sobre Tregs tem avançado rapidamente, especialmente no contexto do cancro. Treg CD4 são um heterogénea

+ subpopulação de células T, cuja função principal é a regulação imunitária por bloqueio da função das células T activadas. CD4

+ Tregs pode ser dividido em dois subconjuntos principais: ocorrência natural Tregs com um CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ fenótipo e induzida Tregs com uma expressão de CD25 variável [12]. Estudos anteriores demonstraram que a caixa forkhead P3 (FOXP3) é um factor de transcrição que regula o centro de desenvolvimento e função de células T CD4

+ Tregs [16,17]. Além disso, estudos demonstraram também que a expressão de CD25, um componente do receptor de elevada afinidade de IL-2, é essencial para a sobrevivência Treg, que é altamente dependente de IL-2 [18,19]. Na última década, tem havido vários estudos que associam Tregs com a sobrevivência em muitos tipos de câncer. No câncer de ovário, Curiel e seus colegas inicialmente mostrou uma forte associação de CD4

+ CD25

+ T células com a sobrevivência pobre [14]. De nota, o papel específico de triplo manchado CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ T células não foi avaliada. Alguns anos mais tarde, Sato e colegas não conseguiram ver qualquer associação direta de CD25

+ FOXP3

+ T células de cancro do ovário, mas mostrou que o total CD8

+ contagem de células T baixo e CD8

+ /CD25

+ FOXP3

+ T foram associados com pior sobrevida, mais uma vez em uma população com histologia diferentes [8]. No entanto um estudo mais recente, Milne e colegas mostraram, no câncer de ovário seroso de alto grau, que a contagem de células intra-epitelial isoladamente coradas para FOXP3

+ foi associada com muito melhorada sobrevivência [20]. No entanto, o estudo não definir especificamente o tipo de célula expressando FOXP3. Uma vez que outras células para além de células T expressa Foxp3 (por exemplo, células tumorais e células B), o significado de que o trabalho, enquanto que interessante, permanece incerto [21,22]. Além disso, uma vez que ambos CD8

+ e CD4

+, regulamentar e

In vitro

células T activadas são conhecidos por expressa Foxp3, a identidade específica do tipo de célula envolvida na modificação de sobrevivência é desconhecido. No entanto, mais recentemente, Kryczek e colegas demonstraram que, em tumores primários ou de lesões auto-imunes, FOXP3 e CD25 é um conjunto de marcadores altamente específico e fiável para CD4 humano primário

+ Tregs [23].

O foco principal do nosso estudo foi examinar a associação de tumor infiltrando CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs e outras células T com o resultado clínico em pacientes com câncer de ovário epiteliais, desde esta abordagem da coloração tripla não foi feito em tumores do ovário com o melhor de nosso conhecimento. Especificamente, foi estudada uma coorte único, limitado a pacientes com estágio avançado de câncer de ovário seroso (a histologia mais comum e mais letal), composto de dois subgrupos de pacientes com resultados clínicos muito divergentes, uma com muito pobre sobrevivência ( 18 meses) e outro de pacientes com muito melhor sobrevida ( 60 meses).

Materiais e Métodos

pacientes e características clínicas

o estudo foi aprovado pela clínica Mayo Institutional Review Board e todos os pacientes assinaram termo de consentimento para o uso de espécimes pesquisa. Os cálculos de energia foram feitas através de simulação para estimar o número de amostras necessárias para detectar uma diferença significativa de sobrevivência em pacientes com câncer de ovário. Cinquenta e dois pacientes, escolhidos a partir de grupos de resultados díspares com mau resultado ( 18 meses de sobrevida) e bom resultado ( 60 meses de sobrevivência), desde 82,5% de energia em um alfa de 0,05 para detectar uma taxa de sobrevivência perigo global de 1,65 entre dicotômica CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ agrupamentos Treg em todos os pacientes com câncer ovariano. Isso se traduz em pelo menos 80 energia% para detectar um tamanho de efeito (alteração no número ou proporção de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs) de 0,8 ao avaliar Tregs entre os dois grupos de resultados díspares com má resultado (

n

= 21) e bom resultado (

n

= 31) com um teste de Kruskall Wallace, conforme realizado neste estudo. Todas as amostras foram selecionados de pacientes com optimamente debulked, alto estágio, ovário seroso, trompa de Falópio ou carcinoma peritoneal primário.

Coloração e imunofluorescência análise das amostras de tecido

Todos os blocos de amostras congeladas, incorporado anteriormente em Tissue-Tek outubro (Sakura Finetek, Torrance, CA), foram criosseccionada (5um), fixadas em acetona durante 10 minutos, seco ao ar durante 1 hora e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. Antes da coloração, todas as lâminas foram bloqueadas durante 10 minutos à temperatura ambiente (25 ° C) com bloco de proteína livre de soro (Dako, Carpinteria, CA) e depois lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS). A coloração foi realizada por incubação das lâminas à temperatura ambiente (25 ° C) em câmaras húmidas escuras durante 2 horas com anticorpos primários diluídos em diluente de reagente de anticorpo (Dako, Carpinteria, CA). Policlonal de coelho anti-humano FOXP3 (Abcam, Cambridge, MA) foi utilizado a uma diluição de 1:75, monoclonal de ratinho anti-humano CD4 (Abcam, Cambridge, MA) a 1: 100, de rato monoclonal de CD25 anti-humano (Serotec Abd, Raleigh, NC) a 1: 100, monoclonal de murganho anti-CD8 humano (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 1: 100, e anticorpo monoclonal de ratinho anti-CD3 humano (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 1:50. Após coloração com anticorpos primários, as lâminas foram em seguida lavadas durante 15 minutos com PBS e incubadas durante 1 hora numa câmara escura húmida com os anticorpos secundários (Alexa Fluor 405, 488 e 594 conjugados, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) a um diluição de 1: 500. Anticorpos para FOXP3, CD4 e CD25 foram utilizados para a coloração tripla de Tregs enquanto que os anticorpos para CD3 e CD8 foram utilizados como manchas únicas. Isoladamente células coradas também foram contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, a 100 ng /ml) durante 30 minutos. tecido tonsilar humano foi usado como um controle positivo e os controlos negativos foram realizados por omitindo o anticorpo primário e a utilização de controlos de isotipo para cada anticorpo.

confocal microscopia e celular quantificação

As lâminas coradas foram avaliadas em um LSM 510 microscópio confocal de varredura a laser (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Oberkochen, Alemanha). células coradas intraepiteliais foram avaliados com ampliação campos de alta potência digitalizadas das seções epiteliais aleatórios evitando áreas do estroma. Os campos digitalizados foram espaçadas para evitar sobreposições e branqueamento e para cobrir a seção do tumor inteiro. Vinte campos aleatórios (300 mm

2) foram fotografadas digitalmente para cada amostra. A quantificação de células positivas foi realizada manualmente por observadores cegos para toda a informação clínica. Um subconjunto de amostras selecionadas aleatoriamente foram revisados ​​por um observador secundário. As contagens totais de células de cada campo foram registrados tanto no triplo manchado coradas amostras (CD8 ou CD3) (CD4, CD25 e FOXP3) ou single.

Quando as amostras de tumor foram examinados grosseiramente sob microscopia confocal, os linfócitos infiltrantes de tumor foram observadas tanto no estroma e epitélio. Assim, muita atenção foi pago para estabelecer os campos de contagem exclusivamente nas áreas epiteliais. As seguintes células foram quantificados nas amostras manchadas triplos e utilizados na análise: CD4

+ CD25

+ FOXP3

+, CD4

+ CD25

+ FOXP3

-, CD4

+ CD25

-FOXP3

-, CD4

+ CD25

-FOXP3

+, CD4

-CD25

+ FOXP3

+, CD8

+ DAPI

+ e CD3

+ DAPI

+. tumor intra-epitelial infiltrando Tregs foram definidos como CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ células, com CD4 (sinal vermelho) e CD25 (sinal verde) manchas detectadas nas áreas citosólicas e de membrana dando uma laranja e /ou teste padrão amarelo e FOXP3 (sinal azul) detectado como um padrão intra-nuclear e, normalmente, pontilhada de manchas. A avaliação primária de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg quantificação foi contar o Treg total em todos os 20 imagens a partir de uma amostra de tumor. Isto foi feito, em contraste com os estudos anteriores que geralmente quantificados usando Tregs áreas focais identificado pelo utilizador de infiltração [8,14]. Foi testada a eficácia destas abordagens anteriores também por meio de medidas secundárias para cada tumor, ou seja, a maior quantidade de uma única imagem a partir de uma amostra de tumor (max1) e a soma dos três maiores contagens de uma amostra de tumor (MAX3).

isolamento dos linfócitos infiltrantes de tumor

Em uma investigação mais aprofundada, os linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) foram colhidas a partir de seis tumores ovarianos e isoladas por gradiente de Ficoll descontínua, como descrito anteriormente [24]. Resumidamente, os linfócitos foram separados das células tumorais por centrifugação da suspensão de células sobre uma camada de dois gradiente de Ficoll, 100% camada sobre a camada de fundo e 75% em cima. Os TIL isoladas foram depois coradas para a análise de citometria de fluxo, tal como descrito abaixo.

A citometria de fluxo

superfície celular e coloração marcador intracelular foi realizada em TIL isoladas (1 x 10

6) como descrito anteriormente [25]. Foram realizados dois conjuntos de experimentos; no primeiro set células estimuladas-un foram coradas com os seguintes anticorpos conjugados: CD3-PE-Cy7, azuis CD4-Pacífico, CD8-Alexa Fluor 700, CD1c-APC, BDCA2-FITC e CD68-PerCP-Cy5.5. Na segunda, montamos células un-estimuladas e estimuladas coradas para CD4-Pacífico azul, CD25-PE, FOXP3-Alexa Fluor 647 e TGF-β-PE-Cy7. Antes da coloração TILs foram estimuladas por incubação com 5 ug /mL de concanavalina-A (Con-A, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) e 0.7μl /ml BD GolgiStop ™ (BD Bioscience, San Jose, CA) durante 8 horas, em seguida, lavadas, contadas e ressuspensas em tampão de FACS (PBS com 1 mM /L de EDTA e 3% de albumina de soro bovino). FOXP3 e citocina coloração foi levada a cabo de acordo com o protocolo de coloração intracelular do fabricante (eBioscience, San Diego, CA). Os anticorpos do isotipo apropriadas foram utilizados como controlos. Todos os anticorpos foram adquiridos a BD Bioscience (San José, CA), excepto para os anticorpos seguintes: TGF-β-PE-Cy7 e CD3-PE-Cy7 foram de eBioscience (San Diego, CA), BDCA2-FITC da Miltenyi Biotec (Auburn , CA) e CD68-PerCP-Cy5.5 foi adquirida a partir de BioLegend (San Diego, CA). As amostras foram executados em um FACS Varredura II e analisados ​​utilizando FlowJo 10.0.5.

Análise de dados

A distribuição de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ contagens Treg entre os pacientes com bom e mau resultado foram examinados de forma gráfica e comparados utilizando testes-Wilcoxon (Mann-Whitney

U

teste). Os rácios foram calculados como o número de células T CD8

+ células dividido pelo número de células T CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs para um determinado paciente. As contagens de células são resumidas como mediana e intervalo interquartil (IQR). Para comparações de pares de citometria de fluxo de dados, foi utilizado o teste t de Student emparelhado. A significância estatística foi fixado em um valor de p ≤ 0,05.

Resultados

As características clínicas dos pacientes

Cinqüenta e duas amostras de tumores que preencheram os critérios do estudo foram selecionados do banco de tecidos. As características dos pacientes estão resumidas na Tabela 1. A idade mediana dos pacientes do estudo foi de 65 anos (gama, 37-86 anos). Todos os pacientes foram diagnosticados com estágio avançado (71% estágio III, 29% estágio IV) da doença, foram otimamente debulked, e tinham tumores com morfologia serosa. A sobrevida média do grupo mau resultado foi de 12,4 meses (variação de 3,0-16,7) e sobrevida mediana no grupo bom resultado ainda não foi alcançado com 73,8 meses seguimento médio (intervalo 60,1-116,8).

bom resultado

mau resultado

(

n

= 31) (

n

= 21) P-valueAge em DiagnosisMedian62.069.00.0059Range (37,0-80,0) (50,0-86,0) StageIII23 (74,2%) 14 (66,7%) 0.56IV8 (25,8%) 7 (33,3%) GradeLow3 (9,7%) 0 (0,0%) 0.20High28 (90,3%) 21 (100 %) StatusAlive24 Vital (77,4%) 0 (0,0%) NADead7 (22,6%) 21 (100,0%) Primeira Linha ChemotherapyPlatinum2 (6,5%) 1 (4,8%) e 0.20Platinum Taxane27 (87,1%) 15 (71,4%) Outro2 (6,5%) 5 (23,8%) Tabela 1. Características dos pacientes of Good desfecho 60 sobrevivência mês, resultado ruim sobrevivência 18 meses; todos os casos eram cancros serosa e optimamente cytoreduced. CSV Baixar CSV

A enumeração de células T que se infiltram no tumor intra-epitelial

intraepiteliais células infiltrantes (CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs, CD4

+, CD8

+, CD3

+, CD4

+ CD25

+ FOXP3

– e CD4

+ CD25

-FOXP3

+) foram quantificados e analisados ​​em todos os campos. campos digitalizados representativas de tumor infiltrantes putativo CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs, bem como CD4

+ CD25

+ FOXP3

– são mostrados na Figura 1A. A Figura 1B mostra representativa CD8

+ e CD3 infiltração de células

+ T. A análise revelou uma correlação linear modesto, mas estatisticamente significativa entre a contagem de CD3

+ células T e CD4

+ ou CD8 +

T (Figura 1C).

(A) Foto de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs em amostras de tumor de ovário. painel superior esquerdo mostra a expressão CD4 (sinal vermelho), painel superior direito mostra a expressão de CD25 (sinal verde), o painel inferior esquerda mostra a expressão FOXP3 (sinal azul) e painel inferior direito mostra os sinais combinados com setas apontando para triplicar manchado CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs. Nesta foto Tregs são vistos em contacto próximo com CD4

+ CD25

+ FOXP3

– células. (B) Foto de intraepitelial infiltrando CD8

+ células T citotóxicas (painel esquerdo) e CD3

+ linfócitos (painel direito) no câncer de ovário. Essa verificação representativa mostra a expressão CD8 e CD3 (sinal vermelho = CD8 ou CD3, sinal azul = DAPI) em massa do tumor de ovário. (C) curva de correlação comparando CD3 conta, quer CD8 (símbolos a cheio) e contagens de CD4 (símbolos abertos). Os símbolos representam a soma dos 20 campos contados por um único paciente. Todos os pacientes são representados. As linhas de inserção são o produto de análise de regressão linear. (D) mostra a média geral (± SEM,

n

= 52) CD3

+, CD4

+ e CD8

+ T contagens de células (soma de 20 campos) para todos pacientes. (E) curva de correlação comparando o total de Treg (ou seja CD4

+ CD25

+ Foxp3

+) conta com a soma dos 3 campos máximos (Max3) ou a contagem de campo máxima (max1). Os símbolos representam a soma dos 20 campos contados por um único paciente. Todos os pacientes são representados. As linhas de inserção são linhas de regressão por mínimos quadrados.

Tendo em conta que estudos anteriores examinaram e enumerou campos de células T não aleatória enriquecido, examinamos a validade desta abordagem, avaliando a correlação entre o total de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ contagem Treg em todos os 20 campos e as max1 e Max3 contagens. Como mostrado na Figura 1D, houve correlações estatisticamente significativas muito fortes, o que sugere que as abordagens anteriores para enumerar células T infiltrantes são em grande medida válidos.

contagem de células T não se correlacionam diretamente com a evolução clínica em câncer de ovário seroso humano

Initial análises focada na correlação de contagem de células com grupos de resultados. Em contraste com o trabalho anterior, intraepitelial CD3

+ células T não foram observados em níveis significativamente diferentes em pacientes com bom resultado (mediana 154 células (soma de 20 campos), IQR 89-297) em comparação com pacientes com mau resultado (mediana 179, 73-333 IQR, Quadro 2). Da mesma forma, as quantidades de infiltração de CD4

+ (370, 249-461 IQR no bom grupo vs. 377, IQR 264-524 no grupo de pobres) e CD8

+ células T (115, IQR 53-180 no bom grupo vs. 48, IQR 17-180 no grupo de pobres) não foram significativamente diferentes entre os bons e maus grupos de resultados.

bom resultado (n = 31)

mau resultado (n = 21)

Median

IQR

Median

IQR

P- valor

celular Counts

1CD3

+15489-29717973-3330.881CD4

+370249-461377264-5240.514CD8

+11553-1804817-1800.271CD4

+CD25

+FOXP3

+10155-16110992-1460.444CD4

+CD25

+FOXP3

-14890-187147105-2310.251Ratios

2CD8

+/CD3

+0.580.34-0.910.430.20-0.700.198CD4

+/CD3

+2.061.33-3.431.731.32-3.670.985CD8

+/CD4

+0.270.20-0.440.130.07-0.370.050CD3

+/CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ 1.720.95-2.681.380.79-2.490.695CD3

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

-1.310.71- 2.061.240.72-1.640.490CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ 0.980.49-1.790.320.25-1.020.027CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

-0.650.43-1.190.460.13-0.770.048CD4

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ 2.912.59-4.313.042.39-3.460.332CD4

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

-2.501.94-3.192.161.80-2.640.351Table 2. As comparações dos níveis de células T ou rácios.

1Sum de celular contagens de todos os 20 campos,

2Ratio da soma de todos os 20 campos; IQR, intervalo interquartil; estatisticamente mudanças significativas são exibidas em negrito. CSV Baixar CSV

Usando os marcadores CD25 e FOXP3, CD4

+ células T podem ser divididos em quatro grupos. Os dois grupos principais foram CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs (~ 33,2% entre todos os pacientes) e CD4

+ CD25

+ FOXP3

– as células T (~ 43,1 %). Os dois outros grupos menores foram o CD4

+ CD25

-FOXP3

células + T (~ 14,4%) e CD4

+ CD25

-FOXP3

– as células T (~ 9,3 %). Nós vimos nenhuma diferença nos níveis de CD4

+ CD25

+ FOXP3

– células T entre os grupos de resultado para o paciente. Os níveis medianos foram 148 células (IQR 90-187) no grupo bom resultado e 147 (IQR 105-231) no grupo mau resultado (Tabela 2). Da mesma forma, as contagens médias de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs entre os pacientes com bom resultado não foi diferente em comparação com os pacientes com pior prognóstico. Todas as amostras de tumor mostrou CD4

+ CD25

+ FOXP3

infiltração + Treg com uma gama combinado de 14-350 células. A percentagem de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs entre o total de intraepitelial CD4

+ células infiltrantes foi de 31 ± 10% no grupo bom resultado em comparação com 34 ± 11% no mau resultado grupo de pacientes (p = 0,319).

Uma observação notável a partir dessas comparações é que o CD4

contagem de células + T foram maiores do que o CD3

+ conta quando a equivalência era esperado. (Figuras 2A). Uma razão potencial para a falta de correlação pode ser que os anticorpos CD4 e CD8 são coloração de uma mistura, tanto de células mielóides e linfóides, uma vez que foi anteriormente relatado que ambos os marcadores podem ser expressos em diversos subconjuntos de leucócitos incluindo linfóide e mielóide. Alternativamente, CD3 pode ser sub-regulada em células T devido a estimulação crónica no microambiente tumoral [26,27]. Considerando essas questões, nós purificado tumor infiltrando células mononucleares de três pacientes com câncer de ovário, manchado-los com vários dos marcadores linfóides e mielóides e análise de citometria de fluxo realizada. A coloração revelou que 26 ± 3% (n = 3, SEM) e 34 ± 4% de células T CD4

+ e CD8

+ células, respectivamente, são negativas CD3 (Figuras 2B-C). A análise de CD11c

+, BDCA2

+, e CD68

+ células sugere que mielóide DC, DC plasmocit�des e macrófagos em conjunto, constituem menos do que um total de 5% de cada um dos CD4

+ e CD8

+ células em tumores de ovário (Figuras 2D-G).

gráficos (AB) de barras que mostra a média (± SEM,

n

= 3) níveis de CD3-CD4

+ ou CD8

+, respectivamente, como uma percentagem do total de CD4

+ ou CD8

+ células T, respectivamente. (C) mostrado são 4 parcelas dupla dot cor representativa de coloração tanto CD4 ou células fechado-CD8. As especificidades dos anticorpos são observados com o eixo. (D) apresentados são a média (± SEM,

n

= 3) níveis de CD11c

+, BDCA2

+ e CD68

+ células como CD4 total de

+ ou CD8

+ células (eixo X).

rácios de células T correlacionam-se com os resultados clínicos no cancro do ovário seroso humano

Vendo há associações entre as contagens absolutas de CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs e evolução clínica, nós nos concentramos em relações como havia sido previamente descrito [8,28]. A mediana CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ rácio Treg foi significativamente maior em pacientes com bom resultado em comparação com os pacientes com mau resultado (0,98 vs 0,32, p = 0,027 , Tabela 2, Figura 3A). Em contraste, a mediana CD3

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg e CD4

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg relações não foram significativamente diferentes entre os grupos. Depois de muitos exames, inesperadamente, também detectou que os bons pacientes desfecho teve uma mediana CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

– relação que foi significativamente maior no grupo de bom (0,65) como em comparação com o grupo pobre (0,46, p = 0,048) (Tabela 2, Figura 3B). Quando o CD8

+ /CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg e CD4

+ CD25

+ FOXP3

– rácios foram considerados em conjunto (ou seja, todos CD4

+ CD25

+) e como mostrado na Figura 3C, as razões entre os dois grupos permaneceu significativamente diferente. Como idade foi encontrado para ser ligeiramente diferente entre os dois grupos, verificou-se que a associação entre o estado de contagem de células e grupo permaneceu consistente após ajuste para idade em um modelo de regressão logística (dados não mostrados).

(A) Gráfico de pizza mostrando a distribuição de CD4

células + T com relação a CD25 e coloração FOXP3 em todos os pacientes. (BD) Dispersão gráficos de pontos dos rácios de CD8

+ T contagens de células para Tregs (CD4

+ CD25

+ FOXP3

+) (B), CD4

+ CD25

+ FOXP3

– as células T (C), ou combinados CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ e CD4

+ CD25

+ FOXP3

– as células T (D) tanto para o bom resultado e grupos de resultados pobres.

ao comparar os rácios calculados a partir dos três manchas principais (CD3, CD4, e CD8), apenas a mediana CD8

+ /CD4

+ proporções de células T, que foram de 0,27 e 0,13 respectivamente para os bons e maus grupos de resultados, foram estatisticamente significativamente diferente (P = 0,050), o que é consistente com as proporções significativas da CD8

+ células T, quer ao CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs ou CD4

+ CD25

+ FOXP3

– descrito acima. Não há outras relações (por exemplo CD8

+ /CD3

+ células T e CD4

+ /CD3

rácios de células + T) diferiu significativamente entre os bons e maus grupos de resultados (Tabela 2).

Por fim, visto que tanto FOXP3

+ e FOXP3

– CD4

+ células T foram associados com o resultado quando examinado como uma relação com células CD8 +

T, nós especulamos que estas células eram capazes de produzir Tregs o regulador imunitário de citoquina, TGF-β. Para testar isso, nós purificado leucócitos infiltrantes de tumor (TIL) e estimulada, em seguida, diretamente

ex vivo

com ConA, seguido por coloração intracelular de citocinas. + células T como mostrado na Figura 4A, TIL derivados CD4

+ CD25

eram uma mistura de FOXP3

+ e FOXP3

– células T. Na ausência de estimulação, uma fracção (12 ± 4%, n = 3, ± SEM) das células T purificadas mantida expressão de FOXP3. Após a estimulação, a percentagem de CD4

células CD25 +

+ T expressando FOXP3 aumentou para 42 ± 9% do total CD4

+ CD25

+ células T. Na ausência de estimulação, 5 ± 3% de células T CD4

+ CD25

+ células T produzidas TGF-β e estimulação seguinte, este aumentou para 34 ± 9% (p = 0,04, Figura 4B).

(A) São mostrados dois pontos parcelas de CD4 infiltrantes de tumor

+ células purificadas T estimuladas com ConA ou mídia sozinho. As células são fechados em CD4 e CD25. (B) Os gráficos de barras que mostram a média (± SEM,

n

= 3 amostras de pacientes originais) porcentagem de FoxP3

+ e as células TGF-β T entre o total de CD4

+ CD25

+ células T estimuladas com ConA ou mídia sozinho. valor P obtido por um teste t de Student pareado.

Discussão

Compreender o papel patológico de Tregs que têm a capacidade para suprimir as células T ativadas no microambiente do câncer de ovário é importante para o desenvolvimento novas terapias de base imunológica e determinar o prognóstico do paciente. No presente estudo, encontramos pela primeira vez que CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Tregs estão associados com resultado especificamente no câncer de ovário seroso mas apenas no contexto de células CD8 +

T . O facto de que a influência de Tregs só é detectável quando avaliada como uma relação com citotóxico CD8

+ células T é consistente com o modelo de que as respostas imunitárias específicas do tumor potencialmente destrutivos são contrabalançadas no microambiente tumoral por supressão imunitária forte [29] . Isto poderia sugerir que as estratégias destinadas a depleção de Tregs e estimulação concomitante da vacina de células T efectoras seria eficaz na eliminação de cancros do ovário e melhoria da sobrevivência [30]. Vários medicamentos que são conhecidos como sendo úteis como agentes, tais como a ciclofosfamida, o anticorpo anti-CD25, ou diftitox denileucina Treg de empobrecimento estão disponíveis para a terapia de combinação com nova vacina ou abordagens de terapia com células T adoptivas [31,32]. Alternativamente, Quezada e colaboradores mostram que o anti-bloqueio CTLA-4 do ponto de verificação em combinação com a terapia de vacina também pode ser eficaz em alterar o equilíbrio sem eliminar Tregs, sugerindo uma utilização potencial para a CTLA-4 de anticorpo anti-humano recentemente aprovado em cancro do ovário [ ,,,0],33,34].

O

ex vivo

experiências mostraram que uma percentagem baixa de CD4 não estimulada

+ CD25

+ T células mantida expressão FOXP3, que mais tarde aumentou em cima ativação. Esta frequência mais baixa do Foxp3 de

+ células T, em relação aos resultados da coloração por imunofluorescência, pode reflectir a regulação por diminuição dos FOXP3, consistente com observações de que a expressão FOXP3 humano é regulada por activação de células T e não desenvolvente programado como é em Tregs murino [ ,,,0],35]. Consequentemente, a expressão de FOXP3 em células T após a activação levou a alguma controvérsia sobre se FOXP3 é um marcador específico-Treg em seres humanos. De fato, alguns estudos têm mostrado que FOXP3 expressão é induzida em células T ativadas sem atividades reguladoras, o que poderia levar alguém a especular que alguns dos CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ T células de cancro do ovário podem não ser regulamentares. Em contraste, outros estudos demonstraram que as células T activadas que se regulam-FOXP3, de facto, actividade supressora transmitir numa célula de contacto ou de modo dependente da citoquina (i.e., IL-10 e TGF-β) [36,37].